Name: transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Tilskuddssponsorer: Denne studien ble støttet av JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), Mitsubishi Science Foundation (SK), Takeda Science Foundation (SK) og et Frontier Brain Science Grant fra University of Yamanashi (SK).

Alle dyrene som ble brukt i denne studien ble oppnådd, plassert, tatt vare på og brukt i samsvar med "Veiledende prinsipper i omsorg og bruk av dyr innen fysiologiske vitenskaper" publisert av Physiologic Society of Japan20, og med tidligere godkjenning av Animal Care Committee ved University of Yamanashi (Yamanashi, Japan).
1. Fremstilling av cellemedium, transplantasjonsmedium og anestesiblanding
<ol><li>Forbered cellemediet ved å tilsette 10% foster bovint serum og 0,1% penicillin/streptomycin i DMEM.</li>
	<li>Forbered transplantasjonsmediet ved å legge hCSF1 (250 ng/ml) og hTGF-β1 (100 ng/ml) til cellemediet.</li>
	<li>Forbered anestesiblandingen for intraperitoneal injeksjon ved å blande 0,45 ml medetomidinhydroklorid, 1,2 ml midazolam og 1,5 ml butorphanol tartrat i 11,8 ml normal saltvann.</li>
</ol>2. Fremstilling av iPSMG
MERK: Frossen iPSMG (materialfortegnelser) ble oppbevart ved -80 °C til bruk.
<ol><li>Tine de frosne cellene raskt i et 37 °C vannbad. Virvle prøvene til all synlig is har smeltet.</li>
	<li>Tilsett den opptinte iPSMG i kulturmediene oppvarmet til 37 °C. Tilsett 1 ml opptinte celler som inneholder middels (1 × 106 celler) til 10 ml av kulturmediene.</li>
	<li>Sentrifuger cellene på 300 x g i 5 min for å få en cellepellet.</li>
	<li>Etter sentrifugering, fjern all supernatant uten å forstyrre cellepellet. Fullstendig fjerning av supernatant er ønskelig å redusere fortynning av cytokinkonsentrasjonen i transplantasjonsmediet.</li>
	<li>Tilsett transplantasjonsmediet for å oppnå en cellekonsentrasjon på 1 x 105 celler / μL.</li>
	<li>Plasser iPSMG på is og fortsett umiddelbart til transplantasjon. MERK: Tilberedning av iPSMG for transplantasjon utføres på en ren benk for å unngå forurensning.</li>
</ol>3. Forberedelse av mus for transnasal transplantasjon (Tsn)
<ol><li>Fôr de ville mannlige musene (C57BL / 6J, 8 uker gammel) med PLX5622 som inneholder diett i 7 dager.</li>
	<li>På slutten av densyvende dagen, stopp PLX-dietten og mate musene med et normalt kosthold til slutten av studien. MERK: PLX5622 som inneholder kosthold fremstilles ved å tilsette 1,2 g PLX5622 i 1 kg AIN-93G (materialfortegnende tabell).</li>
</ol>4. Transnasal transplantasjon av celler
<ol><li>24 timer etter opphør av PLX-fôring, vei musene og bedøv dem ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av anestesiblandingen (0,2 ml / 20 g).</li>
	<li>Etter at musene er fullstendig bedøvet som vurdert ved manglende respons på pedaluttaksrefleks (fast tåklemme), administrer 2,5 μL hyaluronidase i PBS (100 U/ml) ved 1 time før Tsn av iPSMG til hvert nesebor to ganger ved hjelp av en 10 μL pipettespiss for å øke faren for neseslimhinnen.</li>
	<li>Etter påføring av hyaluronidase, plasser musene i liggende stilling.</li>
	<li>Gjenta trinn 4.2 10 min før transnasal transplantasjon av iPSMG.</li>
	<li>Påfør 2,5 μL celleoppheng i ett nesebor av musen ved hjelp av en 10 μL pipettespiss.</li>
	<li>Plasser musen i liggende stilling i 5 minutter før administrering av cellefjæring til det andre neseboret.</li>
	<li>Gjenta trinn 4,5 og 4,6 fire ganger, og bruk et totalt volum på 20 μL per dyr.</li>
	<li>Plasser musen i liggende stilling på en 37 °C varmepute til den er restituert fra anestesi.</li>
	<li>Ved 48 timer etter opphør av PLX-fôring, gjenta trinn 4.1-4.7 på de samme musene igjen. MERK: Det skal bemerkes at iPSMG plasseres på is under transplantasjonen.</li>
</ol>5. Påføring av cytokiner
<ol><li>Bedøv musene ved en intraperitoneal injeksjon av anestesiblanding (0,2 ml / 20 g).</li>
	<li>Påfør 2,5 μL av transplantasjonsmediet i ett nesebor av musen ved hjelp av en 10 μL pipettespiss.</li>
	<li>Plasser musen i liggende stilling i 5 minutter før du administrerer transplantasjonsmediet til det andre neseboret.</li>
	<li>Gjenta trinn 5,2 og 5,3 fire ganger, og bruk et totalt volum på 20 μL per dyr. MERK: Det skal bemerkes at transnasal administrering av transplantasjonsmedium (humane cytokiner) er nødvendig hver 12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Hasselmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+chimeric+model+to+study+and+manipulate+human+microglia+in+vivo.">Development of a chimeric model to study and manipulate human microglia in vivo.</a> Neuron. 103 (6), 1016-1033 (2019).</li><li>Mancuso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-derived+human+microglia+transplanted+in+mouse+brain+to+study+human+disease.">Stem-cell-derived human microglia transplanted in mouse brain to study human disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2111-2116 (2019).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells.">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li><li>Schetters, S. T. T., Gomez-Nicola, D., Garcia-Vallejo, J. J., Van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+Microglia+and+T+cells+get+ready+to+tango.">Neuroinflammation: Microglia and T cells get ready to tango.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1905 (2017).</li><li>Sulzer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+from+patients+with+Parkinson's+disease+recognize+alpha-synuclein+peptides.">T cells from patients with Parkinson's disease recognize alpha-synuclein peptides.</a> Nature. 546 (7660), 656-661 (2017).</li><li>Togo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+T+cells+in+the+brain+of+Alzheimer's+disease+and+other+neurological+diseases.">Occurrence of T cells in the brain of Alzheimer's disease and other neurological diseases.</a> Journal of Neuroimmunology. 124 (1), 83-92 (2002).</li><li>Parajuli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia+to+the+brain+of+immunocompetent+mice.">Transnasal transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia to the brain of immunocompetent mice.</a> Glia. 69 (10), 2332-2348 (2021).</li><li>Elmore, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-stimulating+factor+1+receptor+signaling+is+necessary+for+microglia+viability,+unmasking+a+microglia+progenitor+cell+in+the+adult+brain.">Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain.</a> Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).</li><li>Zasshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+principles+for+the+care+and+use+of+animals+in+the+field+of+physiological+sciences.">Guiding principles for the care and use of animals in the field of physiological sciences.</a> Journal of the Physiologic Society of Japan. 64 (7-8), 143-146 (2002).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+requirements+for+microglial+survival,+specification,+and+function+revealed+by+defined-medium+cultures.">Diverse requirements for microglial survival, specification, and function revealed by defined-medium cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+unique+TGF-beta-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia.">Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nature Neuroscience. 17 (1), 131-143 (2014).</li><li>Regateiro, F. S., Howie, D., Cobbold, S. P., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+in+transplantation+tolerance.">TGF-beta in transplantation tolerance.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 660-669 (2011).</li><li>Yoshimura, A., Muto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+function+in+immune+suppression.">TGF-beta function in immune suppression.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 350, 127-147 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Protokollen her beskriver ikke-invasiv transplantasjon av iPSMG i musehjernen. Det unike ved den nåværende protokollen er at ved å kombinere farmakologiske PLX ON/OFF-metoder og intranasal transplantasjon, kan iPSMG ikke-invasivt transplanteres i den immunodumpente musehjernen. Transplantert iPSMG dannet flertallet av mikroglia i hippocampus og cerebellum ved å okkupere den ledige nisjen i opptil 60 dager, men ikke i cortex.
De kritiske punktene for effektiv Tsn av iPSMG er (i) uttømming effektivitet av endogene mus mikroglia (ii) administrasjon av menneskelige cytokiner hver 12 h. Mikroglia opprettholder sitt eget territorium i hjernen. Effektiv uttømming av musmikroglia er nødvendig for å gi en nisje for engraftment av transplantert iPSMG. Når uttømming av endogene musmikroglia er utilstrekkelig, observeres ikke kolonisering av musen hippocampus og cerebellum av iPSMG. Levedyktigheten til mikroglia avhenger av CSF1R og TGFBR-signalering 19,21,22. hCSF1 rapporteres å selektivt øke levedyktigheten til human mikroglia, og hTGF-β1 er nødvendig for levedyktigheten av mikroglia samt demper betennelse når den administreres hver 12 h 21,23,24. I fravær av eksogene humane cytokiner observeres ikke iPSMG i musehjernen. Videre må det tas hensyn til ikke å mekanisk aktivere iPSMG ved overdreven pipettering eller på andre måter før Tsn, da det ugjenkallelig endrer iPSMG-egenskaper samt transplantasjonseffektivitet. Hvis tilfredsstillende Tsn av iPSMG ikke er sett, må levedyktigheten av iPSMG før transplantasjon samt uttømming av endogen mikroglia bestemmes. Hvis uttømming av endogene musmikroglia ikke er mer enn 90%, kan PLX5622 fôringstid endres for å øke uttømmingen.
Sammenlignet med en konvensjonell kirurgisk transplantasjonsmetode som er invasiv og krever ekstra utstyr og trening, tillater Tsn transplantasjon på en ikke-invasiv, enkel, stabil og enkel måte. I tillegg tillater denne metoden transplantasjon av iPSMG i immunotokmpente mushjerner; Dermed kan immunokokk sykdomsmodellmus brukes til å studere responsen til iPSMG.
Den største ulempen ved den nåværende metoden er den regionale heterogeniteten i engraftmentet av iPSMG. Hvis den hjerneregionspesifikke iPSMG-transplantasjonen er nødvendig, er den nåværende protokollen ikke egnet da den transplanterte iPSMG forblir engrafert i 60 dager bare i hippocampus og cerebellum, men ikke i cortex. Videre er behovet for å administrere eksogene menneskelige cytokiner intranasalt hver 12 h også en begrensning av den nåværende protokollen, da den krever omfattende arbeidskraft og er dyrt.
Til slutt er det gitt en detaljert protokoll for Tsn av iPSMG i hjernen til immunodumpente mus. Kombinert med farmakologisk ON/OFF av musmikroglia av PLX5622, tillater denne protokollen vellykket engraftment av iPSMG. Som transplanterte celler kan observeres i hippocampus og cerebellum i en vedvarende periode når eksogene cytokiner påføres, kan den nåværende metoden være verdifull for å evaluere rollen som menneskelig mikroglia i både fysiologiske og patologiske tilstander i disse regionene.

Mikroglia er en spesialisert populasjon av makrofaglignende celler i sentralnervesystemet (CNS) og spiller viktige roller i å kontrollere ulike hjernefunksjoner som nevral kretsutvikling, modulere nevrotransmisjon og opprettholde hjernens homeostase 1,2,3. Selv om murin mikroglia deler mange funksjoner med de fra mennesker, viser de artsspesifikke forskjeller. Dermed kan responsen av musmikroglia til ulike stimuli ikke alltid representere den til menneskelig mikroglia 4,5,6. Selv om mange studier har analysert menneskelig mikroglia, er disse eksperimentene begrenset til in vitro-studier. In vitro kultivert menneskelig mikroglia viser morfologiske trekk og genuttrykk som er svært forskjellige fra de in vivo. Dermed kan in vitro-eksperimenter ikke alltid kapitulere in vivo-egenskapene til menneskelig mikroglia. Derfor er det nødvendig med et eksperimentelt system for å studere menneskelig mikroglia in vivo.
Nylig, for å studere in vivo-egenskapene til human mikroglia, blir in vitro generert induserte pluripotente stamceller (iPSCer) - eller embryonale stamceller-avledet menneskelig mikroglia kirurgisk transplantert i mus hjerne 7,8,9,10,11,12,13,14. Ved hjelp av denne tilnærmingen har ulike in vivo-egenskaper av menneskelig mikroglia blitt karakterisert. Imidlertid er den utbredte bruken av denne metoden begrenset av to grunner. Først er kravet til immundefektende mus. For å studere rollen som menneskelig mikroglia i ulike nevrodegenerative sykdommer, må sykdomsmutasjonsbærende mus krysses inn i immunmangelmus, noe som krever betydelig tid og krefter. Videre, i ulike nevrologiske lidelser, perifere immunceller, som T-celler, kan modulere mikrogliale funksjoner 15,16,17. Derfor kan eksperimenter utført i immundefektende mus ikke representere bona fide egenskaper av menneskelig mikroglia in vivo. For det andre krever invasive operasjoner for å transplantere mikroglia ekstra utstyr og trening. Videre kan hjerneskade under invasiv transplantasjon endre mikrogliale fenotyper.
I denne protokollen er ikke-invasiv transnasal transplantasjon (Tsn) av iPSMG til immunotokmpente villtypemus beskrevet18. Ved å kombinere farmakologisk ON/OFF av en CSF1R-antagonist PLX5622 som tømmer endogen musmikroglia19 og Tsn, kan iPSMG ikke-invasivt transplanteres i musehjernen. Videre, med anvendelsen av eksogen menneskelig cytokin, forblir den transplanterte iPSMG levedyktig i 60 dager på en regionspesifikk måte uten immunsuppressiva.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN 93G</td>
			<td>Oriental Yeast Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 antibody</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>019&#8211;19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-STEM121 antibody</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>Y40410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>8019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen iPSMG</td>
			<td>Shionogi &#38; Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory for Drug Discovery and Disease Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>VETLI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Astellas</td>
			<td>18005A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30076028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLX5622</td>
			<td>Amadis Chemical</td>
			<td>A930097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming growth factor-&#946;1 (Tgf-b1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400-10</td>
			<td>antifade mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route

Mikroglia er den spesialiserte befolkningen av makrofaglignende celler i hjernen. De spiller viktige roller i både fysiologiske og patologiske hjernefunksjoner. Det meste av vår nåværende forståelse av mikroglia er basert på eksperimenter utført i musen. Menneskelig mikroglia er forskjellig fra musmikroglia, og dermed kan respons og egenskaper av musmikroglia ikke alltid representere den for menneskelig mikroglia. Videre, på grunn av etiske og tekniske vanskeligheter, er forskning på menneskelig mikroglia begrenset til in vitro kultursystem, som ikke kapitulerer in vivo egenskaper av mikroglia. For å overvinne disse problemene, en forenklet metode for ikke-invasivt transplantasjon indusert pluripotent stamcelle-avledet menneskelig mikroglia (iPSMG) inn i immunocompetent mus hjernen via en transnasal rute i kombinasjon med farmakologisk uttømming av endogene mikroglia ved hjelp av en kolonistimulerende faktor 1 reseptor (CSF1R) antagonist er utviklet. Denne protokollen gir en måte å ikke-invasivt transplantere celler inn i musehjernen og kan derfor være verdifull for å evaluere in vivo-rollen til menneskelig mikroglia i fysiologiske og patologiske hjernefunksjoner.

Denne teknikken gjør det mulig for undersøkeren å ikke-invasivt transplantere iPSMG inn i hippocampus og cerebellum, men ikke inn i cortex av musehjernen. Etter å ha fullført studien ble bedøvede mus utsatt for transkardiell perfusjon av iskald PBS (−), etterfulgt av iskald 4% (w / v) paraformaldehyd i PBS. Hjernene ble isolert, postfixed over natten i 4% (w / v) paraformaldehyd, og kryoprektert i en PBS som inneholder 30% (w / v) sukrose. Videre ble hjernen frosset i en innbyggingsforbindelse og seksjonert (20 μm tykke koronal seksjoner) på en kryostat. Seksjonene ble vasket tre ganger i PBS (−) (10 min hver) og gjennomsyret og blokkert med 0,5% (v / v) Triton X-100 i 10% normalt geitserum i 1 time. Seksjonene ble deretter inkubert med anti-menneskespesifikk cytoplasmamarkør, STEM121 (1:100) og anti-Iba1 (1:1000) i 5 dager. Deretter ble seksjonene vasket tre ganger med PBS (−) i 10 minutter hver og ble inkubert med sekundære antistoffer: Alexa Fluor 488-, eller 546-konjugert mus, eller kanin IgGs (1:1000) i 2 timer ved romtemperatur. Etter vask med PBS(-) tre ganger ble seksjoner montert på lysbilder ved hjelp av et antifade monteringsmedium. Et konfokalt mikroskop utstyrt med en 40x objektiv linse ble brukt til å skaffe fluorescensbilder. Levedyktigheten til iPSMG ved 2 måneder etter transplantasjon i hippocampus og cortex er vist i figur 1. Antall transplanterte celler kan bestemmes ved å telle celler som er positive for både menneskespesifikke antistoffer og pan-mikrogliale / monocyttmarkører, mens endogene musmikroglia bare er positive for panmikroglial / monocyttmarkør som tidligere beskrevet18. De transplanterte iPSMGs erstatter musmikroglia, viser ramifiserte morfologier i hippocampus, og oppdages ikke i cortex18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg"> Figur 1: Levedyktigheten til iPSMG i cortex og hippocampus etter Tsn. Det venstre panelet viser immunostaining med en pan-mikroglial / monocyttmarkør, Iba1 (grønn). Det midterste panelet viser immunostaining med menneskespesifikk cytoplasmamarkør STEM121 (rød). Høyre panel viser et sammenslått bilde av Iba1 og STEM121 immunostaining. (A) I kontrollmus ble bare musmikroglia (Iba1+/STEM121-) påvist i både cortex og hippocampus. (B) I iPSMG transplanterte mus, i cortex, ble bare musmikroglia (Iba1+/STEM121-) oppdaget, mens i hippocampus iPSMG (Iba1+/STEM121+) ble oppdaget. Pilene i bildet viser musmikroglia, mens pilspisser viser iPSMG. Et konfokalt mikroskop utstyrt med en 40x objektiv linse ble brukt til fluorescensbildeanskaffelse. Maksimal bildestørrelse: 1024 x 1024 piksler. Zoomfaktor: 2. Skalalinjer = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Protokollen som presenteres her tillater transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet menneskelig mikroglia (iPSMG) inn i hjernen via en transnasal rute i immunodumpente mus. Metoden for fremstilling og transnasal transplantasjon av celler og administrering av cytokinblanding for vedlikehold av iPSMG er vist.

Transplantasjon av human indusert pluripotent stamcelle-avledet mikroglia i immunompetent mus hjerne via ikke-invasiv transnasal rute

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Denne protokollen tillater en ikke-invasiv transplantasjon av iPSMG i immunokogen musehjerne ved å kombinere farmakologisk på/av av en CSF1-reseptorantagonist PLX5622 med transnasal transplantasjon. Den største fordelen med denne teknikken er at iPSMG kan transplanteres uten å indusere hjerneskade selv hos immunodumpente mus. Mikroglial transplantasjon kan tjene som en potensiell terapi for å utveksle dysfunksjonell mikroglia med funksjonelle i ulike nevrodegenerative sykdommer i fremtiden.Å demonstrere prosedyren vil være Bijay Parajuli, en forsker fra laboratoriet mitt. Begynn med å raskt tine de frosne induserte pluripotente stamcelleavledede humane mikrogliacellene i et 37-graders Celsius vannbad. Virvle prøvene til all synlig is har smeltet.Legg den tinte iPSMG til kulturmediene, oppvarmet til 37 grader Celsius. Legg til en milliliter celler til 10 milliliter kulturmedier. Sentrifuger cellene ved 300 ganger g i fem minutter for å få en cellepellet.Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. Tilsett transplantasjonsmediet for å oppnå en cellekonsentrasjon på 10 til de femte cellene per mikroliter. Plasser iPSMG på is, og fortsett umiddelbart til transplantasjon.For å forberede mus til transnasal transplantasjon, mate de mannlige musene med en diett som inneholder PLX i syv dager. På slutten av den syvende dagen, stopp PLX-dietten og mate musene med et normalt kosthold. En time før transnasal transplantasjon av iPSMG, administrere 2,5 mikroliter hyaluronidase i PBS til hvert nesebor to ganger ved hjelp av en 10-mikroliter pipettespiss for å øke permeabiliteten til neseslimhinnen.Plasser musene i liggende stilling etter hyaluronidase-applikasjonen. Administrer 2,5 mikroliter hyaluronidase ti minutter før transnasal transplantasjon av iPSMG. Påfør 2,5 mikroliter cellefjæring i ett nesebor på musen ved hjelp av en pipettespiss på 10 mikroliter.Plasser musen i liggende stilling i fem minutter før administrering av cellefjæring til det andre neseboret. Administrer cellefjæringen fire ganger, og bruk et totalt volum på 20 mikroliter per dyr. 48 timer etter opphør av PLX-fôring, gjenta administrasjonen av hyaluronidase og celle suspensjon på de samme musene.For administrering av cytokiner, bruk 2,5 mikroliter av transplantasjonsmediet i ett nesebor av musen ved hjelp av en 10-mikroliter pipettespiss. Etter to måneder med transnasal transplantasjon kan antall transplanterte celler bestemmes ved å telle celler som er positive for både menneskespesifikke og pan-mikrogliale markører. Endogene musmikroglia er kun positive for panmikroglial markør.I kontrollmus ble bare musmikroglia oppdaget i både cortex og hippocampus. I cortex av iPSMG transplanterte mus ble bare musmikroglia oppdaget, mens i hippocampus iPSMG ble oppdaget. Når du prøver denne protokollen, er fullstendig fjerning av supernatant viktig for å forhindre fortynning av cytokiner.Det er viktig å bruke cytokin hver 12. Uttømming av endogene musmikroglia er nødvendig for transplantasjon av iPSMG. Denne prosedyren tillater transplantasjon av iPSMG i en normal eller syk musehjerne.Dermed kan karakteristikken til iPSMG samt responsen på sykdom bestemmes. Denne teknikken er egnet til å bestemme in vivo karakteristisk for iPSMG i musehjernen. Dermed vil transplantasjon av iPSMG til sykdomsmodellmus hjelpe oss med å forstå responsen og kan bane vei for et nytt terapeutisk mål.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika virusinfeksjon på utvikle menneskelige hjerne In Vitro bruke stilk cellen avledet Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metode for høyhastighets strekk skade av menneskelige indusert Pluripotent Stamcelle-avledet Neurons i 96-brønnen Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differensiering Replating av Human pluripotent Stem Cell-avledet neurons for High-Content screening av Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migrasjon, kjemo-attraksjon og co-kultur analyser for menneskelige stamcelle-avledet endotelceller og GABAergic Nevroner

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysere mitokondrietransport og morfologi i humant indusert pluripotente stamcelleavledede nevroner i arvelig spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Få humanmikroglia fra voksent menneskelig hjernevev

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Avledning, utvidelse, kryopreservasjon og karakterisering av mikrovaskulære endotelceller fra humane induserte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinal transplantasjon av humant embryonalt stamcelleavledet retinalvev i en katt stor dyremodell

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Flowcytometrisk analyse av multiple mitokondrielle parametere i humaninduserte pluripotente stamceller og deres nevrale og gliaderivater

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...