Name: transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Subsidiesponsors: Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), de Mitsubishi Science Foundation (SK), de Takeda Science Foundation (SK) en een Frontier Brain Science Grant van de Universiteit van Yamanashi (SK).

Alle dieren die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen, gehuisvest, verzorgd en gebruikt in overeenstemming met de "Guiding Principles in the Care and Use of Animals in the Field of Physiologic Sciences" gepubliceerd door de Physiologic Society of Japan20, en met de voorafgaande goedkeuring van de Animal Care Committee van de Universiteit van Yamanashi (Yamanashi, Japan).
1. Bereiding van celmedium, transplantatiemedium en anesthesiemengsel
<ol><li>Bereid het celmedium voor door 10% foetaal runderserum en 0,1% penicilline/streptomycine toe te voegen aan DMEM.</li>
	<li>Bereid het transplantatiemedium voor door hCSF1 (250 ng/ml) en hTGF-β1 (100 ng/ml) aan het celmedium toe te voegen.</li>
	<li>Bereid het anesthesiemengsel voor intraperitoneale injectie door 0,45 ml medetomidinehydrochloride, 1,2 ml midazolam en 1,5 ml butorphanoltartraat te mengen in 11,8 ml normale zoutoplossing.</li>
</ol>2. Bereiding van iPSMG
OPMERKING: Bevroren iPSMG (Table of Materials) werd tot gebruik bij -80 °C bewaard.
<ol><li>Ontdooi de bevroren cellen snel in een waterbad van 37 °C. Draai de monsters totdat al het zichtbare ijs is gesmolten.</li>
	<li>Voeg de ontdooide iPSMG toe aan het tot 37 °C verwarmde kweekmedium. Voeg 1 ml ontdooide cellen met medium (1 × 106 cellen) toe aan 10 ml van de kweekmedia.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g om een celkorrel te verkrijgen.</li>
	<li>Verwijder na het centrifugeren alle supernatant zonder de celkorrel te verstoren. Volledige verwijdering van supernatant is wenselijk om verdunning van de cytokineconcentratie in het transplantatiemedium te verminderen.</li>
	<li>Voeg het transplantatiemedium toe om een celconcentratie van 1 x 105 cellen/μL te verkrijgen.</li>
	<li>Plaats de iPSMG op ijs en ga onmiddellijk over tot transplantatie. OPMERKING: De voorbereiding van iPSMG voor transplantatie wordt uitgevoerd op een schone bank om besmetting te voorkomen.</li>
</ol>3. Voorbereiding van de muis voor transnasale transplantatie (Tsn)
<ol><li>Voer de wilde mannelijke muizen (C57BL/6J, 8 weken oud) gedurende 7 dagen met PLX5622 met een dieet.</li>
	<li>Aan het einde van de7e dag, stop het PLX-dieet en voed de muizen met een normaal dieet tot het einde van de studie. OPMERKING: PLX5622 bevattende voeding wordt bereid door toevoeging van 1,2 g PLX5622 in 1 kg AIN-93G (Tabel van materialen).</li>
</ol>4. Transnasale transplantatie van cellen
<ol><li>24 uur na het stoppen van PLX-voeding, weeg de muizen en verdoof ze met behulp van een intraperitoneale injectie van het anesthesiemengsel (0,2 ml / 20 g).</li>
	<li>Nadat de muizen volledig zijn verdoofd, zoals beoordeeld door niet-responsiviteit op pedaalontwenningsreflex (stevige teenknijp), dient u tweemaal 2,5 μL hyaluronidase in PBS (100 U / ml) toe vóór Tsn iPSMG aan elk neusgat toe met behulp van een pipetpunt van 10 μL om de permeabiliteit van het neusslijmvlies te verhogen.</li>
	<li>Plaats na het aanbrengen van hyaluronidase de muizen in rugligging.</li>
	<li>Herhaal stap 4.2 10 min voor de transnasale transplantatie van iPSMG.</li>
	<li>Breng 2,5 μL celsuspensie aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 μL.</li>
	<li>Plaats de muis gedurende 5 minuten in rugligging voordat de celsuspensie aan het andere neusgat wordt toegediend.</li>
	<li>Herhaal stap 4.5 en 4.6 vier keer en breng een totaal volume van 20 μL per dier aan.</li>
	<li>Plaats de muis in rugligging op een warmtekussen van 37 °C totdat de anesthesie is hersteld.</li>
	<li>Herhaal na 48 uur na het stoppen van PLX-voeding stap 4.1-4.7 opnieuw op dezelfde muizen. OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat iPSMG tijdens de transplantatie op ijs wordt geplaatst.</li>
</ol>5. Toepassing van cytokines
<ol><li>Verdoof de muizen door een intraperitoneale injectie van het anesthesiemengsel (0,2 ml / 20 g).</li>
	<li>Breng 2,5 μL van het transplantatiemedium aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 μL.</li>
	<li>Plaats de muis gedurende 5 minuten in rugligging voordat u het transplantatiemedium aan het andere neusgat toedient.</li>
	<li>Herhaal stap 5.2 en 5.3 vier keer en breng een totaal volume van 20 μL per dier aan. OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat transnasale toediening van transplantatiemedium (menselijke cytokines) elke 12 uur nodig is voor de levensvatbaarheid van getransplanteerde iPSMG tot het einde van het onderzoek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Hasselmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+chimeric+model+to+study+and+manipulate+human+microglia+in+vivo.">Development of a chimeric model to study and manipulate human microglia in vivo.</a> Neuron. 103 (6), 1016-1033 (2019).</li><li>Mancuso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-derived+human+microglia+transplanted+in+mouse+brain+to+study+human+disease.">Stem-cell-derived human microglia transplanted in mouse brain to study human disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2111-2116 (2019).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells.">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li><li>Schetters, S. T. T., Gomez-Nicola, D., Garcia-Vallejo, J. J., Van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+Microglia+and+T+cells+get+ready+to+tango.">Neuroinflammation: Microglia and T cells get ready to tango.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1905 (2017).</li><li>Sulzer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+from+patients+with+Parkinson's+disease+recognize+alpha-synuclein+peptides.">T cells from patients with Parkinson's disease recognize alpha-synuclein peptides.</a> Nature. 546 (7660), 656-661 (2017).</li><li>Togo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+T+cells+in+the+brain+of+Alzheimer's+disease+and+other+neurological+diseases.">Occurrence of T cells in the brain of Alzheimer's disease and other neurological diseases.</a> Journal of Neuroimmunology. 124 (1), 83-92 (2002).</li><li>Parajuli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia+to+the+brain+of+immunocompetent+mice.">Transnasal transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia to the brain of immunocompetent mice.</a> Glia. 69 (10), 2332-2348 (2021).</li><li>Elmore, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-stimulating+factor+1+receptor+signaling+is+necessary+for+microglia+viability,+unmasking+a+microglia+progenitor+cell+in+the+adult+brain.">Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain.</a> Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).</li><li>Zasshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+principles+for+the+care+and+use+of+animals+in+the+field+of+physiological+sciences.">Guiding principles for the care and use of animals in the field of physiological sciences.</a> Journal of the Physiologic Society of Japan. 64 (7-8), 143-146 (2002).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+requirements+for+microglial+survival,+specification,+and+function+revealed+by+defined-medium+cultures.">Diverse requirements for microglial survival, specification, and function revealed by defined-medium cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+unique+TGF-beta-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia.">Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nature Neuroscience. 17 (1), 131-143 (2014).</li><li>Regateiro, F. S., Howie, D., Cobbold, S. P., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+in+transplantation+tolerance.">TGF-beta in transplantation tolerance.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 660-669 (2011).</li><li>Yoshimura, A., Muto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+function+in+immune+suppression.">TGF-beta function in immune suppression.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 350, 127-147 (2011).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hier beschrijft de niet-invasieve transplantatie van iPSMG in het muizenbrein. Het unieke van het huidige protocol is dat door het combineren van farmacologische PLX ON/OFF-methoden en intranasale transplantatie, iPSMG niet-invasief kan worden getransplanteerd in het immunocompetente muizenbrein. Getransplanteerde iPSMG vormde de meerderheid van microglia in de hippocampus en het cerebellum door de lege nis tot 60 dagen te bezetten, maar niet in de cortex.
De kritische punten voor de efficiënte Tsn van iPSMG zijn (i) depletie-efficiëntie van endogene muismicroglia (ii) de toediening van menselijke cytokines om de 12 uur. Microglia behouden hun eigen territorium in de hersenen. Efficiënte uitputting van muismicroglia is nodig om een niche te bieden voor de engraftment van getransplanteerde iPSMG. Wanneer de uitputting van endogene muismicroglia onvoldoende is, wordt kolonisatie van de hippocampus en het cerebellum van de muis door iPSMG niet waargenomen. De levensvatbaarheid van microglia hangt af van CSF1R en TGFBR signalering 19,21,22. hCSF1 verhoogt naar verluidt selectief de levensvatbaarheid van menselijke microglia, en hTGF-β1 is vereist voor de levensvatbaarheid van microglia en dempt ontstekingen bij toediening om de 12 uur 21,23,24. Bij afwezigheid van exogene menselijke cytokines worden iPSMG niet waargenomen in muizenhersenen. Verder moet ervoor worden gezorgd dat iPSMG niet mechanisch wordt geactiveerd door overmatig pipetteren of op enige andere manier voorafgaand aan Tsn, omdat dit de iPSMG-kenmerken en de transplantatie-efficiëntie onherroepelijk verandert. Als de bevredigende Tsn van iPSMG niet wordt gezien, moet de levensvatbaarheid van iPSMG vóór transplantatie en de uitputting van endogene microglia worden bepaald. Als de uitputting van endogene muismicroglia niet meer dan 90% is, kan de PLX5622-voedingstijd worden aangepast om de uitputting te verhogen.
Vergeleken met een conventionele chirurgische transplantatiemethode die invasief is en extra apparatuur en training vereist, maakt Tsn transplantatie op een niet-invasieve, eenvoudige, stabiele en gemakkelijke manier mogelijk. Bovendien maakt deze methode de transplantatie van iPSMG in immunocompetente muizenhersenen mogelijk; immunocompetente ziektemodelmuizen kunnen dus worden gebruikt om de respons van iPSMG te bestuderen.
Het grootste nadeel van de huidige methode is de regionale heterogeniteit in de engraftment van iPSMG. Als de hersengebiedspecifieke iPSMG-transplantatie vereist is, is het huidige protocol niet geschikt omdat de getransplanteerde iPSMG gedurende 60 dagen alleen in de hippocampus en het cerebellum blijft enten, maar niet in de cortex. Verder is de noodzaak om exogene menselijke cytokines intranasaal elke 12 uur toe te dienen ook een beperking van het huidige protocol, omdat het uitgebreide arbeid vereist en duur is.
Kortom, een gedetailleerd protocol voor Tsn van iPSMG in de hersenen van immunocompetente muizen wordt verstrekt. In combinatie met farmacologische AAN/UIT van muismicroglia door PLX5622 maakt dit protocol een succesvolle engraftatie van iPSMG mogelijk. Aangezien getransplanteerde cellen gedurende een langere periode in de hippocampus en het cerebellum kunnen worden waargenomen wanneer exogene cytokines worden toegepast, kan de huidige methode waardevol zijn voor het evalueren van de rol van menselijke microglia in zowel fysiologische als pathologische toestanden in die regio's.

Microglia zijn een gespecialiseerde populatie van macrofaagachtige cellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een essentiële rol bij het beheersen van verschillende hersenfuncties zoals de ontwikkeling van neurale circuits, het moduleren van neurotransmissie en het handhaven van de homeostase van de hersenen 1,2,3. Hoewel murine microglia veel functies delen met die van mensen, vertonen ze soortspecifieke verschillen. De reactie van muismicroglia op verschillende stimuli vertegenwoordigt dus niet altijd die van menselijke microglia 4,5,6. Hoewel veel studies menselijke microglia hebben geanalyseerd, zijn die experimenten beperkt tot in vitro studies. In vitro gekweekte menselijke microglia vertonen morfologische kenmerken en genexpressie die sterk verschillen van die in vivo. In vitro experimenten capituleren dus niet altijd de in vivo kenmerken van menselijke microglia. Daarom is een experimenteel systeem nodig om menselijke microglia in vivo te bestuderen.
Onlangs, om de in vivo kenmerken van menselijke microglia te bestuderen, worden in vitro gegenereerde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) - of embryonale stamcellen-afgeleide menselijke microglia chirurgisch getransplanteerd in muizenhersenen 7,8,9,10,11,12,13,14. Met behulp van deze benadering zijn verschillende in vivo kenmerken van menselijke microglia gekarakteriseerd. Het wijdverbreide gebruik van deze methode is echter om twee redenen beperkt. De eerste is de vereiste van immuundeficiënte muizen. Dus om de rol van menselijke microglia in verschillende neurodegeneratieve ziekten te bestuderen, moeten ziektemutatiedragende muizen worden gekruist in immuundeficiënte muizen, wat veel tijd en moeite kost. Bovendien kunnen perifere immuuncellen, zoals T-cellen, bij verschillende neurologische aandoeningen microgliale functiesmoduleren 15,16,17. Daarom kunnen experimenten uitgevoerd bij immuundeficiënte muizen geen bonafide kenmerken van menselijke microglia in vivo vertegenwoordigen. Ten tweede vereisen invasieve operaties om microglia te transplanteren extra apparatuur en training. Verder kan hersenletsel tijdens invasieve transplantatie microgliale fenotypen veranderen.
In dit protocol wordt niet-invasieve transnasale transplantatie (Tsn) van iPSMG in immunocompetente wild-type muizen beschreven18. Door de combinatie van farmacologische AAN/UIT van een CSF1R-antagonist PLX5622 die endogene muismicroglia19 en Tsn uitput, kan iPSMG niet-invasief in de muizenhersenen worden getransplanteerd. Verder blijft de getransplanteerde iPSMG met de toepassing van exogene humaan cytokine gedurende 60 dagen levensvatbaar op een regiospecifieke manier zonder immunosuppressiva.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN 93G</td>
			<td>Oriental Yeast Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 antibody</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>019&#8211;19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-STEM121 antibody</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>Y40410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>8019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen iPSMG</td>
			<td>Shionogi &#38; Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory for Drug Discovery and Disease Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>VETLI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Astellas</td>
			<td>18005A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30076028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLX5622</td>
			<td>Amadis Chemical</td>
			<td>A930097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming growth factor-&#946;1 (Tgf-b1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400-10</td>
			<td>antifade mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route

Microglia zijn de gespecialiseerde populatie van macrofaagachtige cellen van de hersenen. Ze spelen een essentiële rol in zowel fysiologische als pathologische hersenfuncties. Het grootste deel van ons huidige begrip van microglia is gebaseerd op experimenten die in de muis zijn uitgevoerd. Menselijke microglia verschillen van muismicroglia, en daarom vertegenwoordigen de respons en kenmerken van muismicroglia niet altijd die van menselijke microglia. Verder is onderzoek op menselijke microglia vanwege ethische en technische problemen beperkt tot een in vitro kweeksysteem, dat geen in vivo kenmerken van microglia capituleert. Om deze problemen op te lossen, wordt een vereenvoudigde methode ontwikkeld om geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide humane microglia (iPSMG) niet-invasief te transplanteren in de immunocompetente muizenhersenen via een transnasale route in combinatie met farmacologische uitputting van endogene microglia met behulp van een koloniestimulerende factor 1-receptor (CSF1R) antagonist. Dit protocol biedt een manier om niet-invasieve cellen in de hersenen van muizen te transplanteren en kan daarom waardevol zijn voor het evalueren van de in vivo rol van menselijke microglia in fysiologische en pathologische hersenfuncties.

Met deze techniek kan de onderzoeker iPSMG niet-invasief transplanteren in de hippocampus en het cerebellum, maar niet in de cortex van de muizenhersenen. Na voltooiing van de studie werden verdoofde muizen onderworpen aan transcardiale perfusie van ijskoude PBS(−), gevolgd door ijskoude 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS. De hersenen werden geïsoleerd, 's nachts gefixeerd in 4% (w / v) paraformaldehyde en gecryoschermd in een PBS met 30% (w / v) sucrose. Verder werden de hersenen ingevroren in een inbeddingsverbinding en gesneden (20 μm dikke coronale secties) op een cryostaat. De secties werden driemaal gewassen in PBS(−) (elk 10 min) en gepermeabiliseerd en geblokkeerd met 0,5% (v/v) Triton X-100 in 10% normaal geitenserum gedurende 1 uur. De secties werden vervolgens geïncubeerd met anti-humaan-specifieke cytoplasmamarker, STEM121 (1:100) en anti-Iba1 (1:1000) gedurende 5 dagen. Vervolgens werden de secties drie keer gewassen met PBS (−) gedurende 10 minuten elk en werden ze geïncubeerd met secundaire antilichamen: Alexa Fluor 488-, of 546-geconjugeerde muis, of konijn IgG's (1:1000) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Na drie keer wassen met PBS(-) werden secties op dia's gemonteerd met behulp van een antifade montagemedium. Een confocale microscoop uitgerust met een 40x objectief lens werd gebruikt voor het verkrijgen van fluorescentiebeelden. De levensvatbaarheid van iPSMG 2 maanden na transplantatie in de hippocampus en de cortex is weergegeven in figuur 1. Het aantal getransplanteerde cellen kan worden bepaald door cellen te tellen die positief zijn voor zowel mensspecifieke antilichamen als pan-microgliale / monocytmarkers, terwijl endogene muismicroglia alleen positief zijn voor pan-microgliale / monocytmarker zoals eerder beschreven18. De getransplanteerde iPSMG's vervangen microglia van muizen, vertonen vertakte morfologieën in de hippocampus en worden niet gedetecteerd in de cortex18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg"> Figuur 1: Levensvatbaarheid van iPSMG in de cortex en de hippocampus 2 maanden na Tsn. Het linkerpaneel toont immunostaining met een pan-microgliale/monocytenmarker, Iba1 (groen). Het middelste paneel toont immunostaining met mensspecifieke cytoplasmamarker STEM121 (rood). Het rechterpaneel toont een samengevoegde afbeelding van Iba1- en STEM121-immunostaining. (A) Bij controlemuizen werden alleen muismicroglia (Iba1+/STEM121-) gedetecteerd in zowel cortex als hippocampus. (B) Bij iPSMG getransplanteerde muizen, in de cortex, werden alleen muismicroglia (Iba1+/STEM121-) gedetecteerd, terwijl in de hippocampus iPSMG (Iba1+/STEM121+) werden gedetecteerd. De pijlen in de afbeelding tonen microglia van muizen, terwijl pijlpunten iPSMG tonen. Een confocale microscoop uitgerust met een 40x objectief lens werd gebruikt voor fluorescentie beeldverwerving. Maximale afbeeldingsgrootte: 1024 x 1024 pixels. Zoomfactor: 2. Schaalbalken = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Het hier gepresenteerde protocol maakt de transplantatie van geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide menselijke microglia (iPSMG) in de hersenen mogelijk via een transnasale route bij immunocompetente muizen. De methode voor de bereiding en transnasale transplantatie van cellen en de toediening van cytokinemengsel voor het onderhoud van iPSMG wordt getoond.

Transplantatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide microglia in immunocompetente muizenhersenen via niet-invasieve transnasale route

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Dit protocol maakt een niet-invasieve transplantatie van iPSMG in immunocompetente muizenhersenen mogelijk door farmacologische aan/uit van een CSF1-receptorantagonist PLX5622 te combineren met transnasale transplantatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat iPSMG kan worden getransplanteerd zonder hersenschade te veroorzaken, zelfs bij immunocompetente muizen. Microgliale transplantatie kan dienen als een potentiële therapie om disfunctionele microglia uit te wisselen met functionele microglia bij verschillende neurodegeneratieve ziekten in de toekomst.De procedure wordt gedemonstreerd door Bijay Parajuli, een onderzoeker uit mijn laboratorium. Begin met het snel ontdooien van de bevroren geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide menselijke microgliacellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Draai de monsters totdat al het zichtbare ijs is gesmolten.Voeg de ontdooide iPSMG toe aan de kweekmedia, opgewarmd tot 37 graden Celsius. Voeg één milliliter cellen toe aan 10 milliliter kweekmedia. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 300 maal g om een celkorrel te verkrijgen.Verwijder het supernatant zonder de celkorrel te verstoren. Voeg het transplantatiemedium toe om een celconcentratie van 10 tot de vijfde cel per microliter te verkrijgen. Plaats de iPSMG op ijs en ga onmiddellijk over tot transplantatie.Om muizen voor te bereiden op transnasale transplantatie, voedt u de mannelijke muizen met een dieet met PLX gedurende zeven dagen. Aan het einde van de zevende dag stopt u met het PLX-dieet en voedt u de muizen met een normaal dieet. Dien een uur voor transnasale transplantatie van iPSMG tweemaal 2,5 microliter hyaluronidase in PBS toe aan elk neusgat met behulp van een pipetpunt van 10 microliter om de permeabiliteit naar het neusslijmvlies te vergroten.Plaats de muizen in rugligging na het aanbrengen van hyaluronidase. Dien 2,5 microliter hyaluronidase toe tien minuten voor de transnasale transplantatie van iPSMG. Breng 2,5 microliter celsuspensie aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 microliter.Plaats de muis gedurende vijf minuten in rugligging voordat de celsuspensie aan het andere neusgat wordt toegediend. Dien de celsuspensie vier keer toe, waarbij een totaal volume van 20 microliter per dier wordt toegepast. Herhaal 48 uur na het stoppen van PLX-voeding de toediening van hyaluronidase en celsuspensie op dezelfde muizen.Breng voor toediening van cytokines 2,5 microliter van het transplantatiemedium aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 microliter. Na twee maanden transnasale transplantatie kan het aantal getransplanteerde cellen worden bepaald door cellen te tellen die positief zijn voor zowel mensspecifieke als pan-microgliale markers. Endogene muismicroglia zijn alleen positief voor pan-microgliale marker.Bij controlemuizen werden alleen muismicroglia gedetecteerd in zowel cortex als hippocampus. In de cortex van iPSMG getransplanteerde muizen werden alleen muismicroglia gedetecteerd, terwijl in de hippocampus iPSMG werden gedetecteerd. Bij het proberen van dit protocol is volledige verwijdering van supernatant essentieel om de verdunning van cytokines te voorkomen.Het is cruciaal om cytokine elke 12 uur toe te passen voor de levensvatbaarheid van getransplanteerde cellen. Uitputting van endogene muismicroglia is vereist voor de transplantatie van iPSMG. Deze procedure maakt de transplantatie van iPSMG in een normaal of ziek muizenbrein mogelijk.Zo kunnen de kenmerken van iPSMG en de respons op ziekte worden bepaald. Deze techniek is geschikt om de in vivo karakteristiek van iPSMG in het muizenbrein te bepalen. Het transplanteren van iPSMG in ziektemodelmuizen zal ons dus helpen de respons te begrijpen en kan de weg vrijmaken voor een nieuw therapeutisch doelwit.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Lage-stress Route leren met behulp van de Lashley III Maze in Muizen

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Methode voor hoge snelheid Stretch letsel van mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige neuronen in een 96-Wells-indeling

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Het verkrijgen van Human Microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinale transplantatie van menselijk embryonaal stamcel-afgeleid retinaal weefsel in een katachtig groot diermodel

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...