Name: transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Hibe sponsorları: Bu çalışma JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), Mitsubishi Bilim Vakfı (SK), Takeda Bilim Vakfı (SK) ve Yamanashi Üniversitesi'nden (SK) Frontier Brain Science Grant tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar, Japonya Fizyoloji Derneği20 tarafından yayınlanan "Fizyolojik Bilimler Alanında Hayvanların Bakımı ve Kullanımında Yol Gösterici İlkeler" e uygun olarak ve Yamanashi Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nin daha önce onayı ile elde edilmiş, barındırılmış, bakımı yapılmış ve kullanılmıştır (Yamanashi, Japonya).
1. Hücre ortamı, transplantasyon ortamı ve anestezi karışımının hazırlanması
<ol><li>DMEM'e %10 fetal sığır serumu ve %0.1 penisilin/streptomisin ekleyerek hücre ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Hücre ortamına hCSF1 (250 ng/mL) ve hTGF-β1 (100 ng/mL) ekleyerek transplantasyon ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Anestezi karışımını intraperitoneal enjeksiyon için 0.45 mL medetomidin hidroklorür, 1.2 mL midazolam ve 1.5 mL butorphanol tartarat 11.8 mL normal salin içinde karıştırarak hazırlayın.</li>
</ol>2. iPSMG'nin hazırlanması
NOT: Dondurulmuş iPSMG (Malzeme Tablosu) kullanıma kadar -80 °C'de tutulmuştur.
<ol><li>Donmuş hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözün. Tüm görünür buzlar eriyene kadar örnekleri döndürün.</li>
	<li>Çözülmüş iPSMG'yi 37 °C'ye ısıtılmış kültür ortamına ekleyin. Kültür ortamının 10 mL'sine ortam içeren 1 mL çözülmüş hücre (1 × 106 hücre) ekleyin.</li>
	<li>Bir hücre peleti elde etmek için hücreleri 300 x g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini rahatsız etmeden tüm süpernatantları çıkarın. Transplantasyon ortamındaki sitokin konsantrasyonunun seyreltilmesini azaltmak için süpernatantın tamamen çıkarılması arzu edilir.</li>
	<li>1 x 105 hücre/μL'lik bir hücre konsantrasyonu elde etmek için transplantasyon ortamını ekleyin.</li>
	<li>İPSMG'yi buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin. NOT: Transplantasyon için iPSMG hazırlanması, kontaminasyonu önlemek için temiz bir tezgahta gerçekleştirilir.</li>
</ol>3. Transnazal transplantasyon için farenin hazırlanması (Tsn)
<ol><li>Vahşi tip erkek fareleri (C57BL / 6J, 8 haftalık) 7 gün boyunca PLX5622 içeren diyetle besleyin.</li>
	<li>7. günün sonunda, PLX diyetini durdurun ve fareleri çalışmanın sonuna kadar normal bir diyetle besleyin. NOT: PLX5622 içeren diyet, 1 kg AIN-93G'ye (Malzeme Tablosu) 1.2 g PLX5622 eklenerek hazırlanır.</li>
</ol>4. Transnazal hücre nakli
<ol><li>PLX beslemesinin kesilmesinden 24 saat sonra, fareleri tartın ve anestezi karışımının intraperitoneal enjeksiyonunu (0.2 mL / 20 g) kullanarak anestezi yapın.</li>
	<li>Fareler, pedal çekme refleksine (sert ayak parmağı sıkışması) yanıt vermeme ile değerlendirildiği gibi tamamen uyuşturulduktan sonra, burun mukozasının geçirgenliğini arttırmak için 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak her burun deliğine iPSMG'nin Tsn'sinden önce 1 saatte PBS'de (100 U / mL) 2.5 μL hyaluronidaz uygulayın.</li>
	<li>Hyaluronidaz uygulamasından sonra, fareleri sırtüstü pozisyona getirin.</li>
	<li>iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan 10 dakika önce adım 4.2'yi tekrarlayın.</li>
	<li>10 μL'lik pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2,5 μL hücre süspansiyonu uygulayın.</li>
	<li>Diğer burun deliğine hücre süspansiyonu uygulanmadan önce fareyi 5 dakika boyunca sırtüstü pozisyonda yerleştirin.</li>
	<li>4,5 ve 4,6 numaralı adımları dört kez tekrarlayın ve hayvan başına toplam 20 μL hacim uygulayın.</li>
	<li>Anesteziden kurtulana kadar fareyi 37 °C'lik bir ısı yastığına sırtüstü pozisyonda yerleştirin.</li>
	<li>PLX beslemesinin kesilmesinden 48 saat sonra, aynı farelerde 4.1-4.7 adımlarını bir kez daha tekrarlayın. NOT: Transplantasyon sırasında iPSMG'nin buz üzerine yerleştirildiğine dikkat edilmelidir.</li>
</ol>5. Sitokinlerin uygulanması
<ol><li>Fareleri intraperitoneal anestezi karışımı enjeksiyonu (0.2 mL / 20 g) ile anestezi altına alın.</li>
	<li>10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak nakil ortamının 2,5 μL'sini farenin bir burun deliğine uygulayın.</li>
	<li>Transplantasyon ortamını diğer burun deliğine uygulamadan önce fareyi 5 dakika boyunca sırtüstü pozisyonda tutun.</li>
	<li>5,2 ve 5,3 numaralı adımları dört kez yineleyin ve hayvan başına toplam 20 μL hacim uygulayın. NOT: Transplantasyon ortamının (insan sitokinleri) transnazal uygulamasının, transplante edilen iPSMG'nin çalışmanın sonuna kadar yaşayabilirliği için her 12 saatte bir gerekli olduğu unutulmamalıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+side+of+microglia.">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>Hasselmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+chimeric+model+to+study+and+manipulate+human+microglia+in+vivo.">Development of a chimeric model to study and manipulate human microglia in vivo.</a> Neuron. 103 (6), 1016-1033 (2019).</li><li>Mancuso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-derived+human+microglia+transplanted+in+mouse+brain+to+study+human+disease.">Stem-cell-derived human microglia transplanted in mouse brain to study human disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2111-2116 (2019).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells.">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li><li>Schetters, S. T. T., Gomez-Nicola, D., Garcia-Vallejo, J. J., Van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+Microglia+and+T+cells+get+ready+to+tango.">Neuroinflammation: Microglia and T cells get ready to tango.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1905 (2017).</li><li>Sulzer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+from+patients+with+Parkinson's+disease+recognize+alpha-synuclein+peptides.">T cells from patients with Parkinson's disease recognize alpha-synuclein peptides.</a> Nature. 546 (7660), 656-661 (2017).</li><li>Togo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+T+cells+in+the+brain+of+Alzheimer's+disease+and+other+neurological+diseases.">Occurrence of T cells in the brain of Alzheimer's disease and other neurological diseases.</a> Journal of Neuroimmunology. 124 (1), 83-92 (2002).</li><li>Parajuli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia+to+the+brain+of+immunocompetent+mice.">Transnasal transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia to the brain of immunocompetent mice.</a> Glia. 69 (10), 2332-2348 (2021).</li><li>Elmore, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-stimulating+factor+1+receptor+signaling+is+necessary+for+microglia+viability,+unmasking+a+microglia+progenitor+cell+in+the+adult+brain.">Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain.</a> Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).</li><li>Zasshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+principles+for+the+care+and+use+of+animals+in+the+field+of+physiological+sciences.">Guiding principles for the care and use of animals in the field of physiological sciences.</a> Journal of the Physiologic Society of Japan. 64 (7-8), 143-146 (2002).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+requirements+for+microglial+survival,+specification,+and+function+revealed+by+defined-medium+cultures.">Diverse requirements for microglial survival, specification, and function revealed by defined-medium cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+unique+TGF-beta-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia.">Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nature Neuroscience. 17 (1), 131-143 (2014).</li><li>Regateiro, F. S., Howie, D., Cobbold, S. P., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+in+transplantation+tolerance.">TGF-beta in transplantation tolerance.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 660-669 (2011).</li><li>Yoshimura, A., Muto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+function+in+immune+suppression.">TGF-beta function in immune suppression.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 350, 127-147 (2011).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Buradaki protokol, iPSMG'nin fare beynine non-invaziv transplantasyonunu açıklamaktadır. Mevcut protokolün benzersizliği, farmakolojik PLX ON / OFF yöntemlerini ve intranazal transplantasyonu birleştirerek, iPSMG'nin immünkompetan fare beynine invaziv olmayan bir şekilde nakledilebilmesidir. Nakledilen iPSMG, hipokampus ve beyincikteki mikroglia'nın çoğunluğunu, boş nişi 60 güne kadar işgal ederek oluşturdu, ancak kortekste değil.
iPSMG'nin verimli Tsn'si için kritik noktalar (i) endojen fare mikrogliasının tükenme verimliliği (ii) her 12 saatte bir insan sitokinlerinin uygulanmasıdır. Mikroglia beyinde kendi bölgelerini korur. Transplante edilen iPSMG'nin engraftasyonu için bir niş sağlamak için fare mikrogliasının verimli bir şekilde tükenmesi gerekir. Endojen fare mikrogliasının tükenmesi yetersiz olduğunda, fare hipokampusunun ve beyinciğin iPSMG tarafından kolonizasyonu gözlenmez. Mikroglia'nın yaşayabilirliği CSF1R ve TGFBR sinyallerinin19,21,22'ye bağlıdır. hCSF1'in insan mikrogliasının canlılığını seçici olarak arttırdığı bildirilmiştir ve hTGF-β1, mikroglia'nın yaşayabilirliği için gereklidir ve her 12 saatte bir21,23,24 uygulandığında iltihabı azaltır. Eksojen insan sitokinlerinin yokluğunda, iPSMG fare beyninde gözlenmez. Ayrıca, iPSMG'yi aşırı pipetleme veya Tsn'den önce başka herhangi bir yolla mekanik olarak aktive etmemeye özen gösterilmelidir, çünkü iPSMG özelliklerini ve transplantasyon verimliliğini geri dönülmez bir şekilde değiştirir. İPSMG'nin tatmin edici Tsn'si görülmezse, transplantasyondan önce iPSMG'nin yaşayabilirliği ve endojen mikroglianın tükenmesi belirlenmelidir. Endojen fare mikrogliasının tükenmesi% 90'dan fazla değilse, PLX5622 besleme süresi tükenmeyi arttırmak için değiştirilebilir.
İnvaziv olan ve ek ekipman ve eğitim gerektiren geleneksel bir cerrahi transplantasyon yöntemiyle karşılaştırıldığında, Tsn invaziv olmayan, basit, stabil ve kolay bir şekilde transplantasyona izin verir. Ek olarak, bu yöntem iPSMG'nin immünokompetan farelerin beyinlerine transplantasyonuna izin verir; Böylece, immünkompetan hastalık modeli fareler iPSMG'nin yanıtını incelemek için kullanılabilir.
Mevcut yöntemin en büyük dezavantajı, iPSMG'nin engraftasyonundaki bölgesel heterojenliktir. Beyin bölgesine özgü iPSMG transplantasyonu gerekiyorsa, nakledilen iPSMG 60 gün boyunca sadece hipokampus ve beyincikte aşılanmış kaldığı, ancak kortekste olmadığı için mevcut protokol uygun değildir. Ayrıca, eksojen insan sitokinlerinin her 12 saatte bir intranazal olarak uygulanması ihtiyacı, yoğun emek gerektirdiği ve pahalı olduğu için mevcut protokolün bir sınırlamasıdır.
Sonuç olarak, iPSMG'nin Tsn'si için immünokompetan farelerin beyinlerine ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. PLX5622 tarafından fare mikrogliasının farmakolojik AÇIK / KAPALI ile birleştirildiğinde, bu protokol iPSMG'nin başarılı bir şekilde aşılanmasını sağlar. Ekzojen sitokinler uygulandığında nakledilen hücreler hipokampus ve beyincikte sürekli bir süre gözlemlenebildiğinden, mevcut yöntem insan mikrogliasının bu bölgelerdeki hem fizyolojik hem de patolojik durumlardaki rolünü değerlendirmek için değerli olabilir.

Mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) makrofaj benzeri hücrelerin uzmanlaşmış bir popülasyonudur ve nöral devre gelişimi, nörotransmisyonun modüle edilmesi ve beyin homeostazınınsürdürülmesi gibi çeşitli beyin fonksiyonlarının kontrolünde önemli roller oynar 1,2,3. Murin mikroglia, insanlardan gelenlerle birçok işlevi paylaşmasına rağmen, türe özgü farklılıklar gösterir. Bu nedenle, fare mikrogliasının çeşitli uyaranlara tepkisi her zaman insan mikroglia 4,5,6'nınkini temsil etmeyebilir. Birçok çalışma insan mikrogliasını analiz etmiş olsa da, bu deneyler in vitro çalışmalarla sınırlıdır. İn vitro kültürlü insan mikrogliası, in vivo olanlardan çok farklı morfolojik özellikler ve gen ekspresyonu gösterir. Bu nedenle, in vitro deneyler her zaman insan mikrogliasının in vivo özelliklerini teslim etmeyebilir. Bu nedenle, insan mikrogliasını in vivo olarak incelemek için deneysel bir sisteme ihtiyaç vardır.
Son zamanlarda, insan mikrogliasının in vivo özelliklerini incelemek için, in vitro olarak üretilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) - veya embriyonik kök hücrelerden türetilmiş insan mikrogliaları cerrahi olarak farelerin beyninenakledilir 7,8,9,10,11,12,13,14. Bu yaklaşımı kullanarak, insan mikrogliasının çeşitli in vivo özellikleri karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin yaygın kullanımı iki nedenden dolayı sınırlıdır. Birincisi, bağışıklık eksikliği olan farelerin gerekliliğidir. Bu nedenle, insan mikrogliasının çeşitli nörodejeneratif hastalıklardaki rolünü incelemek için, hastalık mutasyonu taşıyan farelerin, önemli zaman ve çaba gerektiren bağışıklık eksikliği olan farelere geçmesi gerekir. Ayrıca, çeşitli nörolojik bozukluklarda, T hücreleri gibi periferik bağışıklık hücreleri, mikroglial fonksiyonları modüle edebilir15,16,17. Bu nedenle, bağışıklık eksikliği olan farelerde yapılan deneyler, insan mikrogliasının in vivo olarak iyi niyetli özelliklerini temsil etmeyebilir. İkincisi, mikroglia nakli için invaziv ameliyatlar ek ekipman ve eğitim gerektirir. Ayrıca, invaziv transplantasyon sırasında beyin hasarı mikroglial fenotipleri değiştirebilir.
Bu protokolde, iPSMG'nin immünkompetan vahşi tip farelere non-invaziv transnazal transplantasyonu (Tsn) tanımlanmıştır18. Endojen fare mikroglia19 ve Tsn'yi tüketen bir CSF1R antagonisti PLX5622'nin farmakolojik AÇIK / KAPALI kombinasyonunu birleştiren iPSMG, fare beynine invaziv olmayan bir şekilde nakledilebilir. Ayrıca, eksojen insan sitokinin uygulanmasıyla, nakledilen iPSMG, herhangi bir immünosüpresan olmadan bölgeye özgü bir şekilde 60 gün boyunca canlı kalır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN 93G</td>
			<td>Oriental Yeast Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1 antibody</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>019&#8211;19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-STEM121 antibody</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>Y40410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>8019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen iPSMG</td>
			<td>Shionogi &#38; Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory for Drug Discovery and Disease Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>VETLI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Astellas</td>
			<td>18005A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30076028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLX5622</td>
			<td>Amadis Chemical</td>
			<td>A930097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming growth factor-&#946;1 (Tgf-b1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400-10</td>
			<td>antifade mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia in immunocompetent mice brain via non-invasive transnasal route

Mikroglia, beynin makrofaj benzeri hücrelerinin uzmanlaşmış popülasyonudur. Hem fizyolojik hem de patolojik beyin fonksiyonlarında önemli roller oynarlar. Mevcut mikroglia anlayışımızın çoğu, farede yapılan deneylere dayanmaktadır. İnsan mikrogliası, fare mikrogliasından farklıdır ve bu nedenle fare mikrogliasının tepkisi ve özellikleri her zaman insan mikrogliasınınkini temsil etmeyebilir. Ayrıca, etik ve teknik zorluklar nedeniyle, insan mikrogliası üzerine yapılan araştırmalar, mikroglia'nın in vivo özelliklerini kapitüle etmeyen in vitro kültür sistemi ile sınırlıdır. Bu sorunların üstesinden gelmek için, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikrogliasını (iPSMG), koloni uyarıcı faktör 1 reseptörü (CSF1R) antagonisti kullanarak endojen mikroglia'nın farmakolojik tükenmesi ile kombinasyon halinde bir transnazal yolla immünkompetan farelerin beynine invaziv olmayan bir şekilde nakledilmesi için basitleştirilmiş bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol, hücreleri invaziv olmayan bir şekilde fare beynine nakletmek için bir yol sağlar ve bu nedenle insan mikrogliasının fizyolojik ve patolojik beyin fonksiyonlarındaki in vivo rolünü değerlendirmek için değerli olabilir.

Bu teknik, araştırmacının iPSMG'yi hipokampus ve beyinciğe, ancak fare beyninin korteksine invaziv olmayan bir şekilde nakletmesini sağlar. Çalışmayı tamamladıktan sonra, anestezi uygulanan fareler buz gibi soğuk PBS'nin (-) transkardiyal perfüzyonuna maruz bırakıldı, bunu PBS'de buz soğuk% 4 (w / v) paraformaldehit izledi. Beyinler izole edildi,% 4 (w / v) paraformaldehit içinde gece boyunca sabitlendi ve% 30 (w / v) sakkaroz içeren bir PBS'de kriyo-korunaklı hale getirildi. Ayrıca, beyinler gömme bileşiğinde donduruldu ve bir kriyostat üzerinde kesitlendi (20 μm kalınlığında koronal bölümler). Kesitler PBS(-) (her biri 10 dakika) içinde üç kez yıkandı ve geçirgenleştirildi ve 1 saat boyunca %10 normal keçi serumunda %0.5 (v/v) Triton X-100 ile bloke edildi. Kesitler daha sonra 5 gün boyunca anti-insana özgü sitoplazma belirteci, STEM121 (1:100) ve anti Iba1 (1:1000) ile inkübe edildi. Daha sonra, bölümler her biri 10 dakika boyunca PBS (-) ile üç kez yıkandı ve ikincil antikorlarla inkübe edildi: Alexa Fluor 488- veya 546 konjuge fare veya tavşan IgGs (1:1000) oda sıcaklığında 2 saat boyunca. PBS(-) ile üç kez yıkandıktan sonra kesitler antifade montaj ortamı kullanılarak kızaklara monte edilmiştir. Floresan görüntüleri elde etmek için 40x objektif lens ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanıldı. Transplantasyondan 2 ay sonra hipokampus ve kortekste iPSMG'nin yaşayabilirliği Şekil 1'de gösterilmiştir. Nakledilen hücrelerin sayısı, hem insana özgü antikorlar hem de pan-mikroglial / monosit belirteçleri için pozitif olan hücrelerin sayılmasıyla belirlenebilirken, endojen fare mikrogliası pan-mikroglial / monosit belirteci için pozitiftir sadece daha önce tarif edildiği gibi18. Nakledilen iPSMG'ler fare mikrogliasının yerini alır, hipokampusta ramifiye morfolojiler gösterir ve kortekste tespit edilmez18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg"> Şekil 1: Tsn'den 2 ay sonra korteks ve hipokampusta iPSMG'nin yaşayabilirliği. Sol panelde pan-mikroglial/monosit belirteci Iba1 (yeşil) ile immün boyama görülmektedir. Orta panel, insana özgü sitoplazma belirteci STEM121 (kırmızı) ile immün boyama gösterir. Sağ panel, Iba1 ve STEM121 immün boyamasının birleştirilmiş bir görüntüsünü gösterir. (A) Kontrol farelerinde hem kortekste hem de hipokampusta sadece fare mikrogliası (Iba1+/STEM121-) tespit edildi. (B) iPSMG nakledilen farelerde, kortekste sadece fare mikrogliası (Iba1 + / STEM121-) tespit edilirken, hipokampusta iPSMG (Iba1 + / STEM121 +) tespit edildi. Görüntüdeki oklar fare mikroglia'sını gösterirken, ok uçları iPSMG'yi göstermektedir. Floresan görüntü elde etmek için 40x objektif lens ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanıldı. Maksimum resim boyutu: 1024 x 1024 piksel. Yakınlaştırma faktörü: 2. Ölçek çubukları = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route at JoVE.com

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Burada sunulan protokol, immünkompetan farelerde transnazal bir yolla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikrogliasının (iPSMG) beyne transplantasyonuna izin verir. Hücrelerin hazırlanması ve transnazal transplantasyonu ve iPSMG'nin idamesi için sitokin karışımının uygulanması yöntemi gösterilmiştir.

İmmünkompetan Farelerin Beyinde Non-invaziv Transnazal Yolla İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Mikroglia Transplantasyonu

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Bu protokol, CSF1 reseptör antagonisti PLX5622'nin farmakolojik olarak açılıp kapatılması ile transnazal transplantasyonu birleştirerek iPSMG'nin immünkompetan fare beynine invaziv olmayan bir transplantasyonuna izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, iPSMG'nin immünokompetan farelerde bile beyin hasarına neden olmadan nakledilebilmesidir. Mikroglial transplantasyon, gelecekte çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda disfonksiyonel mikroglia ile fonksiyonel olanları değiştirmek için potansiyel bir tedavi olarak hizmet edebilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırmacı olan Bijay Parajuli olacak. Dondurulmuş indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikroglia hücrelerini 37 santigrat derecelik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözerek başlayın. Tüm görünür buzlar eriyene kadar örnekleri döndürün.Çözülmüş iPSMG'yi kültür ortamına ekleyin, 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. 10 mililitre kültür ortamına bir mililitre hücre ekleyin. Bir hücre peleti elde etmek için hücreleri beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın.Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Mikrolitre başına beşinci hücrelere 10 ila 10 hücre konsantrasyonu elde etmek için transplantasyon ortamını ekleyin. İPSMG'yi buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin.Transnazal transplantasyona fareleri hazırlamak için, erkek fareleri yedi gün boyunca PLX içeren bir diyetle besleyin. Yedinci günün sonunda, PLX diyetini durdurun ve fareleri normal bir diyetle besleyin. iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan bir saat önce, burun mukozasına geçirgenliği arttırmak için 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak PBS'de 2.5 mikrolitre hyaluronidaz her burun deliğine iki kez uygulayın.Hyaluronidaz uygulamasından sonra fareleri sırtüstü pozisyona getirin. iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan on dakika önce 2.5 mikrolitre hyaluronidaz uygulayın. 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2,5 mikrolitre hücre süspansiyonu uygulayın.Hücre süspansiyonunun diğer burun deliğine uygulanmasından önce fareyi beş dakika boyunca sırtüstü pozisyonda tutun. Hücre süspansiyonunu dört kez uygulayın ve hayvan başına toplam 20 mikrolitre hacim uygulayın. PLX beslemesinin kesilmesinden 48 saat sonra, aynı farelerde hyaluronidaz ve hücre süspansiyonu uygulanmasını tekrarlayın.Sitokinlerin uygulanması için, 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2.5 mikrolitre transplantasyon ortamı uygulayın. Transnazal transplantasyondan iki ay sonra, nakledilen hücrelerin sayısı, hem insana özgü hem de pan-mikroglial belirteçler için pozitif olan hücrelerin sayılmasıyla belirlenebilir. Endojen fare mikrogliası sadece pan-mikroglial belirteç için pozitiftir.Kontrol farelerinde, hem kortekste hem de hipokampusta sadece fare mikrogliası tespit edildi. İPSMG nakledilen farelerin korteksinde sadece fare mikrogliası tespit edilirken, hipokampusta iPSMG tespit edildi. Bu protokolü denerken, sitokinlerin seyreltilmesini önlemek için süpernatantın tamamen çıkarılması esastır.Nakledilen hücrelerin yaşayabilirliği için her 12 saatte bir sitokin uygulamak çok önemlidir. İPSMG'nin transplantasyonu için endojen fare mikrogliasının tükenmesi gereklidir. Bu prosedür, iPSMG'nin normal veya hastalıklı bir fare beynine nakledilmesine izin verir.Böylece iPSMG'nin karakteristiği ve hastalığa yanıtı belirlenebilir. Bu teknik, fare beynindeki iPSMG'nin in vivo karakteristiğini belirlemek için uygundur. Bu nedenle, iPSMG'nin hastalık modeli farelere nakledilmesi, cevabı anlamamıza yardımcı olacak ve yeni bir terapötik hedefin yolunu açabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Low-stress Route Learning Using the Lashley III Maze in Mice

Farelerde Lashley III Labirent Düşük stres Rota Öğrenme

Many behavior tests designed to assess learning and memory in rodents, particularly mice, rely on visual cues, food and/or water deprivation, or other ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Kök hücre kullanarak gelişmekte olan insan beyni Vitro Zika virüs enfeksiyonu modelleme serebral Organoids türetilmiş

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Bir Kedi Büyük Hayvan Modelinde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retinal Dokunun Subretinal Transplantasyonu

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...