Name: mass-sensitive particle tracking to characterize membrane-associated macromolecule dynamics
Uploaded: 2022-02-18T15:00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics at JoVE.com

Wir schätzen die Unterstützung von Philipp Kukura, Gavin Young und dem Refeyn-Softwareteam aufrichtig und danken für ihre Unterstützung durch die gemeinsame Nutzung von Teilen des Bildanalysecodes. Wir danken der Cryo-EM MPIB Core Facility für den Zugang zum kommerziellen Refeyn-Massenphotometer. F.S. dankt Jürgen Plitzko und Wolfgang Baumeister für die Unterstützung und Förderung. T.H. und P.S. wurden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert - Projekt-ID 201269156 - SFB 1032 (A09). N.H. wurde durch einen DFG-Rückkehrzuschuss HU 2462/3-1 gefördert. P.S. würdigt die Unterstützung durch das Forschungsnetzwerk MaxSynBio über die gemeinsame Förderinitiative des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) und der Max-Planck-Gesellschaft.

<ol>
	<li>Robertson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+membrane+and+its+protein+constituents.">The lipid bilayer membrane and its protein constituents.</a> Journal of General Physiology. 150 (11), 1472-1483 (2018).</li><li>Grecco, H. E., Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+from+the+Living+Plasma+Membrane.">Signaling from the Living Plasma Membrane.</a> Cell. 144 (6), 897-909 (2011).</li><li>Cho, W., Stahelin, R. 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D. B., Kushwah, M. S., Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+photometry+enables+label-free+tracking+and+mass+measurement+of+single+proteins+on+lipid+bilayers.">Mass photometry enables label-free tracking and mass measurement of single proteins on lipid bilayers.</a> Nature Methods. 18 (10), 1247-1252 (2021).</li><li>Voss, O. H., Lee, H. N., Tian, L., Krzewski, K., Coligan, J. 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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Das vorgestellte Protokoll erweitert die Massenphotometrie21, eine Technik, die die Masse einzelner Biomoleküle analysiert, die auf Glas adsorbieren, zu einem noch vielseitigeren Werkzeug, das in der Lage ist, gleichzeitig die Masse und Diffusion von nicht markierten membraninteragierenden Biomolekülen zu messen. Diese Analyseerweiterung wird durch die Implementierung einer modifizierten Hintergrundentfernungsstrategie erreicht, die an die laterale Bewegung der Moleküle angepasst ist24,25. Im Allgemeinen ist die Hintergrundentfernung für iSCAT-basierte Ansätze von größter Bedeutung, da die starke Streuung der Glasoberflächenrauheit das Haupthindernis für die Analyse darstellt und die genaue Bestimmung des lokalen Hintergrunds jedes Pixels für die Quantifizierung der Partikelmasse und -position unerlässlich ist. Neben der an die Partikelbewegung angepassten Bildanalyse vervollständigen die anschließende Partikeldetektion, Trajektorienverknüpfung und Datenanalyse die neuartige Erweiterung von MP in die massensensitive Partikelverfolgung (MSPT).
Im Allgemeinen sind gründlich gereinigte Glasabdeckobjektträger und eine saubere Arbeitsumgebung kritische Voraussetzungen für die erfolgreiche Durchführung von MSPT-Experimenten. Aufgrund des Fehlens einer Makromolekülmarkierung ist das erworbene Signal von Natur aus nicht selektiv. Saubere Proben sowie die richtige Handhabung der Proben sind daher entscheidend, um sicherzustellen, dass Beobachtungen nicht falsch interpretiert werden können. Insbesondere bei der Untersuchung von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht werden Kontrollmessungen von proteinfreien Membranen empfohlen, um Hintergrundbeiträge zu bewerten (Ergänzende Abbildung 1). Neben der Einbeziehung von Kontrollmessungen wird daher empfohlen, die in Abbildung 2 dargestellten Vorbereitungsschritte für jede Durchflusskammer zu befolgen. In Kombination stellen diese Sicherheitsmaßnahmen sicher, dass das detektierte Signal von dem interessierenden Biomolekül stammt und nicht beispielsweise von einer kontaminierten Durchflusskammer, einem Puffer oder einer Membran.
Neben den Vorsichtsmaßnahmen bezüglich des experimentellen Designs ist auch bei der MSPT-Bildverarbeitung Vorsicht geboten. Während der Videoverarbeitung sollte der Wert für drei Parameter sorgfältig ausgewählt werden, um korrekte Ergebnisse zu gewährleisten: i) die Länge des Medianfensters für die Hintergrundentfernung, ii) der Schwellenwert für die Partikelerkennung und iii) der maximale Suchradius während der Verknüpfungszuweisung. Ein größeres medianes Fenster (i) erleichtert im Allgemeinen die Trennung von diffusen Partikeln vom überlagerten quasi-konstanten Hintergrund. Bei zu großen Fenstergrößen wird sich die Probendrift jedoch schließlich bemerkbar machen und die Genauigkeit der Hintergrundschätzung verringern. Optimale Einstellungen hängen stark von den Probeneigenschaften und Messbedingungen ab. Dennoch kann ein Wert von 1.001 als robuster Ausgangspunkt herangezogen werden. Der Schwellenwertparameter (ii) muss in Abhängigkeit von der niedrigsten in der Probe erwarteten Molekülmasse abgestimmt werden. Ein Wert unter 0,0005 wird für Messungen mit dem in dieser Studie verwendeten Massenphotometer nicht empfohlen. Um die Analysezeiten zu verkürzen, können höhere Werte gewählt werden, wenn eine Probe mit hohem Molekulargewicht erwartet wird. Der Suchradius bei der Trajektorienverknüpfung (iii) gibt den maximalen radialen Abstand in Pixeln an, in dem die verschobene Position des Partikels in aufeinanderfolgenden Bildern gesucht wird. Es sollte an das schnellste Partikel in der Probe angepasst werden, und wenn es bevorzugt wird, könnte stattdessen ein adaptiver Suchbereich (siehe Dokumentation von Trackpy) verwendet werden, um die Rechenzeit zu reduzieren. Insbesondere in der Anfangsphase eines Projekts empfiehlt es sich, die Filme mit unterschiedlichen Parametern erneut zu analysieren, um die erzielten Ergebnisse zu validieren.
Angesichts der Einzelmolekülnatur von MSPT sollte es vermieden werden, bei hohen Membranpartikeldichten zu messen, da diese die genaue Kontrast- und Massenbestimmung beeinträchtigen können. Es hat sich gezeigt, dass Dichten unter einem Partikel pro Quadratmikrometer für MSPT-Messungen günstig sind24. Eine weitere Überlegung sind die erwarteten Diffusionskoeffizienten in der Probe. Obwohl MSPT auf eine breite Palette von Diffusionskoeffizienten anwendbar ist, hat es eine untere Grenze für zugängliche Diffusionskoeffizienten. Durch die lokale Eingrenzung auf einen Bereich von wenigen Pixeln während eines signifikanten Teils des mittleren Fensterzeitraums wird das Partikel mit dem statischen Hintergrund zusammengeführt. Für die in diesem Protokoll verwendeten Bildgebungsbedingungen wird die Messung von Diffusionskoeffizienten unter 0,01 μm2/s nicht empfohlen. Bei dieser Diffusionsgeschwindigkeit beträgt beispielsweise die mittlere quadratische Verschiebung eines Partikels während der mittleren Fensterhälfte etwa 4 Pixel und ist damit ähnlich groß wie die Ausdehnung des PSF. Infolgedessen wird die statische Hintergrundschätzung wahrscheinlich Signalbeiträge des Partikels selbst enthalten, was zu einem scheinbar reduzierten Kontrast des Partikels führt, bis es sich schließlich dem Rauschpegel nähert. Makromolekül-Diffusionskoeffizienten zwischen 0,05 und 10 μm2/s können jedoch eindeutig aufgelöst werden.
Um das Spektrum der MSPT-Anwendungen weiter zu erweitern, kann man sich eine Weiterentwicklung des medianbasierten Hintergrundalgorithmus durch die Eliminierung von Pixeln vorstellen, die vorübergehend mit einem Partikel belegt sind, oder durch eine Korrektur der Abtastdrift, die größere mittlere Fenstergrößen ermöglicht. Beide Ansätze würden die Probleme bei Messungen bei hohen Partikeldichten und langsamer Diffusion lindern. Verbesserungen in Bezug auf die geringere Massenempfindlichkeit sind mit einer neuen Generation von Massenphotometern am Horizont, die den Zugang zu Biomolekülen kleiner als 50 kDa ermöglichen können. Daher werden zukünftige MSPT-Experimente in der Lage sein, Einzelmoleküldynamik und membranbezogene Wechselwirkungen für ein noch breiteres Spektrum von Membranmimikrien wie gepolsterte Doppelschichten und makromolekulare Systeme zu untersuchen.

Einst nur als Barriere gegen die vielfältigen physikalischen Umgebungsbedingungen wahrgenommen, gelten biologische Membranen heute als funktionelle Einheiten und katalytische Plattformen 1,2. Basierend auf ihrer Fähigkeit, Signale als Reaktion auf membranassoziierte Makromolekülreaktionen zu lokalisieren, zu verstärken und zu lenken, stellen Lipidgrenzflächen ein entscheidendes Element für eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Membrantransport und Signalkaskaden dar 3,4,5. Die Membrananhaftung, die als Keimbildungsstelle für den Aufbau stabiler Komplexe dient, beruht oft auf einem dynamischen Gleichgewicht zwischen membranassoziierten und zytosolischen Formen von Makromolekülen und ist daher von vorübergehender Natur 6,7.
Trotz ihrer großen Bedeutung in der Biologie war es bisher eine Herausforderung, Methoden zu entwickeln, die Zugang zu den kompositorischen, räumlichen und zeitlichen Heterogenitäten membranassoziierter Makromolekülreaktionen in Echtzeit ermöglichenkönnen 7,8. Um die zugrunde liegenden molekularen Prozesse aufzulösen, sind zwei experimentelle Aspekte entscheidend: eine ausreichende Zeitauflösung und Einzelteilchenempfindlichkeit. Daher haben Ensemble-Durchschnittstechniken wie die Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichen (FRAP), aber auch die viel empfindlichere Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) Einschränkungen, da sie räumliche Informationen weitgehend von zeitlichen Informationen entkoppeln9. Ein wichtiger Schritt zur Charakterisierung der individuellen Moleküldynamik war daher das Aufkommen von Single-Particle Tracking (SPT) in Kombination mit hochempfindlicher Mikroskopie. Insbesondere zwei SPT-Ansätze haben sich in dieser Hinsicht als wirksam erwiesen. Erstens ebnete die Verwendung von Fluorophoren als Markierungen und den entsprechenden Fluoreszenzdetektionssystemen den Weg für Nanometergenauigkeit und Millisekunden-Zeitauflösung10,11,12. Zweitens verbesserte die streubasierte Detektion mit Goldnanopartikeln sowohl die Lokalisierungsgenauigkeit als auch die Zeitauflösung im Sub-Nanometer- bzw. Mikrosekundenbereich13,14,15,16. Trotz der vielen Vorteile beider Ansätze und ihrer bedeutenden Beiträge zum mechanistischen Verständnis membranassoziierter Systeme17,18 waren beide Techniken bisher begrenzt: Sie erfordern eine Markierung der interessierenden Moleküle, was ihr natives Verhalten möglicherweise stört und unempfindlich gegenüber der molekularen Zusammensetzung von membranassoziierten Partikelnist 19,20.
Beide Einschränkungen wurden kürzlich durch die Einführung eines neuartigen interferometrischen Streuungsansatzes (iSCAT) namens Massenphotometrie (MP) 21,22,23 überwunden. Diese Technik ermöglicht die Bestimmung von Massenverteilungen von Biomolekülen in Lösung entsprechend ihrem iSCAT-Kontrast bei der Landung auf einer Glasgrenzfläche. Für den Nachweis und die Charakterisierung von mobilen Molekülen, die auf Lipidmembranen diffundieren, musste jedoch ein ausgefeilterer Bildanalyseansatz entwickelt werden. Dies wurde inzwischen erfolgreich implementiert und ermöglicht es, die molekulare Masse einzelner unmarkierter Biomoleküle, die auf einer Lipidgrenzfläche diffundieren, nachzuweisen, zu verfolgen und zu bestimmen24,25. Diese als dynamische Massenphotometrie oder Mass Sensitive Particle Tracking (MSPT) bezeichnete Technik ermöglicht nun die Beurteilung komplexer Makromolekülwechselwirkungen durch die direkte Aufzeichnung von Änderungen der Molekülmasse der verfolgten Entitäten und eröffnet damit neue Möglichkeiten für die mechanistische Analyse der membranassoziierten Molekulardynamik.
Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Probenvorbereitung, Bildgebung und die für MSPT erforderliche Datenanalysepipeline vorgestellt. Insbesondere werden Probenanforderungen und mögliche Probleme, die während der Messung und Analyse auftreten können, diskutiert. Darüber hinaus wird das beispiellose Potenzial zur Analyse membranwechselwirkender Makromolekülsysteme durch verschiedene repräsentative Ergebnisse gezeigt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>annexin V</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#SRP8026</td>
			<td>examplary membrane-interacting protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>#5000006</td>
			<td>bradford assay kit to determine protein stock concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin labeled bovine albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#A8549</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholera toxin subunit B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#SAE0069</td>
			<td>examplary membrane-interacting protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>#0102062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>#0102242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#850375</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#870273</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#840475</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#840035</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided tape</td>
			<td>tesa</td>
			<td>#57912-00000-02</td>
			<td>needed for the assembly of glass sample chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#610023</td>
			<td>Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A39261</td>
			<td>maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (Biotinylated)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td>#FNR03-A</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration HMW Calibration Kit</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#28403842</td>
			<td>standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#860065</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)</td>
			<td>#31820</td>
			<td>examplary protein to highlight the existence of different protein states</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10003643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Autofluorescence Immersion Oil</td>
			<td>Olympus K.K.</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET21a-Streptavidin-Alive</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20860</td>
			<td>required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET21a-Streptavidin-Dead</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20859</td>
			<td>required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#29339</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein A, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#29989</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn Acquire</td>
			<td>Refeyn Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>control software for Refeyn OneMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn One</td>
			<td>Refeyn Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>mass photometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile syringe filters 0.45 &#181;m cellulose acetate membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>#514-0063</td>
			<td>needed to filter particles from the buffer of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetravalent streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#SNN1001</td>
			<td>tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 &#181;m Pore Size, 25 mm Circle</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#110603</td>
			<td>a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zepto model 2 plasma cleaner</td>
			<td>Diener electronic GmbH</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass-sensitive particle tracking to characterize membrane-associated macromolecule dynamics

Kurzlebige oder vorübergehende Wechselwirkungen von Makromolekülen an und mit Lipidmembranen, einer Grenzfläche, an der eine Vielzahl essentieller biologischer Reaktionen stattfindet, sind mit biophysikalischen Standardmethoden von Natur aus schwer zu beurteilen. Die Einführung des Mass-sensitive Particle Tracking (MSPT) stellt einen wichtigen Schritt hin zu einer gründlichen quantitativen Charakterisierung solcher Prozesse dar. Technisch wurde dies durch das Aufkommen der interferometrischen Streumikroskopie (iSCAT) ermöglicht, die auf Massenphotometrie (MP) basiert. Wenn die Hintergrundentfernungsstrategie optimiert wird, um die zweidimensionale Bewegung von membranassoziierten Partikeln aufzudecken, ermöglicht diese Technik die Echtzeitanalyse sowohl der Diffusion als auch der Molekülmasse von unmarkierten Makromolekülen auf biologischen Membranen. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Durchführung und Analyse der massensensitiven Partikelverfolgung von membranassoziierten Systemen beschrieben. Messungen an einem handelsüblichen Massenphotometer erreichen eine Zeitauflösung im Millisekundenbereich und je nach MP-System eine Massennachweisgrenze bis hinunter zu 50 kDa. Um das Potenzial von MSPT für die eingehende Analyse der membrankatalysierten Makromoleküldynamik im Allgemeinen aufzuzeigen, werden Ergebnisse für beispielhafte Proteinsysteme wie den nativen Membraninteraktor Annex in V vorgestellt.

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Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Mit dem massensensitiven Partikel-Tracking können wir einzelne Biomoleküle beobachten, die auf Lipidmembranen diffundieren und ihre Dynamik in Echtzeit quantifizieren, alles völlig markierungsfrei. Da keine Markierungen erforderlich sind, besteht keine Gefahr, das dynamische Verhalten der Biomoleküle zu stören. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist ihre Massenempfindlichkeit, die es uns ermöglicht, membrangebundene oligomere Zustände zu bestimmen.Aufgrund seiner Vielseitigkeit können wir diese Methode auf jedes membranassoziierte System anwenden. Insbesondere kann es verwendet werden, um die Bildung von Liganden-induzierten Rezeptorkomplexen zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Verteilung einer gleichen Anzahl von Objektträgern in PTFE-Haltern.Übertragen Sie die PTFE-Halter in die Bechergläser. Fügen Sie Reinstwasser hinzu und beschallen Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Halter auf saubere Becher zu übertragen und ultrareines Isopropanol hinzuzufügen.Beschallen Sie erneut für 15 Minuten, ersetzen Sie dann erneut das Isopropanol durch Reinstwasser und beschallen Sie das Becherglas mit den Haltern für 15 Minuten. Entfernen Sie die Halter aus den Bechergläsern und föhnen Sie die Objektträger in der Halterung unter einem stetigen Strom von Stickstoffgas oder Druckluft. Legen Sie den getrockneten Halter mit den großen Objektträgern in den Plasmareiniger und schalten Sie ihn ein.Wickeln Sie den flachen Karton mit Aluminiumfolie ein. Verteilen Sie die gereinigten 24 Millimeter mal 24 Millimeter großen Objektträger mit ausreichendem Abstand zueinander auf der Aluminiumfolie. Befestigen Sie dann doppelseitige Klebestreifen an den oberen und unteren Rändern der Objektträger.Schneiden Sie jeden Objektträger mit einem Skalpell aus, so dass er von der Aluminiumfolie entfernt werden kann. Jedes Dia sollte Streifen aus doppelseitigem Klebeband aufweisen, die an den oberen und unteren Rändern des Objektträgers angebracht sind. Befestigen Sie dann das Dia mit den beiden doppelseitigen Bandstreifen an dem hydrophilisierten Objektträger.Dadurch bildet sich ein Fließpfad zwischen den kleineren und größeren Objektträgern. Verdünnen Sie die frisch extrudierten kleinen unilamellären Vesikel (SUVs) im erforderlichen Reaktionspuffer auf eine Endkonzentration von 0,4 Milligramm pro Milliliter. Optional, um die Vesikelruptur zu fördern, fügen Sie der Vesikelsuspension zwei millimolare Calciumchloride hinzu.Montieren Sie eine Durchflusskammer auf der Massenphotometerstufe. Spülen Sie 25 Mikroliter der Vesikelsuspension in die Durchflusskammer und inkubieren Sie die Kammer für zwei Minuten, dann entfernen Sie die unverschmolzenen Vesikel durch wiederholtes Waschen der Durchflusskammer mit jeweils 200 Mikrolitern des Reaktionspuffers. Sobald die Lipidmembran frei von unverschmolzenen Vesikeln ist, fügen Sie 50 Mikroliter des interessierenden Proteins in die Probenkammer hinzu.Als nächstes legen Sie die Bildgebungsbedingungen wie die Größe des Sichtfelds, die Belichtungszeit, die Bildrate und die Erfassungszeit in der Erfassungssoftware fest. Passen Sie den Fokus automatisch an. Verwenden Sie bei Bedarf die laterale Kontrolle, um das Sichtfeld an eine Position mit einer homogenen Membran zu bewegen.Erstellen Sie einen Projektordner und beginnen Sie mit der Aufnahme des Films. Geben Sie nach Abschluss der Aufzeichnung einen Dateinamen in dem von der Erfassungssoftware angeforderten Dialog an. Der Film wird automatisch als MP-Datei zur späteren Analyse im Projektordner gespeichert.Um die aufgezeichneten Videos zu analysieren, starten Sie die Jupyter-Notebook-App. Navigieren Sie in der angezeigten Ordnerliste zu dem Speicherort, an dem sich die MSPT-Analyse befindet. Die IPY-Notebook-Datei wird gespeichert und klicken Sie auf die Datei.In Jupyter-Notebooks ist Code in Zellen organisiert und kann Schritt für Schritt ausgeführt werden. Klicken Sie auf die kleine Wiedergabeschaltfläche neben der Zelle oder wählen Sie eine Zelle aus und drücken Sie die Umschalttaste, um die Zelle auszuführen. Beginnen Sie mit dem Import aller für die Analyse erforderlichen Pakete.Führen Sie die nächste Zelle aus, um eine Dateieingabeaufforderung zu starten. Wählen Sie einen Ordner aus, der eine oder mehrere zu analysierende MP-Videodateien enthält, und klicken Sie auf Ordner auswählen. Eine Liste der ausgewählten Dateien wird unter der Zelle gedruckt.Um die dominante statische Lichtstreuung mit dem pixelweisen Hintergrundschätzungsalgorithmus zu entfernen, wählen Sie die Option für den kontinuierlichen Median für den Parametermodus und legen Sie eine geeignete Länge für das gleitende Medianfenster fest. Optional können Sie die Filme nach dem Entfernen des Hintergrunds speichern, indem Sie save_processed_movies True festlegen, um sie für die Partikelerkennung und Trajektorienverknüpfung zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass Sie True und GPU False für die Verarbeitung auf der CPU parallel festlegen oder umgekehrt für die Verarbeitung auf einer GPU.Partikel und ihre jeweilige Position werden im gesamten Film identifiziert und lokalisiert. Stimmen Sie die Empfindlichkeit der Partikeldetektion mit einem Schwellenwertparameter ab, der verwendet wird, um die Kandidatenflecken durch Bildbinarisierung hervorzuheben. Untersuchen Sie die Auswirkungen unterschiedlicher Schwellenwertparameter auf die Spot-Erkennungsempfindlichkeit in einem separaten Notizbuch namens Movie-Visualisierung.IPY-Notebook. Nachdem Sie den Film in den Frame-Viewer geladen haben, verwenden Sie den Schwellenwert, um den Partikelerkennungsschwellenwert anzupassen und eine geeignete Einstellung zu finden. Zurück zum anderen Notebook: Wählen Sie drei Parameter aus, um Partikel in aufeinanderfolgenden Frames mit dem Python-Paket trackpy zu Trajektorien zu verknüpfen.Stellen Sie die maximale Verschiebung von Partikeln von einem Frame zum nächsten entsprechend der maximal erwarteten Diffusionsgeschwindigkeit ein. Wählen Sie die maximale Anzahl von Frames aus, die ein Partikel verschwinden und wieder erscheinen kann, aber immer noch als dasselbe Partikel betrachtet wird. Trajektorien mit zu wenigen Punkten können mit dem Parameter minimum_trajectory_length für eine robustere Bestimmung der Diffusionskoeffizienten entfernt werden.Korrigieren Sie alle Parameter in der Zelle, indem Sie sie ausführen. Führen Sie die nächste Zelle aus, um alle ausgewählten Videos mit den ausgewählten Parametern zu analysieren. Fortschrittsbalken für jeden Verarbeitungsschritt werden unter der Zelle angezeigt.Dies kann je nach Videolänge, Parametereinstellungen und Hardware eine Weile dauern. Im nächsten Schritt bestimmt die Software die Diffusionskoeffizienten für die im vorherigen Abschnitt gefundenen Trajektorien, basierend auf der Verteilung der Sprungentfernung und der Analyse der mittleren quadratischen Verschiebung. Beginnen Sie mit der Angabe der frame_rate und pixel_size des Films.Beheben Sie sie, indem Sie die Zelle ausführen, dann die nächste Zelle ausführen und das übergeordnete Verzeichnis auswählen, das alle von trackpy generierten CSV-Dateien enthält. Eine Liste der gefundenen CSV-Dateien ist unter der Zelle abgedruckt. Wählen Sie in der nächsten Zelle einen Namen für den HDF5-Container aus, in dem die Ergebnisse gespeichert sind, und führen Sie ihn aus.Führen Sie schließlich Zelle C.4 aus, um die Diffusionsanalyse durchzuführen. Geben Sie in Zelle C.5 die Linienparameter für den Kontrast zur Massenkalibrierung ein, dh die Steigung und den Offset, die anhand von Proben bekannter Masse bestimmt wurden, und führen Sie sie aus, um alle Partikelkontraste in die Molekülmasse umzuwandeln. Bewerten Sie die scheinbare Partikeldichte auf der Membran, indem Sie Zelle C.6 ausführen, die den Mediandichtewert in Bezug auf detektierte Partikel und vorhandene Trajektorien während jedes Frames als zusätzliche Spalten im Datenrahmen zurückgibt.Um das endgültige Diagramm für die Korrelation von Masse und Diffusionskoeffizient zu generieren, führen Sie Zelle D.1 aus, um eine Dateieingabeaufforderung zu laden, und geben Sie die HDF5-Datei mit den MSPT-Ergebnissen an, wählen Sie dann entweder den Datensatz aus einem einzelnen Video aus, um in Zelle D.2 zu plotten, oder kombinieren Sie die Daten aus mehreren Videos zu einem einzigen Datenrahmen, indem Sie die Zelle D.3 ausführen. Da in diesem Beispiel alle Videos Replikate identischer Stichproben sind, wird der Datensatz gepoolt. Zeichnen Sie schließlich die 2D-Kerneldichte auf, indem Sie die Zelle D.4 ausführen.Wenn Sie zufrieden sind, geben Sie einen Speicherort an, an dem das Diagramm in einer PDF-Datei in Zelle D.5 gespeichert und ausgeführt werden soll. Hier werden repräsentative Bilder der Oberflächenrauheit eines Glasdeckelobjektträgers während der Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht mit einer intakten unterstützten Lipiddoppelschicht und von beispielhaften Proteinen, die auf einem SLB rekonstituiert wurden, gezeigt. Alle vier Beispiele werden im nativen Modus angezeigt, auf den während der Messung selbst zugegriffen werden kann, und als verarbeitete ratiometrische Bilder nach medianbasierter Hintergrundentfernung.Eine Kalibrierung, die den Kontrast in Molekülmasse übersetzt, kann erreicht werden, indem Biomoleküle bekannter Masse über einen Biotin-Streptavidin-Biotin-Komplex an ein SLB gebunden werden. Als beispielhafte Strategie kann man biotinylierte Varianten von Rinderserumalbumin, Protein A, alkalischer Phosphatase und Fibronektin verwenden, die an Streptavidin binden, das selbst an biotinhaltige Lipide in der Membran gebunden ist. Der immer stärker ausgeprägte Kontrast dieser beispielhaften Makromoleküle spiegelt das zunehmende Molekulargewicht der jeweiligen biotinylierten Standards wider.Durch die Zuordnung jedes Peaks der Kontrasthistogramme zur entsprechenden Masse des Oligomerzustandes des Standardproteins wird eine lineare Beziehung zwischen Kontrast und Masse aufgedeckt und kann anschließend für die Analyse unbekannter Makromolekülsysteme genutzt werden. 2D-Korndichteschätzungen sowohl der Masse als auch des Diffusionskoeffizienten von tetravalentem Streptavidin im Komplex mit biotinylierter Aldolase oder mit einem biotinmodifizierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper sind hier dargestellt. Die repräsentativen Bilder zeigen einen Vergleich der ermittelten Oligomermassen für den Komplex von tetravalentem Streptavidin mit Biotin-modifizierter Aldolase oder IgG und erwarteten Molekulargewichten.Mit MSPT können wir Biomoleküle direkt auf Lipidmembranen verfolgen, bestimmen, welche Masse sie haben, wie sie sich bewegen und wie sie interagieren. Ich bin zuversichtlich, dass diese Technik unser Verständnis biologischer Prozesse auf und mit Membranen verändern wird.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Forschung

Biochemie

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Massenspektrometrie und luminogenes-basierte Ansätze zur Charakterisierung von Phase I Metabolic Competency von<em&gt; In Vitro</em&gt; Zellkulturen

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Echtzeit-Tracking der DNA-Fragment-Trennung durch Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...