Name: transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Fördergeber: Diese Studie wurde unterstützt von JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), der Mitsubishi Science Foundation (SK), der Takeda Science Foundation (SK) und einem Frontier Brain Science Grant der University of Yamanashi (SK).

Alle in dieser Studie verwendeten Tiere wurden in Übereinstimmung mit den von der Physiologic Society of Japan20 veröffentlichten "Guiding Principles in the Care and Use of Animals in the Field of Physiologic Sciences" und mit vorheriger Genehmigung des Animal Care Committee der Universität Yamanashi (Yamanashi, Japan).
1. Herstellung von Zellmedium, Transplantationsmedium und Anästhesiegemisch
<ol><li>Bereiten Sie das Zellmedium vor, indem Sie 10% fetales Rinderserum und 0,1% Penicillin / Streptomycin bei DMEM hinzufügen.</li>
	<li>Bereiten Sie das Transplantationsmedium vor, indem Sie hCSF1 (250 ng/ml) und hTGF-β1 (100 ng/ml) in das Zellmedium geben.</li>
	<li>Bereiten Sie die Anästhesiemischung für die intraperitoneale Injektion vor, indem Sie 0,45 ml Medetomidinhydrochlorid, 1,2 ml Midazolam und 1,5 ml Butorphanoltartrat in 11,8 ml normaler Kochsalzlösung mischen.</li>
</ol>2. Herstellung von iPSMG
HINWEIS: Gefrorene iPSMG (Table of Materials) wurden bis zum Gebrauch bei -80 °C aufbewahrt.
<ol><li>Tauen Sie die gefrorenen Zellen schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Schwenken Sie die Proben, bis alles sichtbare Eis geschmolzen ist.</li>
	<li>Das aufgetaute iPSMG in das auf 37 °C erwärmte Nährmedium geben. Fügen Sie 1 ml aufgetaute Zellen mit Medium (1 × 106 Zellen) zu 10 ml der Kulturmedien hinzu.</li>
	<li>Zentrifen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Zentrifugation alle Überstände, ohne das Zellpellet zu stören. Eine vollständige Entfernung des Überstands ist wünschenswert, um die Verdünnung der Zytokinkonzentration im Transplantationsmedium zu reduzieren.</li>
	<li>Fügen Sie das Transplantationsmedium hinzu, um eine Zellkonzentration von 1 x 105 Zellen/μL zu erhalten.</li>
	<li>Legen Sie das iPSMG auf Eis und fahren Sie sofort mit der Transplantation fort. HINWEIS: Die Vorbereitung von iPSMG für die Transplantation erfolgt auf einer sauberen Bank, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Maus für die transnasale Transplantation (Tsn)
<ol><li>Füttern Sie die männlichen Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J, 8 Wochen alt) 7 Tage lang mit PLX5622, die Nahrung enthalten.</li>
	<li>Beenden Sie am Ende des 7. Tages die PLX-Diät und füttern Sie die Mäuse mit einer normalen Diät bis zum Ende der Studie. HINWEIS: PLX5622 enthaltende Diät wird durch Zugabe von 1,2 g PLX5622 in 1 kg AIN-93G (Tabelle der Materialien) hergestellt.</li>
</ol>4. Transnasale Transplantation von Zellen
<ol><li>24 h nach Beendigung der PLX-Fütterung wiegen Sie die Mäuse und betäuben Sie sie mit einer intraperitonealen Injektion der Anästhesiemischung (0,2 ml/20 g).</li>
	<li>Nachdem die Mäuse vollständig betäubt wurden, wie durch Nichtansprechbarkeit auf den Pedalentzugsreflex (feste Zehenklemme) beurteilt, verabreichen Sie 2,5 μL Hyaluronidase in PBS (100 U / ml) bei 1 h vor Tsn von iPSMG zweimal mit einer 10 μL Pipettenspitze, um die Permeabilität der Nasenschleimhaut zu erhöhen.</li>
	<li>Nach der Anwendung von Hyaluronidase die Mäuse in Rückenlage bringen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.2 10 Minuten vor der transnasalen Transplantation von iPSMG.</li>
	<li>Tragen Sie 2,5 μL Zellsuspension mit einer 10 μL Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auf.</li>
	<li>Legen Sie die Maus für 5 Minuten in Rückenlage, bevor Sie die Zellsuspension in das andere Nasenloch verabreichen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 viermal, wobei ein Gesamtvolumen von 20 μl pro Tier angewendet wird.</li>
	<li>Stellen Sie die Maus in Rückenlage auf ein 37 °C heißes Pad, bis sie sich von der Narkose erholt hat.</li>
	<li>Wiederholen Sie um 48 Uhr nach Beendigung der PLX-Fütterung die Schritte 4.1-4.7 an denselben Mäusen erneut. HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass iPSMG während der Transplantation auf Eis gelegt werden.</li>
</ol>5. Anwendung von Zytokinen
<ol><li>Anästhesien der Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion einer Anästhesiemischung (0,2 ml/20 g).</li>
	<li>2,5 μL des Transplantationsmediums werden mit einer 10 μL Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus aufgetragen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus für 5 Minuten in Rückenlage, bevor Sie das Transplantationsmedium in das andere Nasenloch verabreichen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.2 und 5.3 viermal, wobei ein Gesamtvolumen von 20 μl pro Tier angewendet wird. HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass die transnasale Verabreichung von Transplantationsmedium (humane Zytokine) alle 12 Stunden für die Lebensfähigkeit von transplantiertem iPSMG bis zum Ende der Studie erforderlich ist.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Hasselmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+chimeric+model+to+study+and+manipulate+human+microglia+in+vivo.">Development of a chimeric model to study and manipulate human microglia in vivo.</a> Neuron. 103 (6), 1016-1033 (2019).</li><li>Mancuso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-derived+human+microglia+transplanted+in+mouse+brain+to+study+human+disease.">Stem-cell-derived human microglia transplanted in mouse brain to study human disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2111-2116 (2019).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells.">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li><li>Schetters, S. T. T., Gomez-Nicola, D., Garcia-Vallejo, J. J., Van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+Microglia+and+T+cells+get+ready+to+tango.">Neuroinflammation: Microglia and T cells get ready to tango.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1905 (2017).</li><li>Sulzer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+from+patients+with+Parkinson's+disease+recognize+alpha-synuclein+peptides.">T cells from patients with Parkinson's disease recognize alpha-synuclein peptides.</a> Nature. 546 (7660), 656-661 (2017).</li><li>Togo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+T+cells+in+the+brain+of+Alzheimer's+disease+and+other+neurological+diseases.">Occurrence of T cells in the brain of Alzheimer's disease and other neurological diseases.</a> Journal of Neuroimmunology. 124 (1), 83-92 (2002).</li><li>Parajuli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia+to+the+brain+of+immunocompetent+mice.">Transnasal transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia to the brain of immunocompetent mice.</a> Glia. 69 (10), 2332-2348 (2021).</li><li>Elmore, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-stimulating+factor+1+receptor+signaling+is+necessary+for+microglia+viability,+unmasking+a+microglia+progenitor+cell+in+the+adult+brain.">Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain.</a> Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).</li><li>Zasshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+principles+for+the+care+and+use+of+animals+in+the+field+of+physiological+sciences.">Guiding principles for the care and use of animals in the field of physiological sciences.</a> Journal of the Physiologic Society of Japan. 64 (7-8), 143-146 (2002).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+requirements+for+microglial+survival,+specification,+and+function+revealed+by+defined-medium+cultures.">Diverse requirements for microglial survival, specification, and function revealed by defined-medium cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+unique+TGF-beta-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia.">Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nature Neuroscience. 17 (1), 131-143 (2014).</li><li>Regateiro, F. S., Howie, D., Cobbold, S. P., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+in+transplantation+tolerance.">TGF-beta in transplantation tolerance.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 660-669 (2011).</li><li>Yoshimura, A., Muto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+function+in+immune+suppression.">TGF-beta function in immune suppression.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 350, 127-147 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Protokoll beschreibt hier die nicht-invasive Transplantation von iPSMG in das Gehirn der Maus. Die Einzigartigkeit des aktuellen Protokolls besteht darin, dass iPSMG durch die Kombination pharmakologischer PLX ON / OFF-Methoden und intranasales Transplantation nicht-invasiv in das immunkompetente Mäusegehirn transplantiert werden kann. Transplantierte iPSMG bildeten die Mehrheit der Mikroglia im Hippocampus und Kleinhirn, indem sie die freie Nische für bis zu 60 Tage, aber nicht im Kortex besetzten.
Die kritischen Punkte für das effiziente Tsn von iPSMG sind (i) die Erschöpfungseffizienz endogener Mausmikroglia (ii) die Verabreichung menschlicher Zytokine alle 12 h. Mikroglia pflegen ihr eigenes Territorium im Gehirn. Eine effiziente Erschöpfung der Mausmikroglia ist erforderlich, um eine Nische für die Transplantation von transplantiertem iPSMG zu schaffen. Wenn die Erschöpfung der endogenen Mausmikroglia unzureichend ist, wird keine Besiedlung des Hippocampus und des Kleinhirns der Maus durch iPSMG beobachtet. Die Lebensfähigkeit von Mikroglia hängt von der CSF1R- und TGFBR-Signalgebung 19,21,22 ab. Es wird berichtet, dass hCSF1 selektiv die Lebensfähigkeit menschlicher Mikroglia erhöht, und hTGF-β1 wird für die Lebensfähigkeit von Mikroglia benötigt und dämpft Entzündungen, wenn es alle 12 h21,23,24 verabreicht wird. In Abwesenheit von exogenen menschlichen Zytokinen werden iPSMG im Gehirn der Maus nicht beobachtet. Darüber hinaus muss darauf geachtet werden, dass iPSMG vor Tsn nicht mechanisch durch übermäßiges Pipettieren oder auf andere Weise aktiviert wird, da dies die iPSMG-Eigenschaften sowie die Transplantationseffizienz unwiderruflich verändert. Wenn der zufriedenstellende Tsn von iPSMG nicht gesehen wird, muss die Lebensfähigkeit von iPSMG vor der Transplantation sowie der Abbau endogener Mikroglia bestimmt werden. Wenn die Erschöpfung der endogenen Mausmikroglia nicht mehr als 90% beträgt, kann die Fütterungszeit des PLX5622 geändert werden, um die Erschöpfung zu erhöhen.
Im Vergleich zu einer herkömmlichen chirurgischen Transplantationsmethode, die invasiv ist und zusätzliche Ausrüstung und Schulung erfordert, ermöglicht Tsn die Transplantation auf nicht-invasive, einfache, stabile und einfache Weise. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Transplantation von iPSMG in immunkompetente Mäusegehirne; So können immunokompetente Krankheitsmodellmäuse verwendet werden, um die Reaktion von iPSMG zu untersuchen.
Der größte Nachteil der aktuellen Methode ist die regionale Heterogenität bei der Transplantation von iPSMG. Wenn die hirnregionenspezifische iPSMG-Transplantation erforderlich ist, ist das aktuelle Protokoll nicht geeignet, da das transplantierte iPSMG nur im Hippocampus und im Kleinhirn, aber nicht im Kortex 60 Tage lang verpfropft bleibt. Darüber hinaus ist die Notwendigkeit, exogene menschliche Zytokine alle 12 h intranasal zu verabreichen, auch eine Einschränkung des derzeitigen Protokolls, da es umfangreiche Arbeit erfordert und teuer ist.
Zusammenfassend wird ein detailliertes Protokoll für Tsn von iPSMG in die Gehirne immunkompetenter Mäuse bereitgestellt. In Kombination mit pharmakologischen ON/OFF von Mausmikroglia durch PLX5622 ermöglicht dieses Protokoll eine erfolgreiche Transplantation von iPSMG. Da transplantierte Zellen im Hippocampus und Kleinhirn über einen längeren Zeitraum beobachtet werden können, wenn exogene Zytokine angewendet werden, kann die derzeitige Methode für die Bewertung der Rolle menschlicher Mikroglia sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Zuständen in diesen Regionen wertvoll sein.

Mikroglia sind eine spezialisierte Population von makrophagenähnlichen Zellen im zentralen Nervensystem (ZNS) und spielen eine wesentliche Rolle bei der Steuerung verschiedener Gehirnfunktionen wie der Entwicklung neuronaler Schaltkreise, der Modulation der Neurotransmission und der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns 1,2,3. Obwohl murine Mikroglia viele Funktionen mit denen des Menschen teilen, zeigen sie artspezifische Unterschiede. Daher entspricht die Reaktion von Mausmikroglia auf verschiedene Reize möglicherweise nicht immer der menschlichen Mikroglia 4,5,6. Obwohl viele Studien menschliche Mikroglia analysiert haben, beschränken sich diese Experimente auf In-vitro-Studien. In vitro kultivierte menschliche Mikroglia zeigen morphologische Merkmale und Genexpression, die sich stark von denen in vivo unterscheiden. Daher kapitulieren In-vitro-Experimente möglicherweise nicht immer die In-vivo-Eigenschaften menschlicher Mikroglia. Daher wird ein experimentelles System zur Untersuchung menschlicher Mikroglia in vivo benötigt.
Um die In-vivo-Eigenschaften menschlicher Mikroglia zu untersuchen, werden kürzlich in vitro erzeugte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) oder embryonale Stammzellen-abgeleitete menschliche Mikroglia chirurgisch in das Gehirn von Mäusentransplantiert 7,8,9,10,11,12,13,14. Mit diesem Ansatz wurden verschiedene In-vivo-Merkmale menschlicher Mikroglia charakterisiert. Die weit verbreitete Anwendung dieser Methode ist jedoch aus zwei Gründen begrenzt. Erstens ist die Anforderung von immundefizienten Mäusen. Um die Rolle menschlicher Mikroglia bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen, müssen krankheitsmutationsübertragende Mäuse in immundefiziente Mäuse überführt werden, was viel Zeit und Mühe erfordert. Darüber hinaus können bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen periphere Immunzellen, wie T-Zellen, Mikrogliafunktionenmodulieren 15,16,17. Daher stellen Experimente, die an immundefizienten Mäusen durchgeführt wurden, möglicherweise keine echten Eigenschaften der menschlichen Mikroglia in vivo dar. Zweitens erfordern invasive Operationen zur Transplantation von Mikroglia zusätzliche Ausrüstung und Ausbildung. Darüber hinaus kann eine Hirnverletzung während der invasiven Transplantation den Mikroglia-Phänotyp verändern.
In diesem Protokoll wird die nicht-invasive transnasale Transplantation (Tsn) von iPSMG in immunkompetente Wildtyp-Mäuse beschrieben18. Durch die Kombination eines pharmakologischen ON/OFF eines CSF1R-Antagonisten PLX5622, der die endogenen Mausmikroglia19 und Tsn erschöpft, kann iPSMG nicht-invasiv in das Gehirn der Maus transplantiert werden. Darüber hinaus bleibt das transplantierte iPSMG mit der Anwendung von exogenem menschlichem Zytokin für 60 Tage regionsspezifisch ohne Immunsuppressiva lebensfähig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN 93G</td>
			<td>Oriental Yeast Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 antibody</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>019&#8211;19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-STEM121 antibody</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>Y40410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>8019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen iPSMG</td>
			<td>Shionogi &#38; Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory for Drug Discovery and Disease Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>VETLI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Astellas</td>
			<td>18005A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30076028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLX5622</td>
			<td>Amadis Chemical</td>
			<td>A930097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming growth factor-&#946;1 (Tgf-b1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400-10</td>
			<td>antifade mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route

Mikroglia sind die spezialisierte Population von makrophagenähnlichen Zellen des Gehirns. Sie spielen eine wesentliche Rolle sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Gehirnfunktionen. Der größte Teil unseres derzeitigen Verständnisses von Mikroglia basiert auf Experimenten, die mit der Maus durchgeführt wurden. Menschliche Mikroglia unterscheiden sich von Maus-Mikroglia, und daher entsprechen die Reaktion und Eigenschaften von Maus-Mikroglia möglicherweise nicht immer denen von menschlichen Mikroglia. Darüber hinaus ist die Forschung an menschlichen Mikroglia aufgrund ethischer und technischer Schwierigkeiten auf das In-vitro-Kultursystem beschränkt, das die In-vivo-Eigenschaften von Mikroglia nicht kapituliert. Um diese Probleme zu überwinden, wird eine vereinfachte Methode zur nicht-invasiven Transplantation induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteter menschlicher Mikroglia (iPSMG) in das immunkompetente Mäusegehirn über einen transnasalen Weg in Kombination mit der pharmakologischen Erschöpfung endogener Mikroglia unter Verwendung eines koloniestimulierenden Faktor-1-Rezeptor-Antagonisten (CSF1R) entwickelt. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, Zellen nicht-invasiv in das Gehirn der Maus zu transplantieren und kann daher für die Bewertung der In-vivo-Rolle menschlicher Mikroglia in physiologischen und pathologischen Gehirnfunktionen wertvoll sein.

Diese Technik ermöglicht es dem Prüfarzt, iPSMG nicht-invasiv in den Hippocampus und das Kleinhirn zu transplantieren, aber nicht in den Kortex des Mausgehirns. Nach Abschluss der Studie wurden anästhesierte Mäuse einer transkardialen Perfusion von eiskaltem PBS (−) unterzogen, gefolgt von eiskaltem Paraformaldehyd mit 4% (w/v) in PBS. Die Gehirne wurden isoliert, über Nacht in 4% (w/v) Paraformaldehyd postfixiert und in einem PBS, das 30% (w/v) Saccharose enthielt, kryogeschützt. Weiterhin wurden die Gehirne in einer Einbettungsmasse eingefroren und (20 μm dicke koronale Schnitte) auf einem Kryostaten geschnitten. Die Abschnitte wurden dreimal in PBS(−) (je 10 min) gewaschen und mit 0,5% (v/v) Triton X-100 in 10% normalem Ziegenserum für 1 h permeabilisiert und blockiert. Die Abschnitte wurden dann 5 Tage lang mit dem antihumanspezifischen Zytoplasmamarker STEM121 (1:100) und dem Anti-Iba1 (1:1000) inkubiert. Als nächstes wurden die Abschnitte dreimal mit PBS(−) für jeweils 10 min gewaschen und mit sekundären Antikörpern inkubiert: Alexa Fluor 488- oder 546-konjugierte Maus oder Kaninchen-IgGs (1:1000) für 2 h bei Raumtemperatur. Nach dem dreimaligen Waschen mit PBS(-) wurden Abschnitte mit einem Antifade-Montagemedium auf Dias montiert. Für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern wurde ein konfokales Mikroskop verwendet, das mit einer 40-fachen Objektivlinse ausgestattet war. Die Lebensfähigkeit von iPSMG 2 Monate nach der Transplantation im Hippocampus und im Kortex ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Anzahl der transplantierten Zellen kann durch Zählen von Zellen bestimmt werden, die sowohl für humanspezifische Antikörper als auch für panmikrogliale / Monozytenmarker positiv sind, während endogene Mausmikroglia nur wie zuvor beschrieben positiv für Pan-Mikroglia / Monozytenmarker sind18. Die transplantierten iPSMGs ersetzen Mausmikroglia, zeigen verzweigte Morphologien im Hippocampus und werden im Kortex18 nicht nachgewiesen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg"> Abbildung 1: Lebensfähigkeit von iPSMG im Kortex und im Hippocampus 2 Monate nach Tsn. Das linke Feld zeigt eine Immunfärbung mit einem Pan-Mikroglia/Monozytenmarker, Iba1 (grün). Das mittlere Feld zeigt die Immunfärbung mit dem humanspezifischen Zytoplasmamarker STEM121 (rot). Das rechte Feld zeigt ein zusammengeführtes Bild der Immunfärbung von Iba1 und STEM121. (A) Bei Kontrollmäusen wurden sowohl im Kortex als auch im Hippocampus nur Mausmikroglia (Iba1+/STEM121-) nachgewiesen. (B) Bei iPSMG-transplantierten Mäusen wurden im Kortex nur Mausmikroglia (Iba1+/STEM121-) nachgewiesen, während im Hippocampus iPSMG (Iba1+/STEM121+) nachgewiesen wurden. Die Pfeile im Bild zeigen Maus-Mikroglia, während Pfeilspitzen iPSMG zeigen. Für die Fluoreszenzbildaufnahme wurde ein konfokales Mikroskop verwendet, das mit einem 40-fachen Objektiv ausgestattet war. Maximale Bildgröße: 1024 x 1024 Pixel. Zoomfaktor: 2. Maßstabsbalken = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten menschlichen Mikroglia (iPSMG) in das Gehirn über einen transnasalen Weg bei immunkompetenten Mäusen. Die Methode zur Herstellung und transnasalen Transplantation von Zellen und die Verabreichung von Zytokinmischung zur Aufrechterhaltung von iPSMG wird gezeigt.

Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Mikroglia im immunkompetenten Mäusegehirn über nicht-invasiven transnasalen Weg

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Dieses Protokoll ermöglicht eine nicht-invasive Transplantation von iPSMG in das immunkompetente Mäusegehirn durch Kombination eines pharmakologischen Ein- und Ausschaltens eines CSF1-Rezeptorantagonisten PLX5622 mit einer transnasalen Transplantation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass iPSMG transplantiert werden kann, ohne Hirnschäden zu verursachen, selbst bei immunkompetenten Mäusen. Die Mikrogliatransplantation kann als mögliche Therapie dienen, um dysfunktionale Mikroglia in Zukunft bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen mit funktionellen auszutauschen.Das Verfahren wird Bijay Parajuli, ein Forscher aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit dem schnellen Auftauen der gefrorenen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten menschlichen Mikrogliazellen in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad. Schwenken Sie die Proben, bis alles sichtbare Eis geschmolzen ist.Geben Sie das aufgetaute iPSMG in die Kulturmedien, erwärmt auf 37 Grad Celsius. Fügen Sie einen Milliliter Zellen zu 10 Millilitern Kulturmedien hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g für fünf Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten.Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Fügen Sie das Transplantationsmedium hinzu, um eine Zellkonzentration von 10 bis fünf Zellen pro Mikroliter zu erhalten. Legen Sie das iPSMG auf Eis und fahren Sie sofort mit der Transplantation fort.Um Mäuse für die transnasale Transplantation vorzubereiten, füttern Sie die männlichen Mäuse sieben Tage lang mit einer Diät, die PLX enthält. Beenden Sie am Ende des siebten Tages die PLX-Diät und füttern Sie die Mäuse mit einer normalen Diät. Eine Stunde vor der transnasalen Transplantation von iPSMG 2,5 Mikroliter Hyaluronidase in PBS zweimal mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in PBS verabreichen, um die Durchlässigkeit der Nasenschleimhaut zu erhöhen.Legen Sie die Mäuse nach der Hyaluronidase-Anwendung in Rückenlage. Verabreichen Sie 2,5 Mikroliter Hyaluronidase zehn Minuten vor der transnasalen Transplantation von iPSMG. Tragen Sie 2,5 Mikroliter Zellsuspension mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auf.Legen Sie die Maus fünf Minuten lang in Rückenlage, bevor Sie die Zellsuspension in das andere Nasenloch verabreichen. Verabreichen Sie die Zellsuspension viermal und wenden Sie ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern pro Tier an. Wiederholen Sie 48 Stunden nach Beendigung der PLX-Fütterung die Verabreichung von Hyaluronidase und Zellsuspension an denselben Mäusen.Zur Verabreichung von Zytokinen 2,5 Mikroliter des Transplantationsmediums mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auftragen. Nach zwei Monaten transnasales Transplantation kann die Anzahl der transplantierten Zellen bestimmt werden, indem Zellen gezählt werden, die sowohl für humanspezifische als auch für panmikrogliale Marker positiv sind. Endogene Mausmikroglia sind nur für pan-Mikroglia-Marker positiv.Bei Kontrollmäusen wurden sowohl im Kortex als auch im Hippocampus nur Mausmikroglia nachgewiesen. Im Kortex von iPSMG-transplantierten Mäusen wurden nur Mausmikroglia nachgewiesen, während im Hippocampus iPSMG nachgewiesen wurden. Beim Versuch dieses Protokolls ist die vollständige Entfernung des Überstands unerlässlich, um die Verdünnung von Zytokinen zu verhindern.Es ist wichtig, Zytokin alle 12 Stunden für die Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen anzuwenden. Die Erschöpfung der endogenen Mausmikroglia ist für die Transplantation von iPSMG erforderlich. Dieses Verfahren ermöglicht die Transplantation von iPSMG in ein normales oder krankes Mäusegehirn.So können die charakteristischen Eigenschaften von iPSMG sowie das Ansprechen auf Krankheiten bestimmt werden. Diese Technik eignet sich, um die in vivo Charakteristik von iPSMG im Gehirn der Maus zu bestimmen. Daher wird die Transplantation von iPSMG in Krankheitsmodellmäuse uns helfen, die Reaktion zu verstehen und kann den Weg für ein neues therapeutisches Ziel ebnen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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