Name: transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

अनुदान प्रायोजक: इस अध्ययन को जेएसपीएस काकेन्ही 17 के 14961 (पीबी), 20 के 15899 (पीबी), जेपी 18 के 06481 (वाईएस), जेपी 20 केके 0366 (वाईएस), 20 एच 05902 (एसके), 20 एच 05060 (एसके), 1 9 एच 04746 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (एसके), 21 एच 04786 (

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सभी जानवरों को जापान20 के फिजियोलॉजिकल सोसाइटी द्वारा प्रकाशित "फिजियोलॉजिकल साइंसेज के क्षेत्र में जानवरों की देखभाल और उपयोग में मार्गदर्शक सिद्धांतों" के अनुसार प्राप्त, रखा, देखभाल और उपयोग किया गया था, और पिछले अनुमोदन के साथ यामानाशी विश्वविद्यालय की पशु देखभाल समिति (यामानाशी, यामानाशी, यामानाशी, जापान)।
1. सेल माध्यम, प्रत्यारोपण माध्यम, और संज्ञाहरण मिश्रण की तैयारी
<ol><li>डीएमईएम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 0.1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़कर सेल माध्यम तैयार करें।</li>
	<li>सेल माध्यम में एचसीएसएफ 1 (250 एनजी / एमएल) और एचटीजीएफ -1 (100 एनजी / एमएल) जोड़कर प्रत्यारोपण माध्यम तैयार करें।</li>
	<li>0.45 एमएल मेडेटोमिडाइन हाइड्रोक्लोराइड, 1.2 एमएल मिडाज़ोलम, और 1.5 एमएल ब्यूटोरफेनॉल टार्ट्रेट को सामान्य खारा के 11.8 एमएल में मिलाकर इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के लिए संज्ञाहरण मिश्रण तैयार करें।</li>
</ol>2. आईपीएसएमजी की तैयारी
नोट: जमे हुए आईपीएसएमजी (सामग्री की तालिका) को उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था।
<ol><li>जमे हुए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी से पिघलाएं। जब तक सभी दिखाई देने वाली बर्फ पिघल न जाए तब तक नमूनों को घुमाएं।</li>
	<li>37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म संस्कृति मीडिया में पिघला हुआ आईपीएसएमजी जोड़ें। संस्कृति मीडिया के 10 एमएल के लिए मध्यम (1 × 106 कोशिकाओं) युक्त पिघला हुआ कोशिकाओं के 1 एमएल जोड़ें।</li>
	<li>एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।</li>
	<li>सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेल गोली को परेशान किए बिना सभी सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। सतह पर तैरनेवाला का पूर्ण निष्कासन प्रत्यारोपण माध्यम में साइटोकिन एकाग्रता के कमजोर पड़ने को कम करने के लिए वांछनीय है।</li>
	<li>1 x 105 कोशिकाओं / μL की एक सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्यारोपण माध्यम जोड़ें।</li>
	<li>बर्फ पर आईपीएसएमजी रखें और तुरंत प्रत्यारोपण के लिए आगे बढ़ें। नोट: प्रत्यारोपण के लिए आईपीएसएमजी की तैयारी संदूषण से बचने के लिए एक स्वच्छ बेंच पर की जाती है।</li>
</ol>3. ट्रांसनेसल प्रत्यारोपण (टीएसएन) के लिए माउस की तैयारी
<ol><li>6 जे, 8 सप्ताह पुराना) को 7 दिनों के लिए पीएलएक्स 5622 युक्त आहार के साथ खिलाएं।</li>
	<li>7वें दिन के अंत में, पीएलएक्स आहार को रोकें और अध्ययन के अंत तक चूहों को सामान्य आहार के साथ खिलाएं। नोट: पीएलएक्स 5622 युक्त आहार एआईएन -93 जी (सामग्री की तालिका) के 1 किलो में पीएलएक्स 5622 के 1.2 ग्राम जोड़कर तैयार किया जाता है।</li>
</ol>4. कोशिकाओं के ट्रांसनेसल प्रत्यारोपण
<ol><li>पीएलएक्स फीडिंग की समाप्ति के 24 घंटे बाद, चूहों का वजन करें और संज्ञाहरण मिश्रण (0.2 एमएल / 20 ग्राम) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके उन्हें एनेस्थेटाइज़ करें।</li>
	<li>चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद पेडल वापसी पलटा (फर्म पैर की अंगुली चुटकी) के प्रति असंवेदनशीलता द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, पीबीएस (100 यू / एमएल) में हाइलूरोनिडेज़ के 2.5 μL को आईपीएसएमजी के टीएसएन से पहले 1 घंटे पहले प्रत्येक नथुने पर नाक म्यूकोसा की पारगम्यता बढ़ाने के लिए 10 μL विंदुक टिप का उपयोग करके दो बार प्रशासित किया जाता है।</li>
	<li>हाइलूरोनिडेज़ के आवेदन के बाद, चूहों को लापरवाह स्थिति में रखें।</li>
	<li>आईपीएसएमजी के ट्रांसनेसल प्रत्यारोपण से पहले चरण 4.2 10 मिनट दोहराएं।</li>
	<li>एक 10 μL विंदुक टिप का उपयोग कर माउस के एक नथुने में सेल निलंबन के 2.5 μL लागू करें।</li>
	<li>अन्य नथुने के लिए सेल निलंबन के प्रशासन से पहले 5 मिनट के लिए लापरवाह स्थिति में माउस प्लेस।</li>
	<li>चरण 4.5 और 4.6 को चार बार दोहराएं, प्रति पशु 20 μL की कुल मात्रा लागू करें।</li>
	<li>संज्ञाहरण से वसूली तक एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी पैड पर लापरवाह स्थिति में माउस प्लेस।</li>
	<li>पीएलएक्स फीडिंग की समाप्ति के बाद 48 घंटे में, एक बार फिर से उसी चूहों पर चरण 4.1-4.7 दोहराएं। नोट: यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रत्यारोपण के दौरान आईपीएसएमजी को बर्फ पर रखा जाता है।</li>
</ol>5. साइटोकिन्स का अनुप्रयोग
<ol><li>संज्ञाहरण मिश्रण (0.2 एमएल / 20 ग्राम) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें।</li>
	<li>एक 10 μL विंदुक टिप का उपयोग कर माउस के एक नथुने में प्रत्यारोपण माध्यम के 2.5 μL लागू होते हैं।</li>
	<li>अन्य नथुने के लिए प्रत्यारोपण माध्यम प्रशासन से पहले 5 मिनट के लिए लापरवाह स्थिति में माउस प्लेस।</li>
	<li>चरण 5.2 और 5.3 को चार बार दोहराएं, प्रति पशु 20 μL की कुल मात्रा लागू करें। नोट: यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अध्ययन के अंत तक प्रत्यारोपित आईपीएसएमजी की व्यवहार्यता के लिए प्रत्यारोपण माध्यम (मानव साइटोकिन्स) के ट्रांसनेसल प्रशासन की आवश्यकता हर 12 घंटे में होती है।</li>
</ol>

<ol>
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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

यहां प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क में आईपीएसएमजी के गैर-इनवेसिव प्रत्यारोपण का वर्णन करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल की विशिष्टता यह है कि औषधीय पीएलएक्स ऑन / ऑफ विधियों और इंट्रानैसल प्रत्यारोपण के संयोजन से, आईपीएसएमजी को गैर-आक्रामक रूप से इम्यूनोकॉम्पेप्टेंट माउस मस्तिष्क में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। प्रत्यारोपित आईपीएसएमजी ने हिप्पोकैम्पस और सेरिबैलम में माइक्रोग्लिया के बहुमत का गठन 60 दिनों तक खाली जगह पर कब्जा करके किया लेकिन कॉर्टेक्स में नहीं।
आईपीएसएमजी के कुशल टीएसएन के लिए महत्वपूर्ण बिंदु (i) अंतर्जात माउस माइक्रोग्लिया की कमी दक्षता (द्वितीय) हर 12 घंटे में मानव साइटोकिन्स का प्रशासन है। माइक्रोग्लिया मस्तिष्क में अपने स्वयं के क्षेत्र को बनाए रखता है। प्रत्यारोपित आईपीएसएमजी के प्रवेश के लिए एक जगह प्रदान करने के लिए माउस माइक्रोग्लिया की कुशल कमी की आवश्यकता होती है। जब अंतर्जात माउस माइक्रोग्लिया की कमी अपर्याप्त होती है, तो आईपीएसएमजी द्वारा माउस हिप्पोकैम्पस और सेरिबैलम का उपनिवेशीकरण नहीं देखा जाता है। माइक्रोग्लिया की व्यवहार्यता सीएसएफ 1 आर और टीजीएफबीआर सिग्नलिंग19,21,22 पर निर्भर करती है। एचसीएसएफ 1 को मानव माइक्रोग्लिया की व्यवहार्यता को चुनिंदा रूप से बढ़ाने की सूचना दी जाती है, और एचटीजीएफ -1 को माइक्रोग्लिया की व्यवहार्यता के लिए आवश्यक है और साथ ही हर 12 घंटे 21,23,24 प्रशासित होने पर सूजन को कम करता है। बहिर्जात मानव साइटोकिन्स की अनुपस्थिति में, आईपीएसएमजी माउस मस्तिष्क में नहीं देखा जाता है। इसके अलावा, ध्यान रखा जाना चाहिए कि टीएसएन से पहले अत्यधिक पाइपिंग या किसी अन्य माध्यम से आईपीएसएमजी को यांत्रिक रूप से सक्रिय न किया जाए, क्योंकि यह आईपीएसएमजी विशेषताओं के साथ-साथ प्रत्यारोपण दक्षता को अपरिवर्तनीय रूप से बदल देता है। यदि आईपीएसएमजी के संतोषजनक टीएसएन को नहीं देखा जाता है, तो प्रत्यारोपण से पहले आईपीएसएमजी की व्यवहार्यता के साथ-साथ अंतर्जात माइक्रोग्लिया की कमी को निर्धारित किया जाना चाहिए। यदि अंतर्जात माउस माइक्रोग्लिया की कमी 90% से अधिक नहीं है, तो पीएलएक्स 5622 खिला समय को कमी बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
एक पारंपरिक सर्जिकल प्रत्यारोपण विधि की तुलना में जो आक्रामक है और अतिरिक्त उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, टीएसएन एक गैर-आक्रामक, सरल, स्थिर और आसान तरीके से प्रत्यारोपण की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह विधि आईपीएसएमजी के प्रत्यारोपण को इम्यूनोकम्पिटेंट चूहों के दिमाग में अनुमति देती है; इस प्रकार, इम्यूनोसक्षम रोग मॉडल चूहों का उपयोग आईपीएसएमजी की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
वर्तमान विधि का सबसे बड़ा नुकसान आईपीएसएमजी के एनग्राफ्टमेंट में क्षेत्रीय विषमता है। यदि मस्तिष्क क्षेत्र-विशिष्ट आईपीएसएमजी प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है, तो वर्तमान प्रोटोकॉल उपयुक्त नहीं है क्योंकि प्रत्यारोपित आईपीएसएमजी केवल हिप्पोकैम्पस और सेरिबैलम में 60 दिनों के लिए उत्कीर्ण रहता है लेकिन कॉर्टेक्स में नहीं। इसके अलावा, बहिर्जात मानव साइटोकिन्स को हर 12 घंटे में इंट्रानैसल रूप से प्रशासित करने की आवश्यकता भी वर्तमान प्रोटोकॉल की एक सीमा है क्योंकि इसके लिए व्यापक श्रम की आवश्यकता होती है और महंगा है।
अंत में, इम्यूनोसक्षम चूहों के दिमाग में आईपीएसएमजी के टीएसएन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। जब पीएलएक्स 5622 द्वारा माउस माइक्रोग्लिया के औषधीय चालू / बंद के साथ संयुक्त किया जाता है, तो यह प्रोटोकॉल आईपीएसएमजी के सफल एन्ग्राफ्टमेंट की अनुमति देता है। चूंकि प्रत्यारोपित कोशिकाओं को हिप्पोकैम्पस और सेरिबैलम में निरंतर अवधि के लिए देखा जा सकता है जब बहिर्जात साइटोकिन्स लागू होते हैं, वर्तमान विधि उन क्षेत्रों में शारीरिक और रोग दोनों राज्यों में मानव माइक्रोग्लिया की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए मूल्यवान हो सकती है।

माइक्रोग्लिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं की एक विशेष आबादी है और तंत्रिका सर्किट विकास, न्यूरोट्रांसमिशन को संशोधित करने और मस्तिष्क होमियोस्टेसिस 1,2,3 को बनाए रखने जैसे विभिन्न मस्तिष्क कार्यों को नियंत्रित करने में आवश्यक भूमिका निभाता है। यद्यपि मूत्र माइक्रोग्लिया मनुष्यों के लोगों के साथ कई कार्यों को साझा करता है, वे प्रजातियों-विशिष्ट अंतर दिखाते हैं। इस प्रकार, विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए माउस माइक्रोग्लिया की प्रतिक्रिया हमेशा मानव माइक्रोग्लिया 4,5,6 का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकती है। हालांकि कई अध्ययनों ने मानव माइक्रोग्लिया का विश्लेषण किया है, लेकिन वे प्रयोग इन विट्रो अध्ययनों तक ही सीमित हैं। इन विट्रो सुसंस्कृत मानव माइक्रोग्लिया में रूपात्मक विशेषताएं और जीन अभिव्यक्ति दिखाई देती है जो विवो में उन लोगों से बहुत अलग हैं। इस प्रकार, इन विट्रो प्रयोगों में हमेशा मानव माइक्रोग्लिया की इन विवो विशेषताओं को कैपिट्यूलेट नहीं किया जा सकता है। इसलिए, विवो में मानव माइक्रोग्लिया का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रणाली की आवश्यकता है।
हाल ही में, मानव माइक्रोग्लिया की विवो विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए, इन विट्रो में प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) उत्पन्न होता है- या भ्रूण स्टेम कोशिकाओं-व्युत्पन्न मानव माइक्रोग्लिया को शल्य चिकित्सा से चूहों के मस्तिष्क 7,8,9,10,11,12,13,14 में प्रत्यारोपित किया जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, मानव माइक्रोग्लिया की विवो सुविधाओं में विभिन्न की विशेषता है। हालांकि, इस विधि का व्यापक उपयोग दो कारणों से सीमित है। सबसे पहले प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहों की आवश्यकता है। इस प्रकार, विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में मानव माइक्रोग्लिया की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, रोग उत्परिवर्तन-ले जाने वाले चूहों को प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहों में पार करना पड़ता है, जिसके लिए महत्वपूर्ण समय और प्रयास की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों में, परिधीय प्रतिरक्षा कोशिकाएं, जैसे टी कोशिकाएं, माइक्रोग्लियल कार्यों को 15,16,17 को संशोधित कर सकती हैं। इसलिए, प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहों में किए गए प्रयोग विवो में मानव माइक्रोग्लिया की वास्तविक विशेषताओं का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं। दूसरा, माइक्रोग्लिया को प्रत्यारोपण करने के लिए आक्रामक सर्जरी के लिए अतिरिक्त उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इनवेसिव प्रत्यारोपण के दौरान मस्तिष्क की चोट माइक्रोग्लियल फेनोटाइप को बदल सकती है।
इस प्रोटोकॉल में, इम्यूनोकॉम्पिटेंट जंगली-प्रकार के चूहों में आईपीएसएमजी के गैर-इनवेसिव ट्रांसनेसल प्रत्यारोपण (टीएसएन) का वर्णन18 किया गया है। सीएसएफ 1 आर प्रतिपक्षी पीएलएक्स 5622 के औषधीय चालू / बंद का संयोजन जो अंतर्जात माउस माइक्रोग्लिया1 9 और टीएसएन को समाप्त करता है, आईपीएसएमजी को माउस मस्तिष्क में गैर-आक्रामक रूप से प्रत्यारोपित किया जा सकता है। इसके अलावा, बहिर्जात मानव साइटोकाइन के आवेदन के साथ, प्रत्यारोपित आईपीएसएमजी बिना किसी इम्यूनोसप्रेसेंट के क्षेत्र-विशिष्ट तरीके से 60 दिनों के लिए व्यवहार्य रहता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN 93G</td>
			<td>Oriental Yeast Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 antibody</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>019&#8211;19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-STEM121 antibody</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>Y40410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>8019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen iPSMG</td>
			<td>Shionogi &#38; Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory for Drug Discovery and Disease Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>VETLI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Astellas</td>
			<td>18005A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30076028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLX5622</td>
			<td>Amadis Chemical</td>
			<td>A930097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming growth factor-&#946;1 (Tgf-b1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400-10</td>
			<td>antifade mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route

माइक्रोग्लिया मस्तिष्क की मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं की विशेष आबादी है। वे शारीरिक और पैथोलॉजिकल मस्तिष्क दोनों कार्यों में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। माइक्रोग्लिया की हमारी वर्तमान समझ में से अधिकांश माउस में किए गए प्रयोगों पर आधारित है। मानव माइक्रोग्लिया माउस माइक्रोग्लिया से भिन्न होता है, और इस प्रकार माउस माइक्रोग्लिया की प्रतिक्रिया और विशेषताएं हमेशा मानव माइक्रोग्लिया का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकती हैं। इसके अलावा, नैतिक और तकनीकी कठिनाइयों के कारण, मानव माइक्रोग्लिया पर शोध इन विट्रो संस्कृति प्रणाली तक सीमित है, जो माइक्रोग्लिया की विवो विशेषताओं में कैपिट्यूलेट नहीं करता है। इन मुद्दों को दूर करने के लिए, कॉलोनी-उत्तेजक कारक 1 रिसेप्टर (सीएसएफ 1 आर) विरोधी का उपयोग करके अंतर्जात माइक्रोग्लिया की औषधीय कमी के संयोजन में एक ट्रांसनेसल मार्ग के माध्यम से इम्यूनोकॉम्पेप्टेंट चूहों के मस्तिष्क में गैर-आक्रामक रूप से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मानव माइक्रोग्लिया (आईपीएसएमजी) को प्रत्यारोपित करने के लिए एक सरलीकृत विधि विकसित की गई है। यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क में गैर-आक्रामक रूप से प्रत्यारोपण कोशिकाओं का एक तरीका प्रदान करता है और इसलिए शारीरिक और पैथोलॉजिकल मस्तिष्क कार्यों में मानव माइक्रोग्लिया की विवो भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए मूल्यवान हो सकता है।

यह तकनीक अन्वेषक को गैर-आक्रामक रूप से आईपीएसएमजी को हिप्पोकैम्पस और सेरिबैलम में प्रत्यारोपण करने की अनुमति देती है लेकिन माउस मस्तिष्क के प्रांतस्था में नहीं। अध्ययन पूरा करने के बाद, एनेस्थेटाइज्ड चूहों को बर्फ-ठंडे पीबीएस (−) के ट्रांसकार्डियल छिड़काव के अधीन किया गया था, इसके बाद पीबीएस में बर्फ-ठंडा 4% (डब्ल्यू / वी) पैराफॉर्मल्डेहाइड में रात भर पोस्टफिक्स किया गया था, और 30% (डब्ल्यू / वी) सुक्रोज युक्त पीबीएस में क्रायोप्रोटेक्टेड किया गया था। इसके अलावा, दिमाग को एक एम्बेडिंग यौगिक में जमे हुए थे और एक क्रायोस्टेट पर सेक्शन (20 μm मोटी कोरोनल सेक्शन) किया गया था। वर्गों को पीबीएस (-) (10 मिनट प्रत्येक) में तीन बार धोया गया था और 1 घंटे के लिए 10% सामान्य बकरी सीरम में 0.5% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 के साथ परमीबिलाइज्ड और अवरुद्ध किया गया था। वर्गों को तब 5 दिनों के लिए एंटी-ह्यूमन-विशिष्ट साइटोप्लाज्म मार्कर, एसटीईएम 121 (1: 100), और एंटी इबा 1 (1: 1000) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इसके बाद, वर्गों को प्रत्येक 10 मिनट के लिए पीबीएस (-) के साथ तीन बार धोया गया था और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था: एलेक्सा फ्लोर 488-, या 546-संयुग्मित माउस, या खरगोश आईजीजी (1: 1000) कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए। पीबीएस (-) के साथ तीन बार धोने के बाद, वर्गों को एंटीफेड बढ़ते माध्यम का उपयोग करके स्लाइड पर रखा गया था। प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करने के लिए 40x उद्देश्य लेंस से सुसज्जित एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स में प्रत्यारोपण के बाद 2 महीने में आईपीएसएमजी की व्यवहार्यता चित्रा 1 में दिखाया गया है। प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या कोशिकाओं की गिनती करके निर्धारित की जा सकती है जो मानव-विशिष्ट एंटीबॉडी और पैन-माइक्रोग्लियल / मोनोसाइट मार्कर दोनों के लिए सकारात्मक हैं, जबकि अंतर्जात माउस माइक्रोग्लिया केवल पैन-माइक्रोग्लियल / मोनोसाइट मार्कर के लिए सकारात्मक हैं जैसा कि पहले वर्णित18 था। प्रत्यारोपित आईपीएसएमजी माउस माइक्रोग्लिया को प्रतिस्थापित करते हैं, हिप्पोकैम्पस में रामिफाइड आकृति विज्ञान दिखाते हैं, और कॉर्टेक्स18 में पता नहीं लगाया जाता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg"> चित्रा 1: टीएसएन के बाद 2 महीने में कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस में आईपीएसएमजी की व्यवहार्यता। बाएं पैनल एक पैन-माइक्रोग्लियल / मोनोसाइट मार्कर, इबा 1 (हरा) के साथ इम्यूनोस्टेनिंग दिखाता है। मध्य पैनल मानव-विशिष्ट साइटोप्लाज्म मार्कर एसटीईएम 121 (लाल) के साथ इम्यूनोस्टेनिंग दिखाता है। दायां पैनल आईबीए 1 और एसटीईएम 121 इम्यूनोस्टेनिंग की एक विलय की गई छवि दिखाता है। (ए) नियंत्रण चूहों में, कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस दोनों में केवल माउस माइक्रोग्लिया (आईबीए 1 + / एसटीईएम 121-) का पता चला था। (बी) आईपीएसएमजी प्रत्यारोपित चूहों में, कॉर्टेक्स में, केवल माउस माइक्रोग्लिया (आईबीए 1 + / एसटीईएम 121-) का पता लगाया गया था, जबकि हिप्पोकैम्पस आईपीएसएमजी (आईबीए 1 + / एसटीईएम 121 +) में पता चला था। छवि में तीर माउस माइक्रोग्लिया दिखाते हैं, जबकि तीर आईपीएसएमजी दिखाते हैं। प्रतिदीप्ति छवि अधिग्रहण के लिए 40x उद्देश्य लेंस से सुसज्जित एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। अधिकतम छवि आकार: 1024 x 1024 पिक्सेल। ज़ूम कारक: 2. स्केल बार = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल इम्यूनोकंपैटेंट चूहों में एक ट्रांसनेसल मार्ग के माध्यम से मस्तिष्क में प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मानव माइक्रोग्लिया (आईपीएसएमजी) के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है। कोशिकाओं की तैयारी और ट्रांसनैसल प्रत्यारोपण और आईपीएसएमजी के रखरखाव के लिए साइटोकिन मिश्रण के प्रशासन के लिए विधि दिखाई गई है।

गैर-इनवेसिव ट्रांसनेसल रूट के माध्यम से इम्यूनोकंपैटेंट चूहों के मस्तिष्क में मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया का प्रत्यारोपण

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

यह प्रोटोकॉल ट्रांसनेसल प्रत्यारोपण के साथ सीएसएफ 1 रिसेप्टर विरोधी पीएलएक्स 5622 के औषधीय चालू / बंद के संयोजन से इम्यूनोकॉम्पेप्टेंट माउस मस्तिष्क में आईपीएसएमजी के गैर-इनवेसिव प्रत्यारोपण की अनुमति देता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि आईपीएसएमजी को इम्यूनोसक्षम चूहों में भी मस्तिष्क क्षति को प्रेरित किए बिना प्रत्यारोपित किया जा सकता है। माइक्रोग्लियल प्रत्यारोपण भविष्य में विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में कार्यात्मक लोगों के साथ बेकार माइक्रोग्लिया का आदान-प्रदान करने के लिए एक संभावित चिकित्सा के रूप में काम कर सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला के एक शोधकर्ता बिजय पराजुली होंगे। जमे हुए प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मानव माइक्रोग्लिया कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी से पिघलाकर शुरू करें। जब तक सभी दिखाई देने वाली बर्फ पिघल न जाए तब तक नमूनों को घुमाएं।पिघला हुआ आईपीएसएमजी को संस्कृति मीडिया में जोड़ें, 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म हो गया। संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं के एक मिलीलीटर जोड़ें। एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।सेल गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें। प्रति माइक्रोलीटर पांचवीं कोशिकाओं के लिए 10 की सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्यारोपण माध्यम जोड़ें। बर्फ पर आईपीएसएमजी रखें, और तुरंत प्रत्यारोपण के लिए आगे बढ़ें।ट्रांसनासल प्रत्यारोपण के लिए चूहों को तैयार करने के लिए, पुरुष चूहों को सात दिनों के लिए पीएलएक्स युक्त आहार के साथ खिलाएं। सातवें दिन के अंत में, पीएलएक्स आहार को बंद करें और चूहों को सामान्य आहार के साथ खिलाएं। आईपीएसएमजी के ट्रांसनासल प्रत्यारोपण से एक घंटे पहले, नाक म्यूकोसा के लिए पारगम्यता बढ़ाने के लिए 10-माइक्रोलीटर विंदुक टिप का उपयोग करके दो बार प्रत्येक नथुने पर पीबीएस में 2.5 माइक्रोलिटर हाइलूरोनिडेज़ का प्रशासन करें।हाइलूरोनिडेज़ आवेदन के बाद लापरवाह स्थिति में चूहों को रखें। आईपीएसएमजी के ट्रांसनैसल प्रत्यारोपण से दस मिनट पहले हाइलूरोनिडेज़ के 2.5 माइक्रोलीटर का प्रशासन करें। एक 10 माइक्रोलीटर विंदुक टिप का उपयोग माउस के एक नथुने में सेल निलंबन के 2.5 माइक्रोलीटर लागू होते हैं।अन्य नथुने के लिए सेल निलंबन के प्रशासन से पहले पांच मिनट के लिए लापरवाह स्थिति में माउस रखें। सेल निलंबन को चार बार प्रशासित करें, प्रति पशु 20 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा को लागू करें। पीएलएक्स फीडिंग की समाप्ति के 48 घंटे बाद, एक ही चूहों पर हाइलूरोनिडेस और सेल निलंबन के प्रशासन को दोहराएं।साइटोकिन्स के प्रशासन के लिए, प्रत्यारोपण माध्यम के 2.5 माइक्रोलीटर को 10-माइक्रोलीटर विंदुक टिप का उपयोग करके माउस के एक नथुने में लागू करें। ट्रांसनेसल प्रत्यारोपण के दो महीने बाद, प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या उन कोशिकाओं की गिनती करके निर्धारित की जा सकती है जो मानव-विशिष्ट और पैन-माइक्रोग्लियल मार्करों दोनों के लिए सकारात्मक हैं। अंतर्जात माउस माइक्रोग्लिया केवल पैन-माइक्रोग्लियल मार्कर के लिए सकारात्मक हैं।नियंत्रण चूहों में, कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस दोनों में केवल माउस माइक्रोग्लिया का पता चला था। आईपीएसएमजी प्रत्यारोपित चूहों के प्रांतस्था में, केवल माउस माइक्रोग्लिया का पता लगाया गया था, जबकि हिप्पोकैम्पस आईपीएसएमजी में पता चला था। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, साइटोकिन्स के कमजोर पड़ने को रोकने के लिए सतह पर तैरनेवाला को पूरी तरह से हटाना आवश्यक है।प्रत्यारोपित कोशिकाओं की व्यवहार्यता के लिए हर 12 घंटे में साइटोकाइन लागू करना महत्वपूर्ण है। आईपीएसएमजी के प्रत्यारोपण के लिए अंतर्जात माउस माइक्रोग्लिया की कमी की आवश्यकता होती है। यह प्रक्रिया एक सामान्य या रोगग्रस्त माउस मस्तिष्क में आईपीएसएमजी के प्रत्यारोपण की अनुमति देती है।इस प्रकार, आईपीएसएमजी की विशेषता के साथ-साथ बीमारी की प्रतिक्रिया निर्धारित की जा सकती है। यह तकनीक माउस मस्तिष्क में आईपीएसएमजी की इन विवो विशेषता को निर्धारित करने के लिए उपयुक्त है। इस प्रकार, रोग मॉडल चूहों में आईपीएसएमजी को प्रत्यारोपित करने से हमें प्रतिक्रिया को समझने में मदद मिलेगी और एक नए चिकित्सीय लक्ष्य का मार्ग प्रशस्त हो सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

कम तनाव का चूहे में Lashley III भूलभुलैया का उपयोग करना सीखना

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

मॉडलिंग स्टेम सेल व्युत्पंन सेरेब्रल Organoids का उपयोग इन विट्रो में विकासशील मानव मस्तिष्क के Zika वायरस संक्रमण

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन न्यूरॉन्स की उच्च गति खिंचाव चोट के लिए विधि

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neuritogenesis और Synapse परिपक्वता की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए मानव Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के बाद भेदभाव replating

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं और गैबाएर्गिक न्यूरॉन्स के लिए प्रवासन, कीमो-आकर्षण और सह-संस्कृति परख

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

मानव प्रेरित प्लीस्ट्रेटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में मानव प्रेरित प्लुरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में मिटोकॉन्ड्रियल परिवहन और आकृति विज्ञान का विश्लेषण वंशानुगत स्पास्टिक पैराप्लेजिया

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

वयस्क मानव मस्तिष्क ऊतक से मानव माइक्रोग्लिया प्राप्त करना

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का व्युत्पन्न, विस्तार, क्रायोप्रिजर्वेशन और लक्षण वर्णन

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

"एक बिल्ली के बड़े पशु मॉडल में मानव भ्रूण स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना ऊतक का सबरेटिनल प्रत्यारोपण

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल और उनके तंत्रिका और ग्लियल डेरिवेटिव में कई माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...