Name: mass-sensitive particle tracking to characterize membrane-associated macromolecule dynamics
Uploaded: 2022-02-18T15:00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics at JoVE.com

Philipp Kukura, Gavin Young, Refeyn 소프트웨어 팀의 지원에 진심으로 감사드리며 이미지 분석 코드의 일부를 공유함으로써 도움을 인정합니다. 상업용 Refeyn 질량 광도계에 대한 액세스를 제공 한 Cryo-EM MPIB 핵심 시설에 감사드립니다. F.S.는 Jürgen Plitzko와 Wolfgang Baumeister가 부여한 지원과 기금을 감사하게 인정합니다. T.H.와 P.S.는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Project-ID 201269156 - SFB 1032 (A09)를 통해 자금을 지원받았습니다. N.H.는 DFG 반환 보조금 HU 2462/3-1에 의해 지원되었다. P.S.는 독일 연방 교육 연구부 (BMBF)와 막스 플랑크 학회 (Max Planck Society)의 공동 자금 조달 이니셔티브를 통해 연구 네트워크 MaxSynBio를 통한 지원을 인정합니다.

<ol>
	<li>Robertson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+membrane+and+its+protein+constituents.">The lipid bilayer membrane and its protein constituents.</a> Journal of General Physiology. 150 (11), 1472-1483 (2018).</li><li>Grecco, H. E., Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+from+the+Living+Plasma+Membrane.">Signaling from the Living Plasma Membrane.</a> Cell. 144 (6), 897-909 (2011).</li><li>Cho, W., Stahelin, R. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Kukura, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus.">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li><li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface.">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405 (2006).</li><li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+dark-field+microscopy+with+nanometer+spatial+precision+and+microsecond+temporal+resolution.">Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution.</a> Biophysical Journal. 98 (9), 2014-2023 (2010).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Bezeljak, U., Loya, H., Kaczmarek, B., Saunders, T. 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D. B., Kushwah, M. S., Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+photometry+enables+label-free+tracking+and+mass+measurement+of+single+proteins+on+lipid+bilayers.">Mass photometry enables label-free tracking and mass measurement of single proteins on lipid bilayers.</a> Nature Methods. 18 (10), 1247-1252 (2021).</li><li>Voss, O. H., Lee, H. N., Tian, L., Krzewski, K., Coligan, J. 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R., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+AFM+height+spectroscopy+reveals+&#181;s-dynamics+of+unlabeled+biomolecules.">High-speed AFM height spectroscopy reveals &#181;s-dynamics of unlabeled biomolecules.</a> Nature Communications. 9 (1), 4983 (2018).</li><li>Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+the+confined+diffusion+of+cholera+toxin+B-subunit+in+intact+cell+membranes.">Mechanisms underlying the confined diffusion of cholera toxin B-subunit in intact cell membranes.</a> PLOS ONE. 7 (4), 34923 (2012).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

제시된 프로토콜은 유리에 흡착되는 단일 생체 분자의 질량을 분석하는 기술인 질량 광도계(21)를 표지되지 않은 막 상호작용 생체분자의 질량과 확산을 동시에 측정할 수 있는 훨씬 더 다재다능한 도구로 확장한다. 이러한 분석 확장은 분자(24,25)의 측방향 운동에 적응된 변형된 배경 제거 전략의 구현을 통해 달성된다. 일반적으로 유리 표면 거칠기의 강한 산란이 주요 분석 장애를 나타내기 때문에 iSCAT 기반 접근법에서는 배경 제거가 가장 중요하며 입자 질량 및 위치의 정량화를 위해서는 각 픽셀의 로컬 배경에 대한 정확한 결정이 필수적입니다. 입자 운동에 적합한 이미지 분석 외에도 후속 입자 감지, 궤적 연결 및 데이터 분석은 MP를 질량 민감성 입자 추적(MSPT)으로 새롭게 확장합니다.
일반적으로 철저히 청소 된 유리 커버 슬라이드와 깨끗한 작업 환경은 MSPT 실험의 성공적인 성능을 위해 중요한 요구 사항입니다. 거대분자 표지의 부재로 인해, 획득된 신호는 본질적으로 비선택적이다. 따라서 깨끗한 샘플과 적절한 샘플 처리는 관측치가 잘못 해석되지 않도록 하는 데 매우 중요합니다. 특히, 저분자량의 분자를 검사할 때, 단백질이 없는 막의 대조군 측정은 배경 기여도를 평가하기 위해 승인된다(보충 그림 1). 따라서 제어 측정을 포함하는 것 외에도 각 유량 챔버에 대해 그림 2 에 표시된 준비 단계를 따르는 것이 좋습니다. 조합될 때, 이들 안전 조치들은 검출된 신호가 관심있는 생체분자로부터 기원하고, 예를 들어, 오염된 유동 챔버, 버퍼 또는 멤브레인으로부터 유래하지 않도록 보장할 것이다.
실험 설계에 관한 예방 조치 외에도 MSPT 이미지 처리 중에주의해야합니다. 비디오 프로세싱 동안, 정확한 결과를 보장하기 위해 세 개의 파라미터에 대한 값을 신중하게 선택해야 한다: i) 배경 제거를 위한 중앙값 윈도우의 길이, ii) 파티클 검출을 위한 임계값, iii) 링크 할당 동안 최대 검색 반경. 더 큰 중앙값 창 (i)은 일반적으로 중첩된 준불수 배경으로부터 확산 입자의 분리를 용이하게 한다. 그러나 너무 큰 창 크기의 경우 샘플 드리프트가 결국 눈에 띄게되고 배경 추정의 정확도가 떨어집니다. 최적의 설정은 샘플 특성과 측정 조건에 따라 크게 달라집니다. 그럼에도 불구하고 1,001의 값을 강력한 시작점으로 사용할 수 있습니다. 역치 파라미터 (ii)는 샘플에서 예상되는 가장 낮은 분자 질량에 따라 조정되어야 한다. 0.0005 미만의 값은 이 연구에 사용된 질량 광도계로 측정한 경우에는 권장되지 않습니다. 분석 시간을 단축하기 위해 분자량이 높은 샘플이 예상되는 경우 더 높은 값을 선택할 수 있습니다. 궤적 링크(iii)의 검색 반경은 파티클의 이동된 위치가 연속적인 프레임에서 검색될 픽셀 단위의 최대 방사 거리를 지정합니다. 샘플에서 가장 빠른 파티클에 맞게 조정해야 하며, 선호하는 경우 계산 시간을 줄이기 위해 적응형 검색 범위( trackpy 문서 참조)를 대신 사용할 수 있습니다. 특히 프로젝트의 초기 단계에서 다양한 매개 변수로 영화를 다시 분석하여 얻은 결과를 검증하는 것이 좋습니다.
MSPT의 단일 분자 특성에 비추어 볼 때, 정확한 콘트라스트 및 질량 결정을 방해 할 수 있으므로 높은 막 입자 밀도에서 측정하는 것을 피해야합니다. 제곱 마이크로미터당 하나의 입자 미만의 밀도가 MSPT 측정(24)에 유리하다는 것이 밝혀졌다. 추가적인 고려사항은 샘플에서 예상되는 확산 계수입니다. 광범위한 확산 계수에 적용 가능하지만, MSPT는 접근 가능한 확산 계수의 하한을 갖는다. 중앙값 창 기간의 상당 부분 동안 몇 픽셀의 영역에 대한 로컬 제한은 파티클을 정적 배경과 병합합니다. 이 프로토콜에 사용되는 이미징 조건의 경우 0.01μm2/s 미만의 확산 계수를 측정하지 않는 것이 좋습니다. 이러한 확산 속도에서, 예를 들어, 중앙값 윈도우 하프 사이즈 동안 입자의 평균 제곱 변위는 약 4픽셀이고, 따라서 PSF의 범위와 유사한 크기이다. 결과적으로, 정적 배경 추정치는 입자 자체의 신호 기여를 포함할 가능성이 높으며, 이로 인해 결국 노이즈 레벨에 도달할 때까지 입자의 대비가 명백하게 감소합니다. 그러나 0.05 ~ 10μm2/s 범위의 거대분자 확산 계수는 명확하게 해결할 수 있습니다.
MSPT 응용 프로그램의 범위를 더욱 확장하기 위해 파티클이 일시적으로 점유되는 픽셀을 제거하거나 더 큰 중앙값 창 크기를 가능하게 하는 샘플 드리프트 보정을 통해 중앙값 기반 백그라운드 알고리즘의 발전을 구상할 수 있습니다. 두 접근법 모두 높은 입자 밀도와 느린 확산에서의 측정과 관련된 문제를 완화 할 것입니다. 낮은 질량 감도 측면에서 개선은 50kDa보다 작은 생체 분자에 대한 액세스를 제공 할 수있는 새로운 세대의 질량 광도계로 지평선에 있습니다. 따라서, 미래의 MSPT 실험은 쿠션된 이중층 및 거대분자 시스템과 같은 훨씬 더 넓은 범위의 막 모방체에 대한 단일 분자 역학 및 막 관련 상호작용을 연구할 수 있을 것이다.

한때 광범위한 주변 물리적 조건에 대한 장벽으로 인식되던 생물학적 막은 오늘날 기능적 실체 및 촉매 플랫폼(1,2)으로 간주된다. 막-관련 거대분자 반응에 반응하여 신호를 국소화, 증폭 및 지시하는 능력에 기초하여, 지질 계면은 막 밀매 및 신호전달 캐스케이드 3,4,5와 같은 매우 다양한 세포 과정에 중요한 요소를 구성한다. 안정한 복합체의 조립을 위한 핵형성 부위로서 작용하는, 막 부착은 종종 거대분자의 막-연관 형태와 세포질 형태 사이의 동적 평형에 의존하며, 따라서 일시적인 성질의 6,7이다.
생물학에서 그들의 큰 중요성에도 불구하고, 지금까지 실시간7,8에서 막-관련 거대분자 반응의 구성적, 공간적, 시간적 이질성에 대한 접근을 제공할 수 있는 방법을 개발하는 것은 도전적이었다. 기본 분자 과정을 해결하기 위해 두 가지 실험 측면이 결정적입니다 : 충분한 시간 분해능과 단일 입자 감도. 따라서, 광표백 후 형광 회복(FRAP)과 같은 앙상블 평균 기술뿐만 아니라 훨씬 더 민감한 형광 상관 분광법(FCS)도 시간 정보로부터 공간 정보를 크게 분리하기 때문에 한계가 있다(9). 따라서 개별 분자 역학의 특성화를 향한 중요한 단계는 매우 민감한 현미경과 결합 된 단일 입자 추적 (SPT)의 출현이었습니다. 특히, 두 가지 SPT 접근법이 이와 관련하여 효과적인 것으로 입증되었습니다. 첫째, 형광단을 표지로 활용하고 그에 상응하는 형광 검출 시스템은 나노미터 정밀도와 밀리초 시간 분해능10,11,12를 위한 길을 열었다. 둘째, 금 나노입자를 이용한 산란 기반 검출은 서브나노미터 및 마이크로초 범위(각각13,14,15,16)로 국소화 정밀도와 시간 분해능을 모두 향상시켰다. 막-관련 시스템들(17,18)의 기계론적 이해에 관한 접근법들 및 그것들의 중요한 기여들 둘 다의 많은 이점들에도 불구하고, 두 기술들은 지금까지 제한되어 왔다: 그들은 관심 분자들의 라벨링을 필요로 하며, 이는 잠재적으로 그들의 본래의 거동을 교란시키고 막-관련 입자들(19,20)의 분자 구성에 둔감하다.
이러한 두 한계는 최근 질량 광도측정법(MP)21,22,23으로 불리는 새로운 간섭 산란(iSCAT) 기반 접근법의 도입에 의해 극복되었다. 이 기술은 유리 계면에 착륙 할 때 iSCAT 대비에 따라 생체 분자의 용액 내 질량 분포를 결정할 수있게합니다. 그러나, 지질막에 확산되는 이동 분자의 검출 및 특성화를 위해, 보다 정교한 이미지 분석 접근법이 개발되어야 했다. 한편 이것은 성공적으로 구현되었으며, 지질 계면(24,25) 상에서 확산되는 단일 표지되지 않은 생체분자의 분자 질량을 검출, 추적 및 결정할 수 있게 한다. 동적 질량 광도계 또는 질량 민감성 입자 추적(MSPT)으로 지칭되는 이 기술은 이제 추적된 개체의 분자 질량의 변화를 직접 기록함으로써 복잡한 거대분자 상호작용의 평가를 가능하게 하며, 따라서 막 관련 분자 역학의 기계론적 분석을 위한 새로운 가능성을 열어준다.
여기서, MSPT에 필요한 샘플 준비, 이미징 및 데이터 분석 파이프라인을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 특히, 샘플 요구 사항 및 측정 및 분석 중에 발생할 수있는 잠재적 인 문제가 논의됩니다. 또한, 막-상호작용 거대분자 시스템을 분석하기 위한 비할 데 없는 잠재력은 다양한 대표적인 결과를 통해 입증된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>annexin V</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#SRP8026</td>
			<td>examplary membrane-interacting protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>#5000006</td>
			<td>bradford assay kit to determine protein stock concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin labeled bovine albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#A8549</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholera toxin subunit B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#SAE0069</td>
			<td>examplary membrane-interacting protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>#0102062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>#0102242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#850375</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#870273</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#840475</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#840035</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided tape</td>
			<td>tesa</td>
			<td>#57912-00000-02</td>
			<td>needed for the assembly of glass sample chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#610023</td>
			<td>Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#A39261</td>
			<td>maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (Biotinylated)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td>#FNR03-A</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration HMW Calibration Kit</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#28403842</td>
			<td>standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>#860065</td>
			<td>lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)</td>
			<td>#31820</td>
			<td>examplary protein to highlight the existence of different protein states</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10003643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Autofluorescence Immersion Oil</td>
			<td>Olympus K.K.</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET21a-Streptavidin-Alive</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20860</td>
			<td>required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET21a-Streptavidin-Dead</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#20859</td>
			<td>required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#29339</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein A, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#29989</td>
			<td>examplary protein that can be used as standard protein for MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn Acquire</td>
			<td>Refeyn Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>control software for Refeyn OneMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn One</td>
			<td>Refeyn Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>mass photometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile syringe filters 0.45 &#181;m cellulose acetate membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>#514-0063</td>
			<td>needed to filter particles from the buffer of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetravalent streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#SNN1001</td>
			<td>tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 &#181;m Pore Size, 25 mm Circle</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#110603</td>
			<td>a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zepto model 2 plasma cleaner</td>
			<td>Diener electronic GmbH</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass-sensitive particle tracking to characterize membrane-associated macromolecule dynamics

다수의 필수 생물학적 반응이 일어나는 계면인 지질 막에서 거대분자의 단기 또는 일시적 상호작용은 본질적으로 표준 생물물리학적 방법으로 평가하기가 어렵다. 질량 민감성 입자 추적(MSPT)의 도입은 이러한 공정의 철저한 정량적 특성화를 향한 중요한 단계를 구성합니다. 기술적으로, 이것은 간섭 산란 현미경 (iSCAT) 기반 질량 광도계 (MP)의 출현을 통해 가능하게되었습니다. 배경 제거 전략이 막 관련 입자의 이차원 운동을 나타내도록 최적화되면,이 기술은 생물학적 막에서 표지되지 않은 거대 분자의 확산 및 분자 질량 모두를 실시간으로 분석 할 수있게합니다. 여기에서, 막 관련 시스템의 질량 민감성 입자 추적을 수행하고 분석하기 위한 상세한 프로토콜이 설명된다. 상업용 질량 광도계에서 수행되는 측정은 밀리초 단위로 시간 분해능을 달성하며, MP 시스템에 따라 질량 검출 한계가 50kDa까지 내려갑니다. 일반적으로 막-촉매화된 거대분자 역학의 심층 분석을 위한 MSPT의 잠재력을 입증하기 위해, 천연 막 상호작용자 아넥신 V와 같은 예시적인 단백질 시스템에 대해 수득된 결과가 제시된다.

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Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

이 프로토콜은 분자 질량의 동시 조사 및 지질 막과 상호 작용하는 거대 분자의 확산 거동을 가능하게하는 iSCAT 기반 이미지 처리 및 단일 입자 추적 접근법을 설명합니다. 샘플 준비, 질량 대비 변환, 영화 수집 및 사후 처리에 대한 단계별 지침이 잠재적 인 함정을 방지하기위한 지침과 함께 제공됩니다.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

질량에 민감한 입자 추적을 통해 우리는 지질 막에 확산되는 개별 생체 분자를 관찰하고 실시간으로 역학을 정량화 할 수 있으며 모두 완전히 라벨이 없습니다. 라벨이 필요하지 않기 때문에 생체 분자의 동적 행동을 방해 할 위험이 없습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 질량 민감성으로, 이는 우리가 막 결합 된 올리고머 상태를 결정할 수있게 해줍니다.다재다능하기 때문에이 방법을 모든 멤브레인 관련 시스템에 적용 할 수 있습니다. 특히, 리간드-유도된 수용체 복합체의 형성을 연구하는데 사용될 수 있다. PTFE 홀더에 동일한 수의 현미경 슬라이드를 배포하여 시작하십시오.PTFE 홀더를 비커로 옮기십시오. 초순수를 넣고 실온에서 15 분 동안 초음파 처리하십시오. 핀셋을 사용하여 홀더를 옮겨 비커를 청소하고 초순수 이소프로판올을 추가하십시오.다시 15분 동안 초음파 처리한 다음, 다시 이소프로판올을 초순수로 교체하고, 홀더를 함유하는 비커를 15분 동안 초음파 처리한다. 비커에서 홀더를 제거하고 질소 가스 또는 압축 공기의 일정한 흐름 하에서 홀더의 현미경 슬라이드를 불어 건조시킵니다. 대형 현미경 슬라이드가 들어있는 말린 홀더를 플라즈마 클리너에 넣고 전원을 켭니다.평평한 판지를 알루미늄 호일로 감싸십시오. 청소 된 24 밀리미터를 24 밀리미터 현미경 슬라이드를 알루미늄 호일에 펼쳐 서로 충분한 거리로 퍼뜨립니다. 그런 다음 양면 테이프 스트립을 슬라이드의 위쪽 및 아래쪽 가장자리에 부착합니다.각 현미경 슬라이드를 메스로 절제하여 알루미늄 호일에서 제거 할 수 있도록하십시오. 각 슬라이드에는 슬라이드의 위쪽 및 아래쪽 가장자리에 양면 테이프 줄무늬가 부착되어 있어야 합니다. 그런 다음 두 개의 양면 테이프 스트립이 있는 슬라이드를 친수화된 슬라이드에 부착합니다.이것은 더 작은 현미경 슬라이드와 더 큰 현미경 슬라이드 사이의 흐름 경로를 형성합니다. 갓 압출 된 작은 unilamellar 소포 또는 SUV를 필요한 반응 완충액에서 밀리리터 당 0.4 밀리그램의 최종 농도로 희석하십시오. 선택적으로, 소포 파열을 촉진하기 위해, 소포 현탁액에 두 밀리몰 염화칼슘을 첨가한다.유량실을 질량 광도계 스테이지에 장착합니다. 25 마이크로리터의 베시클 현탁액을 유동 챔버 내로 플러시하고, 챔버를 2분 동안 인큐베이션한 다음, 매번 200 마이크로리터의 반응 버퍼로 유동 챔버의 반복 세척을 통해 융합되지 않은 소포를 제거하였다. 지질 막에 융합되지 않은 소포가 없으면 관심있는 단백질 50 마이크로 리터를 샘플 챔버에 첨가하십시오.다음으로 획득 소프트웨어에서 시야각의 크기, 노출 시간, 프레임 속도 및 획득 시간과 같은 이미징 조건을 설정합니다. 초점을 자동으로 조정합니다. 필요한 경우 측면 제어를 사용하여 시야를 균일 한 멤브레인이있는 위치로 이동하십시오.프로젝트 폴더를 만들고 동영상 녹화를 시작합니다. 녹음이 완료되면 획득 소프트웨어가 프롬프트하는 대화 상자에서 파일 이름을 지정하십시오. 동영상은 후속 분석을 위해 MP 파일로 프로젝트 폴더에 자동으로 저장됩니다.녹화된 비디오를 분석하려면 Jupyter 노트북 앱을 실행합니다. 나타나는 폴더 목록에서 MSPT 분석이 수행되는 위치로 이동합니다. ipy 노트북 파일이 저장되고 파일을 클릭하십시오.Jupyter 노트북에서 코드는 셀로 구성되며 단계별로 실행할 수 있습니다. 셀 옆에 있는 작은 재생 단추를 클릭하거나 셀을 선택하고 Shift Enter 키를 눌러 셀을 실행합니다. 먼저 분석에 필요한 모든 패키지를 가져옵니다.다음 셀을 실행하여 파일 프롬프트를 시작합니다. 분석할 MP 비디오 파일이 하나 또는 여러 개 포함된 폴더를 선택하고 폴더 선택을 누릅니다. 선택한 파일 목록이 셀 아래에 인쇄됩니다.픽셀 단위 배경 추정 알고리즘을 사용하여 빛의 지배적 정적 산란을 제거하려면 매개변수 모드의 연속 중앙값 옵션을 선택하고 슬라이딩 중앙값 창에 적절한 길이를 설정합니다. 선택적으로 배경 제거 후 동영상을 True로 설정save_processed_movies여 파티클 감지 및 궤적 연결에 사용하여 동영상을 저장합니다. GPU에서 처리하기 위해 병렬 True 및 GPU False를 설정하거나 GPU에서 처리하기 위해 그 반대로 설정해야 합니다.파티클과 각각의 위치는 영화 전체에서 식별되고 국부화됩니다. 입자 검출의 감도를 이미지 이진화에 의해 후보 스팟을 강조하는 데 사용되는 임계값 파라미터로 조정하십시오. 다양한 임계값 매개 변수가 Movie 시각화라는 별도의 노트북에서 스팟 감지 감도에 미치는 영향을 검사합니다.ipy 노트북. 동영상을 프레임 뷰어에 로드한 후 임계값 슬라이더를 사용하여 파티클 감지 임계값을 조정하고 적절한 설정을 찾습니다. 다른 노트북으로 돌아가서 Python 패키지 trackpy를 사용하여 연속적인 프레임의 파티클을 궤적에 연결하는 세 가지 매개 변수를 선택합니다.최대 예상 확산 속도에 따라 한 프레임에서 다음 프레임으로 파티클의 최대 변위를 설정합니다. 파티클이 사라지고 다시 나타날 수 있지만 여전히 동일한 파티클로 간주될 수 있는 최대 프레임 수를 선택합니다. 점이 너무 적은 궤적은 계수는 확산 계수의 보다 강력한 결정을 위해 파라미터 minimum_trajectory_length을 사용하여 제거될 수 있습니다.셀의 모든 매개 변수를 실행하여 수정합니다. 다음 셀을 실행하여 선택한 매개 변수로 선택한 모든 비디오를 분석합니다. 각 처리 단계의 진행률 표시줄이 셀 아래에 나타납니다.이 작업은 비디오 길이, 매개 변수 설정 및 하드웨어에 따라 다소 시간이 걸릴 수 있습니다. 다음 단계에서 소프트웨어는 점프 거리 분포와 평균 제곱 변위 분석을 기반으로 이전 섹션에서 발견 된 궤적에 대한 확산 계수를 결정합니다. 먼저 동영상 frame_rate를 지정하고 pixel_size합니다.셀을 실행하여 수정 한 다음 다음 셀을 실행하고 trackpy에서 생성 된 모든 CSV 파일이 포함 된 상위 디렉토리를 선택하십시오. 검색된 CSV 파일 목록이 셀 아래에 인쇄됩니다. 다음 셀에서 결과가 저장되는 HDF5 컨테이너의 이름을 선택하고 실행합니다.마지막으로 셀 C.4를 실행하여 확산 분석을 수행합니다. 셀 C.5에서 질량 보정 라인 파라미터에 대한 대비를 입력하는데, 이는 알려진 질량의 샘플을 사용하여 결정된 기울기 및 오프셋을 의미하고 모든 입자 대비를 분자 질량으로 변환하기 위해 이를 실행합니다. 셀 C.6을 실행하여 멤브레인 상의 겉보기 입자 밀도를 평가하고, 이는 검출된 입자의 관점에서 중앙값 밀도 값을 반환하고, 데이터 프레임의 추가 컬럼으로서 각 프레임 동안 궤적을 존재시킨다.질량과 확산 계수의 상관 관계에 대한 최종 플롯을 생성하려면 셀 D.1을 실행하여 파일 프롬프트를 로드하고 MSPT 결과가 포함된 HDF5 파일을 지정한 다음 단일 비디오에서 D.2 셀에 플롯할 데이터 세트를 선택하거나 셀 D.3을 실행하여 여러 비디오의 데이터를 단일 데이터 프레임으로 결합합니다. 이 예제에서는 모든 비디오가 동일한 샘플의 복제물이므로 데이터 집합이 풀링됩니다. 마지막으로 D.4 셀을 실행하여 2D 커널 밀도를 플로팅합니다.만족하면 D.5 셀의 PDF 파일에 플롯을 저장하고 실행할 위치를 지정합니다. 무손상 지지된 지질 이중층, 및 SLB 상에 재구성된 예시적인 단백질의 지지된 지질 이중층의 형성 동안 유리 커버 슬라이드의 표면 거칠기의 대표적인 이미지가 여기에 도시되어 있다. 네 가지 예제 모두 기본 모드로 표시되며, 측정 자체에서 액세스할 수 있으며 중앙값 기반 배경 제거 후 처리된 비율계량 이미지로 표시됩니다.콘트라스트를 분자 질량으로 변환하는 교정은 알려진 질량의 생체 분자를 비오틴-스트렙타비딘-비오틴 복합체를 통해 SLB에 부착함으로써 달성될 수 있다. 예시적인 전략으로서, 소 혈청 알부민, 단백질 A, 알칼리성 포스파타제, 및 피브로넥틴의 비오티닐화 변이체를 사용할 수 있는데, 이는 그 자체가 막 내의 비오틴-함유 지질에 결합되는 스트렙타비딘에 결합한다. 이들 예시적인 거대분자들의 점점 더 뚜렷한 대조는 각각의 비오티닐화 표준물질의 증가된 분자량을 반영한다.콘트라스트 히스토그램의 각 피크를 표준 단백질의 올리고머 상태의 상응하는 질량에 할당함으로써, 콘트라스트와 질량 사이의 선형 관계가 밝혀지고 후속적으로 알려지지 않은 거대분자 시스템의 분석에 사용될 수 있다. 비오티닐화 알돌라제와 복합체 또는 비오틴-변형된 염소 항-토끼 IgG 항체와의 복합체에서 4가 스트렙타비딘의 질량 및 확산 계수 둘 다의 2D 커널 밀도 추정이 여기에 제시된다. 대표적인 이미지는 사가 스트렙타비딘의 복합체에 대한 결정된 올리고머 질량과 비오틴-개질된 알돌라제 또는 IgG 및 예상 분자량의 비교를 보여준다.MSPT를 사용하면 지질 막에서 직접 생체 분자를 추적하고, 어떤 질량을 가지고 있는지, 어떻게 움직이는지, 어떻게 상호 작용하는지 결정할 수 있습니다. 나는이 기술이 멤브레인 안팎에서 생물학적 과정에 대한 우리의 이해를 변화시킬 것이라고 확신합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

연구

생화학

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을<em&gt; 체외</em&gt; 세포 배양

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Smartphone을 이용한 DNA 단편 분리 실시간 추적

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...