Name: mass-sensitive particle tracking to characterize membrane-associated macromolecule dynamics
Uploaded: 2022-02-18T15:00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics at JoVE.com

نحن نقدر بصدق الدعم المقدم من فيليب كوكورا وجافين يونغ وفريق برامج Refeyn ونعترف بمساعدتهم من خلال مشاركة أجزاء من رمز تحليل الصور. نشكر مرفق Cryo-EM MPIB Core على توفير الوصول إلى مقياس الفوتومتر الضوئي الجماعي Refeyn التجاري. ويعرب ف. س. عن امتنانه للدعم والتمويل اللذين منحهما يورغن بليتزكو وفولفغانغ بوميستر. تلقى T.H. و P.S. تمويلا من خلال Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) - 201269156 معرف المشروع - SFB 1032 (A09). تم دعم N.H. من خلال منحة عودة DFG HU 2462/3-1. PS تعترف بالدعم من خلال شبكة الأبحاث MaxSynBio من خلال مبادرة التمويل المشترك بين الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث (BMBF) وجمعية ماكس بلانك.

<ol>
	<li>Robertson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+membrane+and+its+protein+constituents.">The lipid bilayer membrane and its protein constituents.</a> Journal of General Physiology. 150 (11), 1472-1483 (2018).</li><li>Grecco, H. E., Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+from+the+Living+Plasma+Membrane.">Signaling from the Living Plasma Membrane.</a> Cell. 144 (6), 897-909 (2011).</li><li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking.">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 119-151 (2005).</li><li>Whited, A. M., Johs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interactions+of+peripheral+membrane+proteins+with+biological+membranes.">The interactions of peripheral membrane proteins with biological membranes.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 192, 51-59 (2015).</li><li>Gonzalez, L., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+membrane+trafficking:+Structural+insights+from+a+Rab/effector+complex.">Regulation of membrane trafficking: Structural insights from a Rab/effector complex.</a> Cell. 96 (6), 755-758 (1999).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>Bagheri, Y., Ali, A. A., You, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+detecting+cell+membrane+transient+interactions.">Current methods for detecting cell membrane transient interactions.</a> Frontiers in Chemistry. 8, 603259 (2020).</li><li>Miller, H., Zhou, Z., Shepherd, J., Wollman, A. J. M., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+techniques+in+biophysics:+A+review+of+the+progress+in+methods+and+applications.">Single-molecule techniques in biophysics: A review of the progress in methods and applications.</a> Reports on Progress in Physics. 81 (2), 024601 (2018).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+From+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: From methods to biophysical insights.</a> Reports on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).</li><li>Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+kinesin-driven+movements+with+nanometre-scale+precision.">Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision.</a> Nature. 331 (6155), 450-453 (1988).</li><li>Funatsu, T., Harada, Y., Tokunaga, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single+fluorescent+molecules+and+individual+ATP+turnovers+by+single+myosin+molecules+in+aqueous+solution.">Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution.</a> Nature. 374 (6522), 555-559 (1995).</li><li>Schmidt, T., Sch&#252;tz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single+molecule+diffusion.">Imaging of single molecule diffusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (7), 2926-2929 (1996).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Kukura, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus.">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li><li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface.">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405 (2006).</li><li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+dark-field+microscopy+with+nanometer+spatial+precision+and+microsecond+temporal+resolution.">Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution.</a> Biophysical Journal. 98 (9), 2014-2023 (2010).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Bezeljak, U., Loya, H., Kaczmarek, B., Saunders, T. E., Loose, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+activation+and+bistability+in+a+Rab+GTPase+regulatory+network.">Stochastic activation and bistability in a Rab GTPase regulatory network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (12), 6504-6549 (2020).</li><li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging.">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 595-617 (2012).</li><li>Garcia-Parajo, M. F., Segers-Nolten, G. M. J., Veerman, J. A., Greve, J., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+light-driven+dynamics+of+the+fluorescence+emission+in+single+green+fluorescent+protein+molecules.">Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7237-7242 (2000).</li><li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules.">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li><li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites.">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495 (2014).</li><li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy.">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li><li>Heermann, T., Steiert, F., Ramm, B., Hundt, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-sensitive+particle+tracking+to+elucidate+the+membrane-associated+MinDE+reaction+cycle.">Mass-sensitive particle tracking to elucidate the membrane-associated MinDE reaction cycle.</a> Nature Methods. 18 (10), 1239-1246 (2021).</li><li>Foley, E. D. B., Kushwah, M. S., Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+photometry+enables+label-free+tracking+and+mass+measurement+of+single+proteins+on+lipid+bilayers.">Mass photometry enables label-free tracking and mass measurement of single proteins on lipid bilayers.</a> Nature Methods. 18 (10), 1247-1252 (2021).</li><li>Voss, O. H., Lee, H. N., Tian, L., Krzewski, K., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+preparation+for+the+analysis+of+lipid-receptor+interaction+and+efferocytosis.">Liposome preparation for the analysis of lipid-receptor interaction and efferocytosis.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-21 (2018).</li><li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments.">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0158457 (2016).</li><li>Howarth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monovalent+streptavidin+with+a+single+femtomolar+biotin+binding+site.">A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site.</a> Nature Methods. 3 (4), 267-273 (2006).</li><li>Allan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=soft-matter/trackpy:+Trackpy+v.0.5.0.">soft-matter/trackpy: Trackpy v.0.5.0.</a> Zenodo. , (2021).</li><li>Weimann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+comparison+of+single-dye+tracking+analysis+tools+using+Monte+Carlo+simulations.">A quantitative comparison of single-dye tracking analysis tools using Monte Carlo simulations.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64287 (2013).</li><li>Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mean+square+displacement+analysis+of+single-particle+trajectories+with+localization+error:+Brownian+motion+in+an+isotropic+medium.">Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium.</a> Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4), 041914 (2010).</li><li>Sygusch, J., Beaudry, D., Allaire, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+rabbit+skeletal+muscle+aldolase+at+2.7-A+resolution.">Molecular architecture of rabbit skeletal muscle aldolase at 2.7-A resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (22), 7846-7850 (1987).</li><li>Heath, G. R., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+AFM+height+spectroscopy+reveals+&#181;s-dynamics+of+unlabeled+biomolecules.">High-speed AFM height spectroscopy reveals &#181;s-dynamics of unlabeled biomolecules.</a> Nature Communications. 9 (1), 4983 (2018).</li><li>Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+the+confined+diffusion+of+cholera+toxin+B-subunit+in+intact+cell+membranes.">Mechanisms underlying the confined diffusion of cholera toxin B-subunit in intact cell membranes.</a> PLOS ONE. 7 (4), 34923 (2012).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

يمتد البروتوكول المقدم إلى قياس الكتلة الضوئية21 ، وهي تقنية تحلل كتلة الجزيئات الحيوية المفردة التي تمتص على الزجاج ، إلى أداة أكثر تنوعا قادرة على قياس كتلة وانتشار الجزيئات الحيوية المتفاعلة مع الأغشية غير المصنفة في وقت واحد. يتم تحقيق امتداد التحليل هذا من خلال تنفيذ استراتيجية إزالة خلفية معدلة تتكيف مع الحركة الجانبية للجزيئات24,25. بشكل عام ، تعد إزالة الخلفية ذات أهمية قصوى للنهج القائمة على iSCAT ، نظرا لأن التشتت القوي لخشونة سطح الزجاج يمثل عائق التحليل الرئيسي ، والتحديد الدقيق للخلفية المحلية لكل بكسل أمر ضروري لتحديد كتلة الجسيمات وموقعها. إلى جانب تحليل الصور المتكيف مع حركة الجسيمات ، فإن اكتشاف الجسيمات اللاحق ، وربط المسار ، وتحليل البيانات يكمل التوسع الجديد ل MP في تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة (MSPT).
بشكل عام ، تعد شرائح الغطاء الزجاجي التي تم تنظيفها جيدا وبيئة العمل النظيفة متطلبات حاسمة للأداء الناجح لتجارب MSPT. نظرا لعدم وجود علامات على الجزيئات الكبيرة ، فإن الإشارة المكتسبة غير انتقائية بطبيعتها. ومن ثم فإن العينات النظيفة، فضلا عن المعالجة السليمة للعينات، أمران حاسمان لضمان عدم إساءة تفسير الملاحظات. على وجه الخصوص ، عندما يتم فحص جزيئات ذات وزن جزيئي منخفض ، يتم اعتماد قياسات التحكم في الأغشية الخالية من البروتين لتقييم المساهمات الأساسية (الشكل التكميلي 1). إلى جانب إدراج قياسات التحكم ، يوصى بالتالي باتباع خطوات التحضير الموضحة في الشكل 2 لكل غرفة تدفق. عند الجمع بين تدابير السلامة هذه ، ستضمن أن الإشارة المكتشفة تنشأ من الجزيء الحيوي محل الاهتمام وليس ، على سبيل المثال ، غرفة تدفق ملوثة أو عازلة أو غشاء.
إلى جانب الاحتياطات المتعلقة بالتصميم التجريبي ، يجب أيضا توخي الحذر أثناء معالجة صور MSPT. أثناء معالجة الفيديو، ينبغي اختيار قيمة ثلاثة معلمات بعناية لضمان النتائج الصحيحة: أ) طول النافذة الوسيطة لإزالة الخلفية، ب) عتبة اكتشاف الجسيمات، و ج) الحد الأقصى لنصف قطر البحث أثناء مهمة الربط. تسهل النافذة الوسيطة الأكبر (i) بشكل عام فصل الجسيمات المنتشرة عن الخلفية شبه الثابتة المتراكبة. ومع ذلك ، بالنسبة لأحجام النوافذ الكبيرة جدا ، سيصبح انجراف العينة ملحوظا في النهاية ويقلل من دقة تقدير الخلفية. تعتمد الإعدادات المثلى بشكل كبير على خصائص العينة وظروف القياس. ومع ذلك، يمكن استخدام قيمة 1001 كنقطة انطلاق قوية. يجب ضبط معلمة العتبة (ii) اعتمادا على أدنى كتلة جزيئية متوقعة في العينة. لا ينصح باستخدام قيمة أقل من 0.0005 للقياسات المأخوذة باستخدام مقياس الكتلة الضوئي المستخدم في هذه الدراسة. لتسريع أوقات التحليل ، يمكن اختيار قيم أعلى إذا كان من المتوقع عينة ذات وزن جزيئي مرتفع. يحدد نصف قطر البحث في ربط المسار (iii) المسافة الشعاعية القصوى بالبكسل التي سيتم فيها البحث عن موقع الجسيم المتحول في إطارات متتالية. وينبغي تكييفه مع أسرع جسيم في العينة، وإذا فضل ذلك، يمكن استخدام نطاق بحث تكيفي (انظر وثائق trackpy) بدلا من ذلك لتقليل وقت الحساب. خاصة خلال المرحلة الأولية من المشروع ، يوصى بإعادة تحليل الأفلام بمعلمات مختلفة للتحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها.
في ضوء طبيعة الجزيء الواحد ل MSPT ، يجب تجنب القياس عند كثافات جسيمات غشائية عالية لأن تلك يمكن أن تتداخل مع التباين الدقيق وتحديد الكتلة. وقد تبين أن الكثافات التي تقل عن جسيم واحد لكل ميكرومتر مربع مواتية لقياسات MSPT24. وهناك اعتبار إضافي هو معاملات الانتشار المتوقعة في العينة. على الرغم من انطباقه على مجموعة واسعة من معاملات الانتشار ، إلا أن MSPT لديه حد أدنى من معاملات الانتشار التي يمكن الوصول إليها. يؤدي الحبس المحلي إلى منطقة قليلة البكسل خلال جزء كبير من فترة النافذة المتوسطة إلى دمج الجسيم مع الخلفية الثابتة. بالنسبة لظروف التصوير المستخدمة في هذا البروتوكول ، لا ينصح بقياس معاملات الانتشار أقل من 0.01 ميكرومتر2 / ثانية. عند سرعة الانتشار هذه، على سبيل المثال، يبلغ متوسط الإزاحة التربيعية للجسيم خلال النافذة المتوسطة نصف الحجم حوالي 4 بكسل، وبالتالي يكون حجمها مشابها لمدى PSF. ونتيجة لذلك، من المرجح أن يحتوي تقدير الخلفية الثابتة على مساهمات إشارة من الجسيم نفسه، مما يؤدي إلى تباين منخفض على ما يبدو للجسيم حتى يقترب في النهاية من مستوى الضوضاء. ومع ذلك ، يمكن بوضوح حل معاملات انتشار الجزيئات الكبيرة التي تتراوح بين 0.05 و 10 ميكرومتر2 / ثانية.
لتوسيع نطاق تطبيقات MSPT ، يمكن للمرء أن يتصور تقدما في خوارزمية الخلفية المستندة إلى الوسيط من خلال القضاء على وحدات البكسل التي تشغل مؤقتا بجسيم ، أو عن طريق تصحيح انحراف العينة مما يتيح أحجام نوافذ وسيطة أكبر. ومن شأن كلا النهجين أن يخفف من المشاكل المتعلقة بالقياسات عند كثافات الجسيمات العالية والانتشار البطيء. تلوح في الأفق تحسينات من حيث حساسية الكتلة المنخفضة مع جيل جديد من مقاييس الكتلة الضوئية ، والتي قد توفر الوصول إلى جزيئات حيوية أصغر من 50 كيلو دالتون. لذلك ، ستكون تجارب MSPT المستقبلية قادرة على دراسة ديناميكيات الجزيء الواحد والتفاعلات المتعلقة بالغشاء لمجموعة أوسع من محاكيات الأغشية مثل الطبقات الثنائية المبطنة والأنظمة الجزيئية الكبيرة.

مرة واحدة ينظر إليها فقط على أنها حاجز ضد مجموعة واسعة من الظروف الفيزيائية المحيطة ، تعتبر الأغشية البيولوجية في الوقت الحاضر كيانات وظيفية ومنصات حفازة 1,2. استنادا إلى قدرتها على توطين الإشارات وتضخيمها وتوجيهها استجابة لتفاعلات الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء ، تشكل واجهات الدهون عنصرا حاسما لمجموعة واسعة من العمليات الخلوية مثل الاتجار بالأغشية وشلالات الإشارات3،4،5. يعمل كموقع نواة لتجميع المجمعات المستقرة ، وغالبا ما يعتمد ارتباط الغشاء على توازن ديناميكي بين الأشكال المرتبطة بالغشاء والخلوية للجزيئات الكبيرة ، وبالتالي فهو ذو طبيعة عابرة 6,7.
على الرغم من أهميتها الكبيرة في علم الأحياء ، فقد كان من الصعب حتى الآن تطوير طرق يمكن أن توفر الوصول إلى عدم التجانس التركيبي والمكاني والزمني لتفاعلات الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء في الوقت الفعلي 7,8. لحل العمليات الجزيئية الأساسية ، هناك جانبان تجريبيان حاسمان: دقة الوقت الكافي وحساسية الجسيمات المفردة. لذلك ، فإن تقنيات متوسط المجموعة مثل استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) ولكن أيضا التحليل الطيفي لارتباط التألق الأكثر حساسية (FCS) لها قيود ، لأنها تفصل إلى حد كبير المعلومات المكانية عن المعلومات الزمنية9. وبالتالي ، كانت الخطوة المهمة نحو توصيف ديناميكيات الجزيئات الفردية هي ظهور تتبع الجسيمات المفردة (SPT) بالاقتران مع الفحص المجهري شديد الحساسية. وعلى وجه الخصوص، أثبت نهجان للجنة الفرعية لتيمور الشرقية فعاليتهما في هذا الصدد. أولا ، مهد استخدام الفلوروفورات كملصقات وأنظمة الكشف عن التألق المقابلة الطريق لدقة النانومتر ودقة المرة المللي ثانية 10،11،12. ثانيا، أدى الكشف القائم على التشتت باستخدام جسيمات الذهب النانوية إلى تحسين كل من دقة التوطين ودقة الوقت إلى نطاق النانومتر الفرعي والميكروثانية، على التوالي13،14،15،16. على الرغم من المزايا العديدة لكلا النهجين ومساهماتهما الكبيرة فيما يتعلق بالفهم الميكانيكي للأنظمة المرتبطة بالأغشية 17,18 ، إلا أن كلتا التقنيتين كانتا محدودتين حتى الآن: فهما تتطلبان وضع علامات على الجزيئات ذات الأهمية ، مما قد يزعج سلوكها الأصلي وغير حساس للتركيب الجزيئي للجسيمات المرتبطة بالغشاء 19,20.
وقد تم التغلب على هذين القيدين مؤخرا من خلال إدخال نهج جديد قائم على تشتت التداخل (iSCAT) يسمى القياس الضوئي الكتلي (MP)21،22،23. تسمح هذه التقنية بتحديد التوزيعات الجماعية داخل المحلول للجزيئات الحيوية وفقا لتباين iSCAT عند الهبوط على واجهة زجاجية. ومع ذلك ، للكشف عن وتوصيف الجزيئات المتنقلة المنتشرة على الأغشية الدهنية ، كان لا بد من تطوير نهج تحليل الصور أكثر تطورا. وفي الوقت نفسه ، تم تنفيذ هذا بنجاح ويسمح باكتشاف وتتبع وتحديد الكتلة الجزيئية للجزيئات الحيوية المفردة غير المصنفة المنتشرة على واجهة دهنية24,25. يشار إلى هذه التقنية باسم القياس الضوئي للكتلة الديناميكية أو تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة (MSPT) ، وتمكن الآن من تقييم تفاعلات الجزيئات الكبيرة المعقدة عن طريق التسجيل المباشر للتغيرات في الكتلة الجزيئية للكيانات المتعقبة ، وبالتالي تفتح إمكانيات جديدة للتحليل الميكانيكي للديناميكيات الجزيئية المرتبطة بالغشاء.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعداد العينات والتصوير وخط أنابيب تحليل البيانات المطلوب ل MSPT. على وجه الخصوص ، تتم مناقشة متطلبات العينة والمشاكل المحتملة التي قد تحدث أثناء القياس والتحليل. علاوة على ذلك ، يتم عرض الإمكانات التي لا مثيل لها لتحليل أنظمة الجزيئات الكبيرة المتفاعلة مع الأغشية من خلال نتائج تمثيلية مختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>annexin V</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#SRP8026</td>
			<td>examplary membrane-interacting protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>#5000006</td>
			<td>bradford assay kit to determine protein stock concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin labeled bovine albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#A8549</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholera toxin subunit B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#SAE0069</td>
			<td>examplary membrane-interacting protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>#0102062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>#0102242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#850375</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#870273</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#840475</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#840035</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided tape</td>
			<td>tesa</td>
			<td>#57912-00000-02</td>
			<td>needed for the assembly of glass sample chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#610023</td>
			<td>Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A39261</td>
			<td>maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (Biotinylated)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td>#FNR03-A</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration HMW Calibration Kit</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#28403842</td>
			<td>standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#860065</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)</td>
			<td>#31820</td>
			<td>examplary protein to highlight the existence of different protein states</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10003643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Autofluorescence Immersion Oil</td>
			<td>Olympus K.K.</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET21a-Streptavidin-Alive</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20860</td>
			<td>required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET21a-Streptavidin-Dead</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20859</td>
			<td>required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#29339</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein A, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#29989</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn Acquire</td>
			<td>Refeyn Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>control software for Refeyn OneMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn One</td>
			<td>Refeyn Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>mass photometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile syringe filters 0.45 &#181;m cellulose acetate membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>#514-0063</td>
			<td>needed to filter particles from the buffer of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetravalent streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#SNN1001</td>
			<td>tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 &#181;m Pore Size, 25 mm Circle</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#110603</td>
			<td>a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zepto model 2 plasma cleaner</td>
			<td>Diener electronic GmbH</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass-sensitive particle tracking to characterize membrane-associated macromolecule dynamics

التفاعلات قصيرة العمر أو العابرة للجزيئات الكبيرة في الأغشية الدهنية ومعها ، وهي واجهة تحدث فيها العديد من التفاعلات البيولوجية الأساسية ، يصعب بطبيعتها تقييمها باستخدام الطرق الفيزيائية الحيوية القياسية. ويشكل إدخال تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة (MSPT) خطوة هامة نحو توصيف كمي شامل لهذه العمليات. من الناحية الفنية ، أصبح هذا ممكنا من خلال ظهور المجهر التشتت التداخل (iSCAT) القائم على القياس الضوئي الشامل (MP). عندما يتم تحسين استراتيجية إزالة الخلفية للكشف عن الحركة ثنائية الأبعاد للجسيمات المرتبطة بالغشاء ، تسمح هذه التقنية بالتحليل في الوقت الفعلي لكل من الانتشار والكتلة الجزيئية للجزيئات الكبيرة غير المصنفة على الأغشية البيولوجية. هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لإجراء وتحليل تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة للأنظمة المرتبطة بالغشاء. تحقق القياسات التي يتم إجراؤها على مقياس ضوئي للكتلة التجارية دقة زمنية في نظام المللي ثانية ، واعتمادا على نظام MP ، حد للكشف عن الكتلة يصل إلى 50 kDa. لعرض إمكانات MSPT للتحليل المتعمق لديناميات الجزيئات الكبيرة المحفزة بالأغشية بشكل عام ، يتم تقديم النتائج التي تم الحصول عليها لأنظمة البروتين المثالية مثل ملحق متفاعل الغشاء الأصلي V .

Watch this Scientific Journal Video about Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics at JoVE.com

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

يصف هذا البروتوكول نهج معالجة الصور القائم على iSCAT وتتبع الجسيمات المفردة الذي يتيح التحقيق المتزامن للكتلة الجزيئية والسلوك المنتشر للجزيئات الكبيرة التي تتفاعل مع الأغشية الدهنية. يتم توفير إرشادات خطوة بخطوة لإعداد العينات، والتحويل من الكتلة إلى التباين، والحصول على الأفلام، وما بعد المعالجة جنبا إلى جنب مع الاتجاهات لمنع المزالق المحتملة.

تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة لتوصيف ديناميكيات الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

من خلال تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة ، يمكننا ملاحظة الجزيئات الحيوية الفردية المنتشرة على الأغشية الدهنية وتحديد ديناميكياتها في الوقت الفعلي ، وكلها خالية تماما من التسميات. نظرا لعدم وجود ملصقات مطلوبة ، فلا يوجد خطر من إزعاج السلوك الديناميكي للجزيئات الحيوية. ميزة أخرى لهذه الطريقة هي حساسيتها للكتلة ، والتي تسمح لنا بتحديد حالات قلة القلة المرتبطة بالغشاء.نظرا لتنوعها ، يمكننا تطبيق هذه الطريقة على أي نظام مرتبط بالغشاء. على وجه الخصوص ، يمكن استخدامه لدراسة تكوين مجمعات المستقبلات التي يسببها الليغاند. ابدأ بتوزيع عدد متساو من شرائح المجهر في حاملي PTFE.نقل حاملي PTFE إلى الكعال. أضف الماء فائق النقاء وقم بصوتيته لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم الملقط لنقل الحاملات إلى أكواب نظيفة وإضافة الأيزوبروبانول فائق النقاء.سونيك مرة أخرى لمدة 15 دقيقة ، ثم مرة أخرى استبدال الأيزوبروبانول بالماء فائق النقاء ، وسونيك الكأس الذي يحتوي على حاملات لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة الحوامل من الأكواب وجفف شرائح المجهر في الحامل تحت تيار ثابت من غاز النيتروجين أو الهواء المضغوط. ضع الحامل المجفف الذي يحتوي على شرائح المجهر الكبيرة في منظف البلازما وقم بتشغيله.لف الورق المقوى المسطح بورق الألومنيوم. انشر شرائح المجهر التي تم تنظيفها 24 ملم × 24 ملم على رقائق الألومنيوم مع مسافة كافية بين بعضها البعض. ثم قم بتوصيل شرائط الشريط على الوجهين بالحواف العلوية والسفلية للشرائح.قم بقص كل شريحة مجهرية باستخدام مشرط بحيث يمكن إزالتها من رقائق الألومنيوم. يجب أن تحتوي كل شريحة على خطوط من الشريط على الوجهين متصلة بالحواف العلوية والسفلية للشريحة. ثم قم بتوصيل الشريحة بشريطي الشريط على الوجهين بالشريحة المحبة للماء.سيشكل هذا مسار تدفق بين شرائح المجهر الأصغر والأكبر. قم بتخفيف الحويصلات الصغيرة أحادية الصفيحة المبثوقة حديثا ، أو سيارات الدفع الرباعي ، إلى تركيز نهائي قدره 0.4 ملليغرام لكل ملليلتر في المخزن المؤقت المطلوب للتفاعل. اختياريا ، لتعزيز تمزق الحويصلة ، أضف اثنين من كلوريد الكالسيوم المليمولي إلى تعليق الحويصلة.قم بتركيب غرفة تدفق على مرحلة مقياس الكتلة الضوئية. اغسل 25 ميكرولتر من تعليق الحويصلة في غرفة التدفق واحتضن الغرفة لمدة دقيقتين ، ثم أزل الحويصلات غير المنصهرة من خلال الغسيل المتكرر لغرفة التدفق مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل في كل مرة. بمجرد أن يصبح الغشاء الدهني خاليا من الحويصلات غير المنصهرة ، أضف 50 ميكرولتر من البروتين الذي يهم إلى غرفة العينة.بعد ذلك ، قم بتعيين شروط التصوير مثل حجم مجال الرؤية ووقت التعرض ومعدل الإطارات ووقت الاكتساب في برنامج الاستحواذ. اضبط التركيز البؤري تلقائيا. إذا لزم الأمر ، استخدم التحكم الجانبي لنقل مجال الرؤية إلى موضع به غشاء متجانس.قم بإنشاء مجلد مشروع وابدأ تسجيل الفيلم. بعد الانتهاء من التسجيل ، حدد اسم ملف في مربع الحوار الذي يطلبه برنامج الاستحواذ. سيتم حفظ الفيلم تلقائيا في مجلد المشروع كملف MP للتحليل اللاحق.لتحليل مقاطع الفيديو المسجلة ، قم بتشغيل تطبيق Jupyter notebook. في قائمة المجلدات الظاهرة، انتقل إلى الموقع حيث تحليل MSPT. يتم تخزين ملف دفتر الملاحظات ipy وانقر على الملف.في دفاتر ملاحظات Jupyter ، يتم تنظيم التعليمات البرمجية في خلايا ويمكن تنفيذها خطوة بخطوة. انقر فوق الزر تشغيل الصغير بجوار الخلية أو حدد خلية واضغط على Shift Enter لتنفيذ الخلية. ابدأ باستيراد جميع الحزم المطلوبة للتحليل.قم بتنفيذ الخلية التالية لتشغيل مطالبة ملف. اختر مجلدا يحتوي على ملف فيديو MP واحد أو عدة ملفات فيديو MP ليتم تحليلها واضغط على تحديد مجلد. تتم طباعة قائمة بالملفات المختارة أسفل الخلية.لإزالة التشتت الثابت السائد للضوء باستخدام خوارزمية تقدير الخلفية من حيث البكسل، اختر خيار الوسيط المستمر لوضع المعلمة وقم بتعيين طول مناسب للنافذة الوسطية المنزلقة. اختياريا، احفظ الأفلام بعد إزالة الخلفية عن طريق إعداد save_processed_movies True لاستخدامها في اكتشاف الجسيمات وربط المسار. تأكد من تعيين True و GPU False المتوازي للمعالجة على وحدة المعالجة المركزية أو العكس بالعكس للمعالجة على وحدة معالجة الرسومات.يتم تحديد الجسيمات وموقعها وتوطينها طوال الفيلم. اضبط حساسية اكتشاف الجسيمات باستخدام معلمة عتبة تستخدم لتسليط الضوء على البقع المرشحة عن طريق ثنائية الصور. افحص تأثير معلمات العتبة المختلفة على حساسية اكتشاف البقع في دفتر ملاحظات منفصل يسمى تصور الفيلم.ipy دفتر الملاحظات. بعد تحميل الفيلم في عارض الإطارات، استخدم شريط تمرير العتبة لضبط عتبة اكتشاف الجسيمات والعثور على إعداد مناسب. بالعودة إلى دفتر الملاحظات الآخر ، اختر ثلاث معلمات لربط الجسيمات في إطارات متتالية في مسارات باستخدام تتبع حزمة Python.اضبط الحد الأقصى لإزاحة الجسيمات من إطار إلى آخر وفقا للحد الأقصى لسرعة الانتشار المتوقعة. حدد الحد الأقصى لعدد الإطارات التي قد يختفي فيها الجسيم ويظهر مرة أخرى ولكن لا يزال يعتبر نفس الجسيم. يمكن إزالة المسارات ذات النقاط القليلة جدا باستخدام المعلمة minimum_trajectory_length لتحديد معاملات الانتشار بشكل أكثر قوة.إصلاح جميع المعلمات في الخلية عن طريق تنفيذها. قم بتنفيذ الخلية التالية لتحليل جميع مقاطع الفيديو المحددة باستخدام المعلمات المختارة. ستظهر أشرطة التقدم لكل خطوة معالجة أسفل الخلية.قد يستغرق ذلك بعض الوقت ، اعتمادا على طول الفيديو وإعدادات المعلمة والأجهزة. في الخطوة التالية ، يحدد البرنامج معاملات الانتشار للمسارات الموجودة في القسم السابق ، استنادا إلى كل من توزيع مسافة القفز وتحليل متوسط الإزاحة المربعة. ابدأ بتحديد frame_rate الفيلم pixel_size.قم بإصلاحها عن طريق تنفيذ الخلية ، ثم قم بتشغيل الخلية التالية وحدد الدليل الأصل الذي يحتوي على جميع ملفات CSV التي تم إنشاؤها بواسطة trackpy. تتم طباعة قائمة بملفات CSV التي تم العثور عليها أسفل الخلية. في الخلية التالية ، اختر اسما لحاوية HDF5 حيث يتم تخزين النتائج وتنفيذها.وأخيرا تنفيذ الخلية C.4 لإجراء تحليل الانتشار. في الخلية C.5 أدخل التباين مع معلمات خط معايرة الكتلة ، مما يعني تحديد الميل والإزاحة باستخدام عينات من الكتلة المعروفة وتنفيذها لتحويل جميع تباينات الجسيمات إلى الكتلة الجزيئية. تقييم كثافة الجسيمات الظاهرة على الغشاء عن طريق تنفيذ الخلية C.6 ، والتي ترجع قيمة الكثافة المتوسطة من حيث الجسيمات المكتشفة والمسارات الحالية خلال كل إطار كأعمدة إضافية في إطار البيانات.لإنشاء المخطط النهائي لارتباط الكتلة ومعامل الانتشار، قم بتنفيذ الخلية D.1 لتحميل مطالبة ملف وتحديد ملف HDF5 الذي يحتوي على نتائج MSPT، ثم حدد إما مجموعة البيانات من فيديو واحد لرسمها في الخلية D.2 أو قم بدمج البيانات من مقاطع فيديو متعددة في إطار بيانات واحد عن طريق تنفيذ الخلية D.3. في هذا المثال، نظرا لأن جميع مقاطع الفيديو عبارة عن نسخ متماثلة من عينات متطابقة، يتم تجميع مجموعة البيانات. أخيرا ، ارسم كثافة النواة ثنائية الأبعاد عن طريق تنفيذ الخلية D.4.إذا كنت راضيا، حدد موقعا لحفظ المخطط في ملف PDF في الخلية D.5 وتنفيذه. تظهر هنا صور تمثيلية لخشونة سطح شريحة الغطاء الزجاجي أثناء تكوين طبقة ثنائية الدهون المدعومة ، مع طبقة ثنائية دهنية مدعومة سليمة ، وللبروتينات المثالية المعاد تشكيلها على SLB. يتم عرض جميع الأمثلة الأربعة في الوضع الأصلي ، والذي يمكن الوصول إليه أثناء القياس نفسه ، وكصور قياس النسبة المعالجة بعد إزالة الخلفية المستندة إلى الوسيط.يمكن تحقيق المعايرة التي تترجم التباين إلى كتلة جزيئية عن طريق ربط الجزيئات الحيوية ذات الكتلة المعروفة ب SLB عبر مركب البيوتين-ستربتافيدين-البيوتين. كاستراتيجية مثالية ، يمكن للمرء استخدام المتغيرات البيوتينيل من ألبومين مصل البقر ، والبروتين A ، والفوسفاتيز القلوي ، والفيبرونيكتين التي ترتبط بالستربتافيدين الذي يرتبط في حد ذاته بالدهون المحتوية على البيوتين في الغشاء. يعكس التباين الواضح بشكل متزايد لهذه الجزيئات الكبيرة النموذجية الوزن الجزيئي المتزايد لمعايير البيوتينيل المعنية.من خلال تعيين كل ذروة من الرسوم البيانية للتباين إلى الكتلة المقابلة لحالة oligomer للبروتين القياسي ، يتم الكشف عن علاقة خطية بين التباين والكتلة ويمكن استخدامها لاحقا لتحليل أنظمة الجزيئات الكبيرة غير المعروفة. تظهر هنا تقديرات كثافة النواة 2D لكل من الكتلة ومعامل الانتشار للستربتافيدين رباعي التكافؤ في مجمع مع ألدولاز البيوتينيل أو مع جسم مضاد للماعز معدل بالبيوتين مضاد للأرانب IgG. تظهر الصور التمثيلية مقارنة بين كتل الأوليغومر المحددة لمركب الستربتافيدين رباعي التكافؤ مع الألدولاز المعدل بالبيوتين أو IgG والأوزان الجزيئية المتوقعة.باستخدام MSPT ، يمكننا تتبع الجزيئات الحيوية مباشرة على الأغشية الدهنية ، وتحديد الكتلة التي لديها ، وكيف تتحرك ، وكيف تتفاعل. أنا واثق من أن هذه التقنية ستحول فهمنا للعمليات البيولوجية على الأغشية ومعها.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

الطيف الكتلي والنهج القائم Luminogenic للتميز المرحلة الأولى الاستقلابية الكفاءة من<em&gt; في المختبر</em&gt; الثقافات خلية

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

في الوقت الحقيقي تتبع فصل جزء من الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

قياس الملامح الجزيئية البيولوجية DSC مع يغاندس ثيرمولابيلي لوصف سرعة قابلة للطي والربط التفاعلات

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

التحليل الطيفي المزدوج اللون للفلورسين المترابط لدراسة التفاعل بين البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...