Name: transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Tilskudssponsorer: Denne undersøgelse blev støttet af JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), Mitsubishi Science Foundation (SK), Takeda Science Foundation (SK) og et Frontier Brain Science Grant fra University of Yamanashi (SK).

Alle dyr, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev opnået, ophuset, plejet og anvendt i overensstemmelse med "Vejledende principper i pleje og brug af dyr inden for fysiologiske videnskaber" udgivet af Physiologic Society of Japan20 og med den forudgående godkendelse af Animal Care Committee ved University of Yamanashi (Yamanashi, Japan).
1. Fremstilling af cellemedium, transplantationsmedium og anæstesiblanding
<ol><li>Forbered cellemediet ved at tilsætte 10% føtalt kvægserum og 0,1% penicillin/streptomycin i DMEM.</li>
	<li>Transplantationsmediet forberedes ved at tilsætte hCSF1 (250 ng/ml) og hTGF-β1 (100 ng/ml) til cellemediet.</li>
	<li>Forbered anæstesiblandingen til intraperitoneal injektion ved at blande 0,45 ml medetomidinhydrochlorid, 1,2 ml midazolam og 1,5 ml butorphanoltartrat i 11,8 ml normalt saltvand.</li>
</ol>2. Fremstilling af iPSMG
BEMÆRK: Frosset iPSMG (Table of Materials) blev opbevaret ved -80 °C indtil brug.
<ol><li>Tø de frosne celler hurtigt op i et vandbad på 37 °C. Hvirvl prøverne, indtil al synlig is er smeltet.</li>
	<li>Tilsæt den optøede iPSMG til kulturmediet opvarmet til 37 °C. Der tilsættes 1 ml optøede celler indeholdende medium (1 × 106 celler) til 10 ml af kulturmediet.</li>
	<li>Centrifugering af cellerne ved 300 x g i 5 minutter for at opnå en cellepille.</li>
	<li>Efter centrifugering skal du fjerne alt supernatant uden at forstyrre cellepillen. Fuldstændig fjernelse af supernatant er ønskeligt for at reducere fortyndingen af cytokinkoncentrationen i transplantationsmediet.</li>
	<li>Transplantationsmediet tilsættes for at opnå en cellekoncentration på 1 x 105 celler/μL.</li>
	<li>Placer iPSMG på is og fortsæt straks til transplantation. BEMÆRK: Forberedelse af iPSMG til transplantation udføres på en ren bænk for at undgå forurening.</li>
</ol>3. Forberedelse af mus til transnasal transplantation (Tsn)
<ol><li>Foder de vilde hanmus (C57BL/6J, 8 uger gamle) med PLX5622 indeholdende kost i 7 dage.</li>
	<li>I slutningen af den 7. dag skal du ophøre med PLX-diæten og fodre musene med en normal diæt indtil afslutningen af undersøgelsen. BEMÆRK: PLX5622 indeholdende diæt fremstilles ved tilsætning af 1,2 g PLX5622 i 1 kg AIN-93G (materialetabel).</li>
</ol>4. Transnasal transplantation af celler
<ol><li>24 timer efter ophør af PLX-fodring vejes musene og bedøves ved hjælp af en intraperitoneal injektion af anæstesiblandingen (0,2 ml/20 g).</li>
	<li>Når musene er fuldstændigt bedømte som vurderet ved manglende reaktion på pedalabstinensrefleks (fast tåklemme), skal du administrere 2,5 μL hyaluronidase i PBS (100 U / ml) ved 1 time før Tsn iPSMG til hvert næsebor to gange ved hjælp af en 10 μL pipettespids for at øge permeabiliteten af næseslimhinden.</li>
	<li>Efter påføring af hyaluronidase skal musene placeres i liggende stilling.</li>
	<li>Gentag trin 4.2 10 minutter før transnasal transplantation af iPSMG.</li>
	<li>Påfør 2,5 μL cellesuspension i musens ene næsebor ved hjælp af en 10 μL pipettespids.</li>
	<li>Placer musen i liggende stilling i 5 minutter før administration af cellesuspension til det andet næsebor.</li>
	<li>Gentag trin 4,5 og 4,6 fire gange, og anvend et samlet volumen på 20 μL pr. Dyr.</li>
	<li>Placer musen i liggende stilling på en 37 ° C varmepude, indtil den er genoprettet fra anæstesi.</li>
	<li>Ved 48 timer efter ophør af PLX-fodring gentages trin 4,1-4,7 på de samme mus igen. BEMÆRK: Det skal bemærkes, at iPSMG placeres på is under transplantationen.</li>
</ol>5. Anvendelse af cytokiner
<ol><li>Bedøve musene ved en intraperitoneal injektion af anæstesiblanding (0,2 ml/20 g).</li>
	<li>Påfør 2,5 μL af transplantationsmediet i musens ene næsebor ved hjælp af en 10 μL pipettespids.</li>
	<li>Placer musen i liggende stilling i 5 minutter, før transplantationsmediet administreres til det andet næsebor.</li>
	<li>Gentag trin 5,2 og 5,3 fire gange, og anvend et samlet volumen på 20 μL pr. Dyr. BEMÆRK: Det skal bemærkes, at transnasal administration af transplantationsmedium (humane cytokiner) er påkrævet hver 12. time for levedygtigheden af transplanteret iPSMG indtil undersøgelsens afslutning.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Hasselmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+chimeric+model+to+study+and+manipulate+human+microglia+in+vivo.">Development of a chimeric model to study and manipulate human microglia in vivo.</a> Neuron. 103 (6), 1016-1033 (2019).</li><li>Mancuso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-derived+human+microglia+transplanted+in+mouse+brain+to+study+human+disease.">Stem-cell-derived human microglia transplanted in mouse brain to study human disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2111-2116 (2019).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells.">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li><li>Schetters, S. T. T., Gomez-Nicola, D., Garcia-Vallejo, J. J., Van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+Microglia+and+T+cells+get+ready+to+tango.">Neuroinflammation: Microglia and T cells get ready to tango.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1905 (2017).</li><li>Sulzer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+from+patients+with+Parkinson's+disease+recognize+alpha-synuclein+peptides.">T cells from patients with Parkinson's disease recognize alpha-synuclein peptides.</a> Nature. 546 (7660), 656-661 (2017).</li><li>Togo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+T+cells+in+the+brain+of+Alzheimer's+disease+and+other+neurological+diseases.">Occurrence of T cells in the brain of Alzheimer's disease and other neurological diseases.</a> Journal of Neuroimmunology. 124 (1), 83-92 (2002).</li><li>Parajuli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia+to+the+brain+of+immunocompetent+mice.">Transnasal transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia to the brain of immunocompetent mice.</a> Glia. 69 (10), 2332-2348 (2021).</li><li>Elmore, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-stimulating+factor+1+receptor+signaling+is+necessary+for+microglia+viability,+unmasking+a+microglia+progenitor+cell+in+the+adult+brain.">Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain.</a> Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).</li><li>Zasshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+principles+for+the+care+and+use+of+animals+in+the+field+of+physiological+sciences.">Guiding principles for the care and use of animals in the field of physiological sciences.</a> Journal of the Physiologic Society of Japan. 64 (7-8), 143-146 (2002).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+requirements+for+microglial+survival,+specification,+and+function+revealed+by+defined-medium+cultures.">Diverse requirements for microglial survival, specification, and function revealed by defined-medium cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+unique+TGF-beta-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia.">Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nature Neuroscience. 17 (1), 131-143 (2014).</li><li>Regateiro, F. S., Howie, D., Cobbold, S. P., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+in+transplantation+tolerance.">TGF-beta in transplantation tolerance.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 660-669 (2011).</li><li>Yoshimura, A., Muto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+function+in+immune+suppression.">TGF-beta function in immune suppression.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 350, 127-147 (2011).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Protokollen her beskriver den ikke-invasive transplantation af iPSMG i musehjernen. Det unikke ved den nuværende protokol er, at ved at kombinere farmakologiske PLX ON/OFF-metoder og intranasal transplantation kan iPSMG ikke-invasivt transplanteres ind i den immunkompetente musehjerne. Transplanteret iPSMG dannede størstedelen af microglia i hippocampus og cerebellum ved at besætte den ledige niche i op til 60 dage, men ikke i cortex.
De kritiske punkter for den effektive Tsn af iPSMG er (i) udtømningseffektiviteten af endogen musemikroglia (ii) administration af humane cytokiner hver 12. time. Microglia opretholder deres eget territorium i hjernen. Effektiv udtømning af musemikroglia er nødvendig for at tilvejebringe en niche til indkapslelse af transplanteret iPSMG. Når udtømning af endogen musemikroglia er utilstrækkelig, observeres kolonisering af musens hippocampus og cerebellum af iPSMG ikke. Mikroglias levedygtighed afhænger af CSF1R og TGFBR, der signalerer 19,21,22. hCSF1 rapporteres selektivt at øge levedygtigheden af human microglia, og hTGF-β1 er nødvendig for mikroglias levedygtighed samt dæmper inflammation, når den administreres hver 12. time 21,23,24. I mangel af eksogene humane cytokiner observeres iPSMG ikke i musehjernen. Endvidere skal man være opmærksom på ikke mekanisk at aktivere iPSMG ved overdreven pipettering eller på anden måde før Tsn, da det uigenkaldeligt ændrer iPSMG-egenskaber såvel som transplantationseffektivitet. Hvis den tilfredsstillende Tsn af iPSMG ikke ses, skal iPSMG's levedygtighed før transplantation samt udtømning af endogen mikroglia bestemmes. Hvis udtømningen af endogen musemikroglia ikke er på over 90 %, kan PLX5622-fodringstiden ændres for at øge udtømningen.
Sammenlignet med en konventionel kirurgisk transplantationsmetode, der er invasiv og kræver ekstra udstyr og træning, tillader Tsn transplantation på en ikke-invasiv, enkel, stabil og nem måde. Desuden tillader denne metode transplantation af iPSMG i immunkompetente musehjerner; således kan immunkompetente sygdomsmodelmus bruges til at studere responsen fra iPSMG.
Den største ulempe ved den nuværende metode er den regionale heterogenitet i engraftmentet af iPSMG. Hvis den hjerneområdespecifikke iPSMG-transplantation er påkrævet, er den nuværende protokol ikke egnet, da den transplanterede iPSMG kun forbliver indpodet i 60 dage i hippocampus og cerebellum, men ikke i cortex. Endvidere er behovet for at administrere eksogene humane cytokiner intranasalt hver 12. time også en begrænsning af den nuværende protokol, da den kræver omfattende arbejdskraft og er dyr.
Afslutningsvis tilvejebringes en detaljeret protokol for Tsn af iPSMG i hjernen hos immunkompetente mus. Når det kombineres med farmakologisk ON/OFF af musemikroglia af PLX5622, tillader denne protokol en vellykket engraftment af iPSMG. Da transplanterede celler kan observeres i hippocampus og cerebellum i en vedvarende periode, når eksogene cytokiner anvendes, kan den nuværende metode være værdifuld til evaluering af den menneskelige mikroglias rolle i både fysiologiske og patologiske tilstande i disse regioner.

Microglia er en specialiseret population af makrofaglignende celler i centralnervesystemet (CNS) og spiller væsentlige roller i at kontrollere forskellige hjernefunktioner som neural kredsløbsudvikling, modulering af neurotransmission og opretholdelse af hjernens homeostase 1,2,3. Selvom murine microglia deler mange funktioner med dem fra mennesker, viser de artsspecifikke forskelle. Således kan reaktionen fra musemikroglia på forskellige stimuli ikke altid repræsentere den for human microglia 4,5,6. Selvom mange undersøgelser har analyseret human microglia, er disse eksperimenter begrænset til in vitro-undersøgelser. In vitro-dyrkede humane mikroglia viser morfologiske træk og genekspression, der er meget forskellige fra dem in vivo. In vitro-eksperimenter kan således ikke altid kapitulere in vivo-egenskaberne ved human microglia. Derfor er der behov for et eksperimentelt system til undersøgelse af human microglia in vivo.
For nylig, for at studere in vivo-egenskaberne ved human microglia, transplanteres in vitro-genererede inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) - eller embryonale stamceller - afledte humane mikroglia kirurgisk i musehjernen 7,8,9,10,11,12,13,14. Ved hjælp af denne tilgang er forskellige in vivo-træk ved human microglia blevet karakteriseret. Den udbredte anvendelse af denne metode er imidlertid begrænset af to grunde. For det første er kravet om immunmangelfulde mus. For at studere den menneskelige mikroglias rolle i forskellige neurodegenerative sygdomme skal sygdomsmutationsbærende mus således krydses til immunmangelfulde mus, hvilket kræver betydelig tid og kræfter. Desuden kan perifere immunceller, som T-celler, i forskellige neurologiske lidelser modulere mikrogliale funktioner 15,16,17. Derfor repræsenterer eksperimenter udført på immunmangelfulde mus muligvis ikke bona fide egenskaber ved human microglia in vivo. For det andet kræver invasive operationer til transplantation af mikroglia yderligere udstyr og træning. Endvidere kan hjerneskade under invasiv transplantation ændre mikrogliafænotyper.
I denne protokol beskrives ikke-invasiv transnasal transplantation (Tsn) af iPSMG i immunkompetente vildtypemus18. Ved at kombinere farmakologisk ON/OFF af en CSF1R-antagonist PLX5622, som udtømmer endogen musemikroglia19 og Tsn, kan iPSMG ikke-invasivt transplanteres i musehjernen. Ved anvendelse af eksogent humant cytokin forbliver det transplanterede iPSMG desuden levedygtigt i 60 dage på en regionsspecifik måde uden immunsuppressive midler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN 93G</td>
			<td>Oriental Yeast Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 antibody</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>019&#8211;19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-STEM121 antibody</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>Y40410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>8019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen iPSMG</td>
			<td>Shionogi &#38; Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory for Drug Discovery and Disease Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>VETLI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Astellas</td>
			<td>18005A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30076028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLX5622</td>
			<td>Amadis Chemical</td>
			<td>A930097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming growth factor-&#946;1 (Tgf-b1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400-10</td>
			<td>antifade mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route

Microglia er den specialiserede population af makrofaglignende celler i hjernen. De spiller væsentlige roller i både fysiologiske og patologiske hjernefunktioner. Det meste af vores nuværende forståelse af microglia er baseret på eksperimenter udført i musen. Human microglia adskiller sig fra musemikroglia, og derfor kan respons og egenskaber ved musemikroglia ikke altid repræsentere den for human microglia. På grund af etiske og tekniske vanskeligheder er forskning i human microglia desuden begrænset til in vitro-dyrkningssystem , som ikke kapitulerer in vivo-karakteristika ved microglia. For at overvinde disse problemer udvikles en forenklet metode til ikke-invasivt transplantation af induceret pluripotent stamcelleafledt human microglia (iPSMG) i den immunkompetente musehjerne via en transnasal vej i kombination med farmakologisk udtømning af endogen mikroglia ved hjælp af en kolonistimulerende faktor 1-receptor (CSF1R) antagonist. Denne protokol giver mulighed for ikke-invasivt at transplantere celler ind i musehjernen og kan derfor være værdifuld til evaluering af den in vivo-rolle , som human microglia spiller i fysiologiske og patologiske hjernefunktioner.

Denne teknik gør det muligt for efterforskeren at ikke-invasivt transplantere iPSMG i hippocampus og cerebellum, men ikke ind i cortex i musehjernen. Efter afslutningen af undersøgelsen blev bedømrede mus udsat for transkardial perfusion af iskold PBS (-), efterfulgt af iskold 4% (w/ v) paraformaldehyd i PBS. Hjernerne blev isoleret, postfixeret natten over i 4% (w/v) paraformaldehyd og kryobeskyttet i en PBS indeholdende 30% (w/v) saccharose. Endvidere blev hjernerne frosset i en indlejringsforbindelse og sektioneret (20 μm tykke koronale sektioner) på en kryostat. Sektionerne blev vasket tre gange i PBS(−) (10 min hver) og permeabiliseret og blokeret med 0,5% (v/v) Triton X-100 i 10% normalt gedeserum i 1 time. Sektionerne blev derefter inkuberet med anti-human-specifik cytoplasmamarkør, STEM121 (1:100) og anti Iba1 (1:1000) i 5 dage. Derefter blev sektionerne vasket tre gange med PBS (-) i 10 minutter hver og blev inkuberet med sekundære antistoffer: Alexa Fluor 488-, eller 546-konjugeret mus eller kanin IgG'er (1: 1000) i 2 timer ved stuetemperatur. Efter vask med PBS(-) tre gange blev sektioner monteret på dias ved hjælp af et antifademonteringsmedium. Et konfokalmikroskop udstyret med en 40x objektivlinse blev brugt til at erhverve fluorescensbilleder. Levedygtigheden af iPSMG 2 måneder efter transplantation i hippocampus og cortex er vist i figur 1. Antallet af transplanterede celler kan bestemmes ved at tælle celler, der er positive for både humanspecifikke antistoffer og panmikrogliale/monocytmarkører, mens endogene musemikroglia kun er positive for panmikroglial/monocytmarkør som tidligere beskrevet18. De transplanterede iPSMG'er erstatter musemikroglia, viser forgrenede morfologier i hippocampus og påvises ikke i cortex18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg"> Figur 1: Levedygtighed af iPSMG i cortex og hippocampus 2 måneder efter Tsn. Det venstre panel viser immunstaining med en pan-mikroglial/ monocytmarkør, Iba1 (grøn). Det midterste panel viser immunfædning med humanspecifik cytoplasmamarkør STEM121 (rød). Det højre panel viser et flettet billede af Iba1 og STEM121 immunstaining. (A) I kontrolmus blev kun musemikroglia (Iba1+/STEM121-) påvist i både cortex og hippocampus. (B) I iPSMG-transplanterede mus blev der i cortex kun påvist musemikroglia (Iba1+/STEM121-), mens der i hippocampus iPSMG (Iba1+/STEM121+) blev påvist. Pilene på billedet viser musens mikroglia, mens pilespidserne viser iPSMG. Et konfokalmikroskop udstyret med en 40x objektivlinse blev brugt til fluorescensbilledindsamling. Maksimal billedstørrelse: 1024 x 1024 pixels. Zoomfaktor: 2. Skalabjælker = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Protokollen, der præsenteres her, tillader transplantation af induceret pluripotent stamcelleafledt human microglia (iPSMG) i hjernen via en transnasal vej i immunkompetente mus. Fremgangsmåden til fremstilling og transnasal transplantation af celler og administration af cytokinblanding til opretholdelse af iPSMG er vist.

Transplantation af humant induceret pluripotent stamcelleafledt mikroglia i immunkompetente mushjerne via ikke-invasiv transnasal vej

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Denne protokol tillader en ikke-invasiv transplantation af iPSMG i immunkompetent musehjerne ved at kombinere farmakologisk on/off af en CSF1-receptorantagonist PLX5622 med transnasal transplantation. Den største fordel ved denne teknik er, at iPSMG kan transplanteres uden at fremkalde hjerneskade selv hos immunkompetente mus. Mikroglial transplantation kan tjene som en potentiel terapi til at udveksle dysfunktionel mikroglia med funktionelle i forskellige neurodegenerative sygdomme i fremtiden.Bijay Parajuli, en forsker fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Begynd med hurtigt at optø de frosne inducerede pluripotente stamcelleafledte humane mikrogliaceller i et 37 grader Celsius vandbad. Hvirvl prøverne, indtil al synlig is er smeltet.Tilsæt den optøede iPSMG til kulturmedierne, opvarmet til 37 grader Celsius. Tilsæt en milliliter celler til 10 ml kulturmedier. Centrifugering af cellerne ved 300 gange g i fem minutter for at opnå en cellepille.Fjern supernatanten uden at forstyrre cellepillen. Tilsæt transplantationsmediet for at opnå en cellekoncentration på 10 til de femte celler pr. Mikroliter. Placer iPSMG på is, og fortsæt straks til transplantation.For at forberede mus til transnasal transplantation skal du fodre hanmusene med en diæt, der indeholder PLX i syv dage. I slutningen af den syvende dag skal du ophøre med PLX-diæten og fodre musene med en normal kost. En time før transnasal transplantation af iPSMG skal du administrere 2,5 mikroliter hyaluronidase i PBS til hvert næsebor to gange ved hjælp af en 10-mikroliter pipettespids for at øge permeabiliteten til næseslimhinden.Placer musene i liggende stilling efter hyaluronidasepåføringen. Administrer 2,5 mikroliter hyaluronidase ti minutter før transnasal transplantation af iPSMG. Påfør 2,5 mikroliter cellesuspension i musens ene næsebor ved hjælp af en pipettespids på 10 mikroliter.Placer musen i liggende stilling i fem minutter før administration af cellesuspension til det andet næsebor. Administrer cellesuspensionen fire gange ved anvendelse af et samlet volumen på 20 mikroliter pr. Dyr. 48 timer efter ophør af PLX-fodring gentages administrationen af hyaluronidase og cellesuspension på de samme mus.Til administration af cytokiner påføres 2,5 mikroliter af transplantationsmediet i et næsebor af musen ved hjælp af en 10 mikroliter pipettespids. Efter to måneders transnasal transplantation kan antallet af transplanterede celler bestemmes ved at tælle celler, der er positive for både humanspecifikke og panmikrogliale markører. Endogen musemikroglia er kun positive for pan-mikroglial markør.I kontrolmus blev kun musemikroglia påvist i både cortex og hippocampus. I cortex af iPSMG-transplanterede mus blev der kun påvist musemikroglia, mens der i hippocampus blev påvist iPSMG. Når du forsøger denne protokol, er fuldstændig fjernelse af supernatant afgørende for at forhindre fortynding af cytokiner.Det er afgørende at anvende cytokin hver 12. time for levedygtigheden af transplanterede celler. Udtømning af endogen musemikroglia er nødvendig til transplantation af iPSMG. Denne procedure tillader transplantation af iPSMG i en normal eller syg musehjerne.Således kan karakteristisk for iPSMG såvel som reaktionen på sygdom bestemmes. Denne teknik er egnet til at bestemme in vivo-karakteristikken for iPSMG i musehjernen. Således vil transplantation af iPSMG i sygdomsmodelmus hjælpe os med at forstå responsen og kan bane vejen for et nyt terapeutisk mål.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion i udviklingslandene menneskelige hjerne In Vitro ved hjælp af stamceller afledt Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metode for høj hastighed Stretch skade af menneskelig induceret pluripotente stamceller-afledt neuroner i en 96-brønds Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differentiering Replating af humane pluripotente stamcelle-afledte neuroner for højt indhold screening af Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction, og Co-Kultur Assays for Human Stem Cell-Afledt endotelceller og GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse mitokondriel transport og morfologi i Human Induceret pluripotente stamceller-afledte neuroner i arvelige spastiske paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Opnåelse humane mikroglia fra voksent humant hjernevæv

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Afledning, ekspansion, kryopræservering og karakterisering af hjernemikrobielle endotelceller fra menneskeskabte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinal transplantation af humant embryonalt stamcelleafledt nethindevæv i en kattemodel med store dyr

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Flow cytometrisk analyse af flere mitokondrieparametre i humaninducerede pluripotente stamceller og deres neurale og gliale derivater

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...