Name: transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

נותני חסות למענקים: מחקר זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), קרן המדע של מיצובישי (SK), קרן המדע טקדה (SK) ומענק מדעי המוח של פרונטיר מאוניברסיטת יאמאנאשי (SK).

כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה הושגו, שוכנו, טופלו ונעשה בהם שימוש בהתאם ל"עקרונות המנחים בטיפול ובשימוש בבעלי חיים בתחום המדעים הפיזיולוגיים" שפורסמו על ידי האגודה הפיזיולוגית של יפן20, ובאישור הקודם של הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת יאמאנאשי (יאמאנאשי, יפן).
1. הכנת מדיום תאים, מדיום השתלה ותערובת הרדמה
<ol><li>הכינו את מדיום התא על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי ו-0.1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-DMEM.</li>
	<li>הכן את מדיום ההשתלה על ידי הוספת hCSF1 (250 ng/mL) ו- hTGF-β1 (100 ng/mL) למדיום התא.</li>
	<li>הכינו את תערובת ההרדמה להזרקה תוך-צפקית על ידי ערבוב של 0.45 מ"ל של מדטומידין הידרוכלוריד, 1.2 מ"ל של מידזולם ו-1.5 מ"ל של טרטרט בוטורפאנול ב-11.8 מ"ל של מי מלח רגילים.</li>
</ol>2. הכנת iPSMG
הערה: iPSMG קפוא (טבלת חומרים) נשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
<ol><li>להפשיר את התאים הקפואים במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. סובבו את הדגימות עד שכל הקרח הנראה נמס.</li>
	<li>הוסיפו את ה-iPSMG המופשר למדיה התרבותית שחוממה ל-37 מעלות צלזיוס. הוסיפו 1 מ"ל של תאים מופשרים המכילים מדיום (1 × 106 תאים) ל-10 מ"ל של מדיית התרבית.</li>
	<li>צנטריפוגה של התאים ב 300 x g במשך 5 דקות כדי לקבל גלולת תא.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, הסר את כל הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור התא. הסרה מלאה של סופרנטנט רצויה כדי להפחית את דילול ריכוז הציטוקינים במדיום ההשתלה.</li>
	<li>הוסף את מדיום ההשתלה כדי לקבל ריכוז תאים של 1 x 105 תאים / μL.</li>
	<li>מניחים את ה-iPSMG על הקרח ומיד ממשיכים להשתלה. הערה: הכנת iPSMG להשתלה מתבצעת על ספסל נקי כדי למנוע זיהום.</li>
</ol>3. הכנת עכבר להשתלת טרנסנסאל (Tsn)
<ol><li>האכילו את העכברים הזכרים מסוג בר (C57BL/6J, בני 8 שבועות) עם PLX5622 המכיל תזונה למשך 7 ימים.</li>
	<li>בסוף היום השביעי, להפסיק אתדיאטת PLX ולהאכיל את העכברים בתזונה רגילה עד סוף המחקר. הערה: PLX5622 המכילה דיאטה מוכנה על ידי הוספת 1.2 גרם של PLX5622 ב 1 ק"ג של AIN-93G (טבלת חומרים).</li>
</ol>4. השתלה טרנסנסאלית של תאים
<ol><li>24 שעות לאחר הפסקת ההזנה של PLX, שוקלים את העכברים ומרדימים אותם באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תערובת ההרדמה (0.2 מ"ל/20 גרם).</li>
	<li>לאחר שהעכברים מורדמים לחלוטין כפי שהוערך על ידי חוסר תגובה לרפלקס הגמילה מהדוושה (צביטה חזקה בבוהן), תנו 2.5 μL של היאלורונידאז ב-PBS (100 U/mL) בשעה אחת לפני Tsn של iPSMG לכל נחיר פעמיים באמצעות קצה פיפטה של 10 μL כדי להגביר את החדירות של רירית האף.</li>
	<li>לאחר היישום של hyaluronidase, למקם את העכברים במצב שכיבה.</li>
	<li>חזור על שלב 4.2 10 דקות לפני השתלת טרנסנסאל של iPSMG.</li>
	<li>יש למרוח 2.5 μL של תרחיף התא על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 μL.</li>
	<li>מניחים את העכבר במצב שכיבה למשך 5 דקות לפני מתן השעיית התא לנחיר השני.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.5 ו- 4.6 ארבע פעמים, תוך החלת נפח כולל של 20 μL לכל חיה.</li>
	<li>מניחים את העכבר במצב שכיבה על משטח חום של 37 מעלות צלזיוס עד להתאוששות מהרדמה.</li>
	<li>בשעה 48 שעות לאחר הפסקת האכלת PLX, חזור שוב על שלבים 4.1-4.7 על אותם עכברים. הערה: יש לציין כי iPSMG ממוקמים על קרח במהלך ההשתלה.</li>
</ol>5. יישום ציטוקינים
<ol><li>מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של תערובת הרדמה (0.2 מ"ל/20 גרם).</li>
	<li>יש למרוח 2.5 μL של מדיום ההשתלה על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 μL.</li>
	<li>מניחים את העכבר בתנוחת השכיבה למשך 5 דקות לפני מתן מדיום ההשתלה לנחיר השני.</li>
	<li>חזור על שלבים 5.2 ו- 5.3 ארבע פעמים, תוך החלת נפח כולל של 20 μL לכל חיה. הערה: יש לציין כי מתן טרנסנסאלי של מדיום השתלה (ציטוקינים אנושיים) נדרש כל 12 שעות עבור הכדאיות של iPSMG מושתל עד סוף המחקר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Hasselmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+chimeric+model+to+study+and+manipulate+human+microglia+in+vivo.">Development of a chimeric model to study and manipulate human microglia in vivo.</a> Neuron. 103 (6), 1016-1033 (2019).</li><li>Mancuso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-derived+human+microglia+transplanted+in+mouse+brain+to+study+human+disease.">Stem-cell-derived human microglia transplanted in mouse brain to study human disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2111-2116 (2019).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells.">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li><li>Schetters, S. T. T., Gomez-Nicola, D., Garcia-Vallejo, J. J., Van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+Microglia+and+T+cells+get+ready+to+tango.">Neuroinflammation: Microglia and T cells get ready to tango.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1905 (2017).</li><li>Sulzer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+from+patients+with+Parkinson's+disease+recognize+alpha-synuclein+peptides.">T cells from patients with Parkinson's disease recognize alpha-synuclein peptides.</a> Nature. 546 (7660), 656-661 (2017).</li><li>Togo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+T+cells+in+the+brain+of+Alzheimer's+disease+and+other+neurological+diseases.">Occurrence of T cells in the brain of Alzheimer's disease and other neurological diseases.</a> Journal of Neuroimmunology. 124 (1), 83-92 (2002).</li><li>Parajuli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia+to+the+brain+of+immunocompetent+mice.">Transnasal transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia to the brain of immunocompetent mice.</a> Glia. 69 (10), 2332-2348 (2021).</li><li>Elmore, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-stimulating+factor+1+receptor+signaling+is+necessary+for+microglia+viability,+unmasking+a+microglia+progenitor+cell+in+the+adult+brain.">Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain.</a> Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).</li><li>Zasshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+principles+for+the+care+and+use+of+animals+in+the+field+of+physiological+sciences.">Guiding principles for the care and use of animals in the field of physiological sciences.</a> Journal of the Physiologic Society of Japan. 64 (7-8), 143-146 (2002).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+requirements+for+microglial+survival,+specification,+and+function+revealed+by+defined-medium+cultures.">Diverse requirements for microglial survival, specification, and function revealed by defined-medium cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+unique+TGF-beta-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia.">Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nature Neuroscience. 17 (1), 131-143 (2014).</li><li>Regateiro, F. S., Howie, D., Cobbold, S. P., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+in+transplantation+tolerance.">TGF-beta in transplantation tolerance.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 660-669 (2011).</li><li>Yoshimura, A., Muto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+function+in+immune+suppression.">TGF-beta function in immune suppression.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 350, 127-147 (2011).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול כאן מתאר את ההשתלה הלא פולשנית של iPSMG במוח העכבר. הייחודיות של הפרוטוקול הנוכחי היא שעל ידי שילוב שיטות PLX ON/OFF פרמקולוגיות והשתלות תוך-ורידיות, iPSMG יכול להיות מושתל באופן לא פולשני במוח העכבר הדימונו-תחרותי. iPSMG מושתל יצר את רוב המיקרוגליה בהיפוקמפוס ובמוח הקטן על ידי כיבוש הנישה הפנויה עד 60 יום אך לא בקליפת המוח.
הנקודות הקריטיות ל-Tsn היעיל של iPSMG הן (i) יעילות דלדול של מיקרוגליה של עכברים אנדוגניים (ii) מתן ציטוקינים אנושיים כל 12 שעות. מיקרוגליה שומרים על הטריטוריה שלהם במוח. דלדול יעיל של מיקרוגליה של עכבר נדרש כדי לספק נישה עבור השתלה של iPSMG מושתל. כאשר דלדול של מיקרוגליה של עכבר אנדוגני אינו מספיק, התיישבות של היפוקמפוס העכבר ומוח הקטן על ידי iPSMG אינם נצפים. הכדאיות של מיקרוגליה תלויה באיתות CSF1R ו- TGFBR 19,21,22. hCSF1 מדווח כי הוא מגדיל באופן סלקטיבי את הכדאיות של מיקרוגליה אנושית, ו- hTGF-β1 נדרש עבור הכדאיות של מיקרוגליה, כמו גם משכך את הדלקת כאשר הוא ניתן כל 12 שעות 21,23,24. בהיעדר ציטוקינים אנושיים אקסוגניים, iPSMG אינם נצפים במוח העכבר. יתר על כן, יש להקפיד שלא להפעיל באופן מכני את iPSMG על ידי צנרת מוגזמת או בכל אמצעי אחר לפני Tsn, שכן הוא משנה באופן בלתי הפיך את מאפייני iPSMG כמו גם את יעילות ההשתלה. אם Tsn משביע רצון של iPSMG אינו נראה, יש לקבוע את הכדאיות של iPSMG לפני ההשתלה, כמו גם את דלדול המיקרוגליה האנדוגנית. אם דלדול של microglia עכבר אנדוגני אינו יותר מ 90%, זמן ההזנה PLX5622 עשוי להשתנות כדי להגביר את דלדול.
בהשוואה לשיטת השתלה כירורגית קונבנציונלית שהיא פולשנית ודורשת ציוד והכשרה נוספים, Tsn מאפשרת השתלה בצורה לא פולשנית, פשוטה, יציבה וקלה. בנוסף, שיטה זו מאפשרת השתלה של iPSMG במוחות של עכברים מדוכאי חיסון; לפיכך, ניתן להשתמש בעכברי מודל מחלה חיסונית כדי לחקור את התגובה של iPSMG.
החיסרון הגדול ביותר של השיטה הנוכחית הוא ההטרוגניות האזורית בהשרפת iPSMG. אם נדרשת השתלת iPSMG ספציפית לאזור המוח, הפרוטוקול הנוכחי אינו מתאים מכיוון שה-iPSMG המושתל נשאר חרוט במשך 60 יום רק בהיפוקמפוס ובמוח הקטן אך לא בקליפת המוח הקטן, אך לא בקליפת המוח הקטן. יתר על כן, הצורך לנהל ציטוקינים אנושיים אקסוגניים באופן תוך-ורידי כל 12 שעות הוא גם מגבלה של הפרוטוקול הנוכחי מכיוון שהוא דורש עבודה נרחבת ויקר.
לסיכום, פרוטוקול מפורט עבור Tsn של iPSMG לתוך המוחות של עכברים immunocompetent מסופק. בשילוב עם ON/OFF פרמקולוגי של מיקרוגליה של עכבר על ידי PLX5622, פרוטוקול זה מאפשר השתלה מוצלחת של iPSMG. מכיוון שניתן לראות תאים מושתלים בהיפוקמפוס ובמוח הקטן במשך פרק זמן ממושך שבו מיושמים ציטוקינים אקסוגניים, השיטה הנוכחית עשויה להיות בעלת ערך להערכת תפקיד המיקרוגליה האנושית במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים באזורים אלה.

מיקרוגליה הם אוכלוסייה מיוחדת של תאים דמויי מקרופאגים במערכת העצבים המרכזית (CNS) וממלאים תפקידים חיוניים בשליטה על תפקודי מוח שונים כמו התפתחות מעגלים עצביים, ויסות העברה עצבית ושמירה על הומאוסטזיס במוח 1,2,3. אף על פי שמורין מיקרוגליה חולקים פונקציות רבות עם אלה מבני אדם, הם מראים הבדלים ספציפיים למין. לפיכך, התגובה של מיקרוגליה של עכבר לגירויים שונים לא תמיד מייצגת את זו של המיקרוגליה האנושית 4,5,6. למרות שמחקרים רבים ניתחו מיקרוגליה אנושית, ניסויים אלה מוגבלים למחקרים במבחנה. מיקרוגליה אנושית מתורבתת במבחנה מראה תכונות מורפולוגיות וביטוי גנים שונים מאוד מאלה של in vivo. לפיכך, ניסויים במבחנה לא תמיד יכולים להיכנע למאפיינים in vivo של מיקרוגליה אנושית. לכן, יש צורך במערכת ניסיונית לחקר המיקרוגליה האנושית in vivo.
לאחרונה, כדי לחקור את המאפיינים in vivo של מיקרוגליה אנושית, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שנוצרו במבחנה (iPSCs) או מיקרוגליה אנושית שמקורה בתאי גזע עובריים מושתלים בניתוח במוח עכברים 7,8,9,10,11,12,13,14. באמצעות גישה זו, תכונות in vivo שונות של מיקרוגליה אנושית אופיינו. עם זאת, השימוש הנרחב בשיטה זו מוגבל משתי סיבות. הראשונה היא הדרישה של עכברים הסובלים ממחסור במערכת החיסון. לפיכך, כדי לחקור את תפקידה של המיקרוגליה האנושית במחלות נוירודגנרטיביות שונות, יש לחצות עכברים נושאי מוטציות במחלות לעכברים הסובלים ממחסור במערכת החיסון, מה שדורש זמן ומאמץ משמעותיים. יתר על כן, בהפרעות נוירולוגיות שונות, תאי חיסון היקפיים, כמו תאי T, יכולים לווסת תפקודים מיקרוגליאליים 15,16,17. לכן, ניסויים שבוצעו בעכברים הסובלים ממחסור במערכת החיסון עשויים שלא לייצג מאפיינים בתום לב של מיקרוגליה אנושית in vivo. שנית, ניתוחים פולשניים להשתלת מיקרוגליה דורשים ציוד והכשרה נוספים. יתר על כן, פגיעה מוחית במהלך השתלה פולשנית עשויה לשנות פנוטיפים מיקרוגליאליים.
בפרוטוקול זה מתוארת השתלה טרנסנזלית לא פולשנית (Tsn) של iPSMG לעכברים מסוג בר חסרי יכולת חיסונית18. בשילוב פרמקולוגי ON/OFF של אנטגוניסט CSF1R PLX5622 המדלדל את המיקרוגליה19 וה-Tsn של עכברים אנדוגניים, iPSMG יכול להיות מושתל באופן לא פולשני במוח העכבר. יתר על כן, עם היישום של ציטוקינים אנושיים אקסוגניים, ה- iPSMG המושתל נשאר בר קיימא במשך 60 יום באופן ספציפי לאזור ללא כל מדכאי חיסון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN 93G</td>
			<td>Oriental Yeast Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 antibody</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>019&#8211;19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-STEM121 antibody</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>Y40410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>8019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen iPSMG</td>
			<td>Shionogi &#38; Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory for Drug Discovery and Disease Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>VETLI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Astellas</td>
			<td>18005A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30076028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLX5622</td>
			<td>Amadis Chemical</td>
			<td>A930097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming growth factor-&#946;1 (Tgf-b1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400-10</td>
			<td>antifade mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route

מיקרוגליה הם האוכלוסייה המיוחדת של תאים דמויי מקרופאגים במוח. הם ממלאים תפקידים חיוניים הן בתפקודי המוח הפיזיולוגיים והן בתפקודי המוח הפתולוגיים. רוב ההבנה הנוכחית שלנו לגבי מיקרוגליה מבוססת על ניסויים שבוצעו בעכבר. המיקרוגליה האנושית נבדלת מהמיקרוגליה של העכבר, ולכן התגובה והמאפיינים של מיקרוגליה של עכברים לא תמיד מייצגים את זו של המיקרוגליה האנושית. יתר על כן, בשל קשיים אתיים וטכניים, המחקר על מיקרוגליה אנושית מוגבל למערכת תרביות במבחנה , שאינה נכנעת למאפיינים in vivo של מיקרוגליה. כדי להתגבר על בעיות אלה, פותחה שיטה פשוטה להשתלה לא פולשנית של מיקרוגליה אנושית שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSMG) במוח העכברים החיסוניים באמצעות מסלול טרנסנסאלי בשילוב עם דלדול פרמקולוגי של מיקרוגליה אנדוגנית באמצעות אנטגוניסט קולטן גורם 1 (CSF1R) המעורר מושבה. פרוטוקול זה מספק דרך להשתלה לא פולשנית של תאים במוח העכבר ולכן עשוי להיות בעל ערך להערכת תפקידה של המיקרוגליה האנושית בתפקודי המוח הפיזיולוגיים והפתולוגיים.

טכניקה זו מאפשרת לחוקר להשתיל באופן לא פולשני iPSMG לתוך ההיפוקמפוס והמוח הקטן אך לא לתוך קליפת המוח של העכבר. לאחר השלמת המחקר, עכברים מורדמים היו נתונים לזלוף טרנסקרדיאלי של PBS קר כקרח(−), ואחריו קר כקרח 4% (w/v) paraformaldehyde ב- PBS. המוחות היו מבודדים, הוכנסו למשך הלילה ב-4% (w/v) פרפורמלדהיד, והוקפו בהקפאה ב-PBS שהכיל 30% (w/v) סוכרוז. יתר על כן, המוחות הוקפאו בתרכובת הטבעה ונחתכו (מקטעים קורונליים בעובי 20 מיקרומטר) על קריוסטאט. החלקים נשטפו שלוש פעמים ב-PBS(−) (10 דקות כל אחד) ונחדרו ונחסמו עם 0.5% (v/v) Triton X-100 בסרום עיזים רגיל של 10% למשך שעה אחת. לאחר מכן הודגמו המקטעים עם סמן ציטופלסמה אנטי-אנושי ספציפי, STEM121 (1:100) ואנטי Iba1 (1:1000) במשך 5 ימים. לאחר מכן, החלקים נשטפו שלוש פעמים עם PBS(−) במשך 10 דקות כל אחד והודגמו עם נוגדנים משניים: Alexa Fluor 488-, או עכבר מצומד 546, או IgGs ארנב (1:1000) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה עם PBS(-) שלוש פעמים, חלקים הותקנו על מגלשות באמצעות אמצעי הרכבה אנטיפידה. מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית פי 40 שימש לרכישת תמונות פלואורסצנטיות. הכדאיות של iPSMG לאחר חודשיים לאחר ההשתלה בהיפוקמפוס ובקורטקס נראית באיור 1. ניתן לקבוע את מספר התאים המושתלים על ידי ספירת תאים שהם חיוביים הן לנוגדנים ספציפיים לבני אדם והן לסמנים פאן-מיקרוגליאליים/מונוציטים, בעוד שמיקרוגליה של עכברים אנדוגניים חיובית לסמן פאן-מיקרוגליאלי/מונוציטים רק כפי שתואר קודם לכן18. ה-iPSMGs המושתלים מחליפים את המיקרוגליה של העכברים, מראים מורפולוגיות משתוללות בהיפוקמפוס, ואינן מזוהות בקליפת המוח18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg"> איור 1: הכדאיות של iPSMG בקליפת המוח ובהיפוקמפוס במשך חודשיים לאחר Tsn. הפאנל השמאלי מראה חיסון עם סמן פאן-מיקרוגליאלי/מונוציטים, Iba1 (ירוק). הפאנל האמצעי מראה חיסון עם סמן ציטופלסמה ספציפי לאדם STEM121 (אדום). הפאנל הימני מציג תמונה ממוזגת של Iba1 ו- STEM121 immunostaining. (A) בעכברי בקרה זוהו רק מיקרוגליה של עכברים (Iba1+/STEM121-) הן בקליפת המוח והן בהיפוקמפוס. (B) בעכברים שהושתלו ב-iPSMG, בקליפת המוח זוהו רק מיקרוגליה של עכברים (Iba1+/STEM121-), ואילו בהיפוקמפוס iPSMG (Iba1+/STEM121+) זוהו. החצים בתמונה מראים מיקרוגליה של עכבר, ואילו ראשי החצים מראים iPSMG. מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית פי 40 שימש לרכישת תמונה פלואורסצנטית. גודל תמונה מרבי: 1024 x 1024 פיקסלים. גורם זום: 2. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר השתלה של מיקרוגליה אנושית (iPSMG) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במוח דרך מסלול טרנסנסאלי בעכברים מדוכאי חיסון. השיטה להכנת והשתלת טרנסנסאל של תאים וניהול תערובת ציטוקינים לשמירה על iPSMG מוצגת.

השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

פרוטוקול זה מאפשר השתלה לא פולשנית של iPSMG במוח עכברים מדוכאי חיסון על ידי שילוב פרמקולוגי של הפעלה/כיבוי פרמקולוגית של אנטגוניסט לקולטן CSF1 PLX5622 עם השתלה טרנסנסאלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתיל iPSMG מבלי לגרום לנזק מוחי אפילו בעכברים חסרי יכולת חיסונית. השתלה מיקרוגליאלית עשויה לשמש כטיפול פוטנציאלי להחלפת מיקרוגליה לא מתפקדת עם אלה תפקודיים במחלות נוירודגנרטיביות שונות בעתיד.מי שידגים את ההליך יהיה ביג'יי פרג'ולי, חוקר מהמעבדה שלי. התחילו בהפשרה מהירה של תאי המיקרוגליה האנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים קפואים באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס. סובבו את הדגימות עד שכל הקרח הנראה נמס.הוסיפו את ה-iPSMG המופשר למדיה התרבותית, שחוממה ל-37 מעלות צלזיוס. הוסיפו מיליליטר אחד של תאים ל-10 מיליליטרים של מדיית תרבית. צנטריפוגה של התאים במהירות של 300 פעמים g במשך חמש דקות כדי לקבל גלולת תא.הסר את חומר העל מבלי להפריע לכדור התא. הוסף את מדיום ההשתלה כדי לקבל ריכוז תאים של 10 לתאים החמישי לכל מיקרוליטר. מניחים את ה-iPSMG על הקרח, ומיד ממשיכים להשתלה.כדי להכין עכברים להשתלת טרנסנסאל, האכילו את העכברים הזכרים בתזונה המכילה PLX במשך שבעה ימים. בסוף היום השביעי, להפסיק את דיאטת PLX ולהאכיל את העכברים עם דיאטה רגילה. שעה לפני ההשתלה הטרנסנזלית של iPSMG, תנו 2.5 מיקרוליטרים של היאלורונידאז ב-PBS לכל נחיר פעמיים באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להגביר את החדירות לרירית האף.מניחים את העכברים במצב שכיבה לאחר מריחת ההיאלורונידאז. תן 2.5 מיקרוליטרים של היאלורונידאז עשר דקות לפני השתלת טרנסנסאל של iPSMG. יש למרוח 2.5 מיקרוליטרים של תרחיף תאים על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר.מניחים את העכבר בתנוחת השכיבה במשך חמש דקות לפני מתן ההשעיה של התא לנחיריים האחרים. נהל את תרחיף התא ארבע פעמים, תוך החלת נפח כולל של 20 מיקרוליטרים לכל חיה. 48 שעות לאחר הפסקת ההזנה של PLX, חזרו על מתן היאלורונידאז ותרחיף התאים על אותם עכברים.למתן ציטוקינים, יש למרוח 2.5 מיקרוליטרים של מדיום ההשתלה על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר. לאחר חודשיים של השתלה טרנסנסאלית, ניתן לקבוע את מספר התאים המושתלים על ידי ספירת תאים חיוביים הן לסמנים ספציפיים לבני אדם והן לסמנים פאן-מיקרוגליאליים. מיקרוגליה של עכברים אנדוגניים חיובית עבור סמן פאן-מיקרוגליאלי בלבד.בעכברי בקרה זוהו רק מיקרוגליה של עכברים הן בקליפת המוח והן בהיפוקמפוס. בקליפת המוח של עכברים מושתלים iPSMG זוהו רק מיקרוגליה של עכברים, ואילו בהיפוקמפוס iPSMG זוהו. כאשר מנסים את הפרוטוקול הזה, הסרה מלאה של סופרנאטנט חיונית כדי למנוע דילול של ציטוקינים.חשוב מאוד למרוח ציטוקינים כל 12 שעות על הכדאיות של תאים מושתלים. דלדול של מיקרוגליה של עכבר אנדוגני נדרש להשתלת iPSMG. הליך זה מאפשר השתלה של iPSMG לתוך מוח עכבר רגיל או חולה.לפיכך, ניתן לקבוע את המאפיין של iPSMG כמו גם את התגובה למחלה. טכניקה זו מתאימה כדי לקבוע את המאפיין in vivo של iPSMG במוח העכבר. לפיכך, השתלת iPSMG בעכברים במודל מחלה תסייע לנו להבין את התגובה ועשויה לסלול את הדרך למטרה טיפולית חדשה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

מתח נמוך מסלול למידה באמצעות מבוך III Lashley ב עכברים

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

דגמי Zika בנגיף של ה בפיתוח המוח האנושי במבחנה באמצעות תאי גזע נגזר Organoids מוחי

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...