Name: transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Bidragssponsorer: Denna studie stöddes av JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), Mitsubishi Science Foundation (SK), Takeda Science Foundation (SK) och ett Frontier Brain Science Grant från University of Yamanashi (SK).

Alla djur som användes i denna studie erhölls, inhystes, vårdades och användes i enlighet med "Guiding Principles in the Care and Use of Animals in the Field of Physiologic Sciences" publicerad av Physiologic Society of Japan20, och med tidigare godkännande av djurvårdskommittén vid University of Yamanashi (Yamanashi, Japan).
1. Beredning av cellmedium, transplantationsmedium och anestesiblandning
<ol><li>Förbered cellmediet genom att tillsätta 10% fetalt bovint serum och 0,1% penicillin / streptomycin i DMEM.</li>
	<li>Förbered transplantationsmediet genom att tillsätta hCSF1 (250 ng/ml) och hTGF-β1 (100 ng/ml) till cellmediet.</li>
	<li>Förbered anestesiblandningen för intraperitoneal injektion genom att blanda 0,45 ml medetomidinhydroklorid, 1,2 ml midazolam och 1,5 ml butorfanoltartrat i 11,8 ml normal saltlösning.</li>
</ol>2. Beredning av iPSMG
OBS: Fryst iPSMG (materialtabell) förvarades vid -80 °C fram till användning.
<ol><li>Tina de frusna cellerna snabbt i ett 37 °C vattenbad. Virvla proverna tills all synlig is har smält.</li>
	<li>Tillsätt den tinade iPSMG till odlingsmediet som värmts till 37 °C. Tillsätt 1 ml tinade celler som innehåller medium (1 × 106 celler) till 10 ml odlingsmediet.</li>
	<li>Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min för att erhålla en cellpellets.</li>
	<li>Efter centrifugering, ta bort allt supernatant utan att störa cellpelleten. Fullständigt avlägsnande av supernatant är önskvärt för att minska utspädningen av cytokinkoncentrationen i transplantationsmediet.</li>
	<li>Tillsätt transplantationsmediet för att erhålla en cellkoncentration på 1 x 105 celler/μl.</li>
	<li>Placera iPSMG på is och fortsätt omedelbart till transplantation. OBS: Beredning av iPSMG för transplantation utförs på en ren bänk för att undvika kontaminering.</li>
</ol>3. Beredning av mus för transnasal transplantation (Tsn)
<ol><li>Mata de vilda hanmössen (C57BL /6J, 8 veckor gamla) med PLX5622 som innehåller kost i 7 dagar.</li>
	<li>I slutet av den 7: e dagen, sluta PLX-dieten och mata mössen med en normal diet till slutet av studien. OBS: PLX5622 innehållande diet bereds genom tillsats av 1,2 g PLX5622 i 1 kg AIN-93G (materialtabell).</li>
</ol>4. Transnasal transplantation av celler
<ol><li>24 timmar efter upphörandet av PLX-utfodring, väga mössen och bedöva dem med en intraperitoneal injektion av anestesiblandningen (0,2 ml/20 g).</li>
	<li>Efter att mössen har sövts fullständigt, vilket bedöms utifrån att pedaluttagsreflexen inte svarar (fast tånypa), administrera 2,5 μl hyaluronidas i PBS (100 U/ml) vid 1 timme före Tsn av iPSMG till varje näsborre två gånger med hjälp av en 10 μL pipettspets för att öka permeabiliteten i nässlemhinnan.</li>
	<li>Efter applicering av hyaluronidas, placera mössen i ryggläge.</li>
	<li>Upprepa steg 4.2 10 min före transnasal transplantation av iPSMG.</li>
	<li>Applicera 2,5 μl cellsuspension i en näsborre på musen med en 10 μL pipettspets.</li>
	<li>Placera musen i ryggläge i 5 minuter innan cell suspensionen administreras till den andra näsborren.</li>
	<li>Upprepa steg 4.5 och 4.6 fyra gånger med en total volym på 20 μl per djur.</li>
	<li>Placera musen i ryggläge på en värmedyna på 37 °C tills den återhämtar sig från anestesi.</li>
	<li>Vid 48 h efter upphörandet av PLX-utfodring, upprepa steg 4.1-4.7 på samma möss igen. OBS: Det bör noteras att iPSMG placeras på is under transplantationen.</li>
</ol>5. Applicering av cytokiner
<ol><li>Bedöva mössen genom en intraperitoneal injektion av anestesiblandning (0,2 ml/20 g).</li>
	<li>Applicera 2,5 μl av transplantationsmediet i en näsborre på musen med en 10 μl pipettspets.</li>
	<li>Placera musen i ryggläge i 5 minuter innan du administrerar transplantationsmediet till den andra näsborren.</li>
	<li>Upprepa steg 5.2 och 5.3 fyra gånger med en total volym på 20 μl per djur. OBS: Det bör noteras att transnasal administrering av transplantationsmedium (humana cytokiner) krävs var 12: e timme för livskraften hos transplanterad iPSMG till slutet av studien.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Hasselmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+chimeric+model+to+study+and+manipulate+human+microglia+in+vivo.">Development of a chimeric model to study and manipulate human microglia in vivo.</a> Neuron. 103 (6), 1016-1033 (2019).</li><li>Mancuso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-derived+human+microglia+transplanted+in+mouse+brain+to+study+human+disease.">Stem-cell-derived human microglia transplanted in mouse brain to study human disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2111-2116 (2019).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells.">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li><li>Schetters, S. T. T., Gomez-Nicola, D., Garcia-Vallejo, J. J., Van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+Microglia+and+T+cells+get+ready+to+tango.">Neuroinflammation: Microglia and T cells get ready to tango.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1905 (2017).</li><li>Sulzer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+from+patients+with+Parkinson's+disease+recognize+alpha-synuclein+peptides.">T cells from patients with Parkinson's disease recognize alpha-synuclein peptides.</a> Nature. 546 (7660), 656-661 (2017).</li><li>Togo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+T+cells+in+the+brain+of+Alzheimer's+disease+and+other+neurological+diseases.">Occurrence of T cells in the brain of Alzheimer's disease and other neurological diseases.</a> Journal of Neuroimmunology. 124 (1), 83-92 (2002).</li><li>Parajuli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia+to+the+brain+of+immunocompetent+mice.">Transnasal transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia to the brain of immunocompetent mice.</a> Glia. 69 (10), 2332-2348 (2021).</li><li>Elmore, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-stimulating+factor+1+receptor+signaling+is+necessary+for+microglia+viability,+unmasking+a+microglia+progenitor+cell+in+the+adult+brain.">Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain.</a> Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).</li><li>Zasshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+principles+for+the+care+and+use+of+animals+in+the+field+of+physiological+sciences.">Guiding principles for the care and use of animals in the field of physiological sciences.</a> Journal of the Physiologic Society of Japan. 64 (7-8), 143-146 (2002).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+requirements+for+microglial+survival,+specification,+and+function+revealed+by+defined-medium+cultures.">Diverse requirements for microglial survival, specification, and function revealed by defined-medium cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+unique+TGF-beta-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia.">Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nature Neuroscience. 17 (1), 131-143 (2014).</li><li>Regateiro, F. S., Howie, D., Cobbold, S. P., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+in+transplantation+tolerance.">TGF-beta in transplantation tolerance.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 660-669 (2011).</li><li>Yoshimura, A., Muto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+function+in+immune+suppression.">TGF-beta function in immune suppression.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 350, 127-147 (2011).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Protokollet beskriver här den icke-invasiva transplantationen av iPSMG i mushjärnan. Det unika med det nuvarande protokollet är att genom att kombinera farmakologiska PLX ON/OFF-metoder och intranasal transplantation kan iPSMG icke-invasivt transplanteras in i den immunkompetenta mushjärnan. Transplanterad iPSMG bildade majoriteten av mikroglia i hippocampus och cerebellum genom att ockupera den lediga nischen i upp till 60 dagar men inte i cortex.
De kritiska punkterna för effektiv Tsn av iPSMG är (i) utarmningseffektivitet hos endogen musmikroglia (ii) administrering av humana cytokiner var 12: e timme. Microglia behåller sitt eget territorium i hjärnan. Effektiv utarmning av musmikroglia krävs för att tillhandahålla en nisch för engraftment av transplanterad iPSMG. När utarmningen av endogena musmikroglia är otillräcklig observeras inte kolonisering av musen hippocampus och cerebellum av iPSMG. Mikroglias livskraft beror på CSF1R- och TGFBR-signalering 19,21,22. hCSF1 rapporteras selektivt öka livskraften hos human mikroglia, och hTGF-β1 krävs för livskraften hos mikroglia samt dämpar inflammation vid administrering var 12: etimme 21,23,24. I frånvaro av exogena humana cytokiner observeras inte iPSMG i mushjärnan. Vidare måste man vara försiktig så att iPSMG inte aktiveras mekaniskt genom överdriven pipettering eller på något annat sätt före Tsn, eftersom det oåterkalleligt förändrar iPSMG-egenskaper såväl som transplantationseffektivitet. Om tillfredsställande Tsn för iPSMG inte ses, måste livskraften hos iPSMG före transplantation samt utarmningen av endogen mikroglia bestämmas. Om utarmningen av endogen musmikroglia inte är mer än 90% kan PLX5622 matningstiden ändras för att öka utarmningen.
Jämfört med en konventionell kirurgisk transplantationsmetod som är invasiv och kräver ytterligare utrustning och utbildning, tillåter Tsn transplantation på ett icke-invasivt, enkelt, stabilt och enkelt sätt. Dessutom möjliggör denna metod transplantation av iPSMG till immunkompetenta mösshjärnor; således kan immunkompetenta sjukdomsmodellmöss användas för att studera svaret från iPSMG.
Den största nackdelen med den nuvarande metoden är den regionala heterogeniteten i engraftmentet av iPSMG. Om den hjärnregionspecifika iPSMG-transplantationen krävs är det aktuella protokollet inte lämpligt eftersom den transplanterade iPSMG förblir ingraferad i 60 dagar endast i hippocampus och lillhjärnan men inte i cortex. Vidare är behovet av att administrera exogena humana cytokiner intranasalt var 12: e timme också en begränsning av det nuvarande protokollet eftersom det kräver omfattande arbete och är dyrt.
Sammanfattningsvis tillhandahålls ett detaljerat protokoll för Tsn av iPSMG i hjärnan hos immunkompetenta möss. I kombination med farmakologisk ON/OFF av musmikroglia av PLX5622 möjliggör detta protokoll framgångsrik engraftment av iPSMG. Eftersom transplanterade celler kan observeras i hippocampus och cerebellum under en längre tid när exogena cytokiner appliceras, kan den nuvarande metoden vara värdefull för att utvärdera rollen som human mikroglia i både fysiologiska och patologiska tillstånd i dessa regioner.

Microglia är en specialiserad population av makrofagliknande celler i centrala nervsystemet (CNS) och spelar viktiga roller för att kontrollera olika hjärnfunktioner som neural kretsutveckling, modulerande neurotransmission och upprätthållande av hjärnans homeostas 1,2,3. Även om murina mikroglia delar många funktioner med sådana från människor, visar de artspecifika skillnader. Således kan svaret från musmikroglia till olika stimuli inte alltid representera det hos humant mikroglia 4,5,6. Även om många studier har analyserat human mikroglia, är dessa experiment begränsade till in vitro-studier. In vitro-odlade mänskliga mikroglia visar morfologiska egenskaper och genuttryck som skiljer sig mycket från dem in vivo. Således kan in vitro-experiment inte alltid kapitulera in vivo-egenskaperna hos human mikroglia. Därför behövs ett experimentellt system för att studera human mikroglia in vivo.
Nyligen, för att studera in vivo-egenskaperna hos human mikroglia, transplanteras in vitro-genererade inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) - eller embryonala stamceller-härledda humana mikrogliakirurgiskt i mösshjärna 7,8,9,10,11,12,13,14. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har olika in vivo-egenskaper hos human mikroglia karakteriserats. Den utbredda användningen av denna metod är dock begränsad av två skäl. Först är kravet på immunbristmöss. För att studera rollen som mänsklig mikroglia i olika neurodegenerativa sjukdomar måste sjukdomsmutationsbärande möss korsas till immunbristmöss, vilket kräver betydande tid och ansträngning. Vidare kan perifera immunceller, som T-celler, vid olika neurologiska störningar modulera mikrogliafunktioner 15,16,17. Därför kan experiment som utförs på immunbristmöss inte representera bona fide egenskaper hos human mikroglia in vivo. För det andra kräver invasiva operationer för att transplantera mikroglia ytterligare utrustning och utbildning. Vidare kan hjärnskada under invasiv transplantation förändra mikrogliala fenotyper.
I detta protokoll beskrivs icke-invasiv transnasal transplantation (Tsn) av iPSMG till immunkompetenta vildtypsmöss18. Genom att kombinera farmakologisk ON/OFF av en CSF1R-antagonist PLX5622 som utarmar endogena musmikroglia19 och Tsn kan iPSMG icke-invasivt transplanteras in i mushjärnan. Vidare, med applicering av exogent humant cytokin, förblir den transplanterade iPSMG livskraftig i 60 dagar på ett regionspecifikt sätt utan några immunsuppressiva medel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN 93G</td>
			<td>Oriental Yeast Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 antibody</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>019&#8211;19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-STEM121 antibody</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>Y40410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>8019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen iPSMG</td>
			<td>Shionogi &#38; Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory for Drug Discovery and Disease Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>VETLI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Astellas</td>
			<td>18005A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30076028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLX5622</td>
			<td>Amadis Chemical</td>
			<td>A930097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming growth factor-&#946;1 (Tgf-b1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400-10</td>
			<td>antifade mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route

Microglia är den specialiserade populationen av makrofagliknande celler i hjärnan. De spelar viktiga roller i både fysiologiska och patologiska hjärnfunktioner. Det mesta av vår nuvarande förståelse av mikroglia är baserad på experiment utförda i musen. Human microglia skiljer sig från musmikroglia, och därmed kanske inte alltid respons och egenskaper hos musmikroglia representerar den hos mänsklig mikroglia. Vidare, på grund av etiska och tekniska svårigheter, är forskning på human mikroglia begränsad till in vitro-odlingssystem , som inte kapitulerar in vivo-egenskaper hos microglia. För att övervinna dessa problem utvecklas en förenklad metod för att icke-invasivt transplantera inducerad pluripotent stamcells-härledd human mikroglia (iPSMG) i den immunkompetenta mösshjärnan via en transnasal väg i kombination med farmakologisk utarmning av endogen mikroglia med hjälp av en kolonistimulerande faktor 1-receptor (CSF1R) -antagonist. Detta protokoll ger ett sätt att icke-invasivt transplantera celler i mushjärnan och kan därför vara värdefullt för att utvärdera in vivo-rollen för mänsklig mikroglia i fysiologiska och patologiska hjärnfunktioner.

Denna teknik gör det möjligt för utredaren att icke-invasivt transplantera iPSMG i hippocampus och cerebellum men inte i cortex i mushjärnan. Efter avslutad studie utsattes sövda möss för transkardiell perfusion av iskall PBS(−), följt av iskall 4% (w/v) paraformaldehyd i PBS. Hjärnorna isolerades, postfixerades över natten i 4% (w / v) paraformaldehyd och kryoskyddades i en PBS innehållande 30% (w / v) sackaros. Vidare frystes hjärnorna i en inbäddningsförening och delades (20 μm tjocka koronala sektioner) på en kryostat. Sektionerna tvättades tre gånger i PBS(−) (10 min vardera) och permeabiliserades och blockerades med 0,5% (v/v) Triton X-100 i 10% normalt getserum i 1 h. Sektionerna inkuberades sedan med anti-humanspecifik cytoplasmmarkör, STEM121 (1:100) och anti Iba1 (1:1000) i 5 dagar. Därefter tvättades sektionerna tre gånger med PBS(−) i 10 min vardera och inkuberades med sekundära antikroppar: Alexa Fluor 488-, eller 546-konjugerad mus eller kanin-IgG (1:1000) i 2 timmar vid rumstemperatur. Efter tvättning med PBS(-) tre gånger monterades sektioner på glidbanor med hjälp av ett antifade monteringsmedium. Ett konfokalmikroskop utrustat med en 40x objektivlins användes för att få fluorescensbilder. Livskraften hos iPSMG vid 2 månader efter transplantation i hippocampus och cortex visas i figur 1. Antalet transplanterade celler kan bestämmas genom att räkna celler som är positiva för både humanspecifika antikroppar och pan-mikrogliala/ monocytmarkörer, medan endogena musmikroglia endast är positiva för pan-mikroglial / monocytmarkör som tidigarebeskrivits 18. De transplanterade iPSMG:erna ersätter musmikroglia, visar förgrenade morfologier i hippocampus och detekteras inte i cortex18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg"> Figur 1: Livskraften hos iPSMG i cortex och hippocampus vid 2 månader efter Tsn. Den vänstra panelen visar immunfärgning med en pan-mikroglial / monocytmarkör, Iba1 (grön). Den mellersta panelen visar immunfärgning med humanspecifik cytoplasmmarkör STEM121 (röd). Den högra panelen visar en sammanslagen bild av Iba1 och STEM121 immunfärgning. (A) Hos kontrollmöss påvisades endast musmikroglia (Iba1+/STEM121-) i både cortex och hippocampus. (B) Hos iPSMG-transplanterade möss, i cortex, detekterades endast musmikroglia (Iba1+/STEM121-), medan i hippocampus iPSMG (Iba1+/STEM121+) detekterades. Pilarna i bilden visar musmikroglia, medan pilspetsar visar iPSMG. Ett konfokalmikroskop utrustat med en 40x objektivlins användes för fluorescensbildförvärv. Maximal bildstorlek: 1024 x 1024 pixlar. Zoomfaktor: 2. Skalstreck = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Protokollet som presenteras här tillåter transplantation av inducerad pluripotent stamcells-härledd human mikroglia (iPSMG) i hjärnan via en transnasal väg hos immunkompetenta möss. Metoden för beredning och transnasal transplantation av celler och administrering av cytokinblandning för upprätthållande av iPSMG visas.

Transplantation av human inducerad pluripotent stamcells-härledd mikroglia i immunkompetenta mösshjärna via icke-invasiv transnasal väg

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Detta protokoll möjliggör en icke-invasiv transplantation av iPSMG till immunkompetent mushjärna genom att kombinera farmakologisk på /av av av en CSF1-receptorantagonist PLX5622 med transnasal transplantation. Den största fördelen med denna teknik är att iPSMG kan transplanteras utan att inducera hjärnskador även hos immunkompetenta möss. Mikroglial transplantation kan fungera som en potentiell terapi för att utbyta dysfunktionell mikroglia med funktionella vid olika neurodegenerativa sjukdomar i framtiden.Demonstrerar proceduren kommer att vara Bijay Parajuli, en forskare från mitt laboratorium. Börja med att snabbt tina de frusna inducerade pluripotenta stamcellshärledda mänskliga mikrogliacellerna i ett 37-graders Celsius vattenbad. Virvla proverna tills all synlig is har smält.Tillsätt den tinade iPSMG till odlingsmediet, värmt till 37 grader Celsius. Tillsätt en milliliter celler till 10 ml odlingsmedier. Centrifugera cellerna vid 300 gånger g i fem minuter för att erhålla en cellpellet.Ta bort supernatanten utan att störa cellpelleten. Tillsätt transplantationsmediet för att erhålla en cellkoncentration på 10 till de femte cellerna per mikroliter. Placera iPSMG på is och fortsätt omedelbart till transplantation.För att förbereda möss för transnasal transplantation, mata hanmössen med en diet som innehåller PLX i sju dagar. I slutet av den sjunde dagen, sluta PLX-dieten och mata mössen med en normal diet. En timme före transnasal transplantation av iPSMG, administrera 2,5 mikroliter hyaluronidas i PBS till varje näsborre två gånger med en 10-mikroliterpipettspets för att öka permeabiliteten i nässlemhinnan.Placera mössen i ryggläge efter hyaluronidasapplikationen. Administrera 2,5 mikroliter hyaluronidas tio minuter före transnasal transplantation av iPSMG. Applicera 2,5 mikroliter cellsuspension i en näsborre på musen med en 10-mikroliterpipettspets.Placera musen i ryggläge i fem minuter innan cell suspensionen till den andra näsborren administreras. Administrera cellsuspensionen fyra gånger och applicera en total volym på 20 mikroliter per djur. 48 timmar efter upphörandet av PLX-utfodring, upprepa administreringen av hyaluronidas och cellsuspension på samma möss.För administrering av cytokiner, applicera 2,5 mikroliter av transplantationsmediet i en näsborre på musen med en 10-mikroliterpipettspets. Efter två månaders transnasal transplantation kan antalet transplanterade celler bestämmas genom att räkna celler som är positiva för både humanspecifika och pan-mikrogliala markörer. Endogena musmikroglia är endast positiva för pan-mikroglial markör.Hos kontrollmöss upptäcktes endast musmikroglia i både cortex och hippocampus. I cortex av iPSMG-transplanterade möss detekterades endast musmikroglia, medan i hippocampus detekterades iPSMG. När du försöker detta protokoll är fullständigt avlägsnande av supernatant viktigt för att förhindra utspädning av cytokiner.Det är viktigt att applicera cytokin var 12: e timme för livskraften hos transplanterade celler. Utarmning av endogen musmikroglia krävs för transplantation av iPSMG. Denna procedur möjliggör transplantation av iPSMG till en normal eller sjuk mushjärna.Således kan karakteristisk för iPSMG såväl som svaret på sjukdom bestämmas. Denna teknik är lämplig för att bestämma in vivo-egenskapen hos iPSMG i mushjärnan. Således kommer transplantation av iPSMG till sjukdomsmodellmöss att hjälpa oss att förstå svaret och kan bana väg för ett nytt terapeutiskt mål.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Låg-stress Route lärande Använda Lashley III Maze hos möss

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion av utveckla mänskliga hjärnan In Vitro med stamceller härstammar Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metod för hög hastighet Stretch skada av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived nervceller i en 96-väl Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Efter differentiering Replating av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening av Neuritogenes och synapsen mognad

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction och Co-Kultur Analyser för humanstamcells-härledda endotelceller och GABAergic nervceller

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysera mitokondriell transport och morfologi i mänskliga inducerad pluripotent stamcell-härledda nervceller i ärftliga spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Erhålla mänskliga Microglia från Vuxna mänskliga hjärnvävnaden

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Härledning, expansion, kryopreservation och karakterisering av hjärnans mikrovaskulära endotelceller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Subretinal transplantation av mänsklig embryonal stamcellsderiverad näthinnevävnad i en kattmodell för stora djur

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Flödescytometrisk analys av flera mitokondriella parametrar i humaninducerade pluripotenta stamceller och deras neurala och glialderivat

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...