Name: evaluation of a reliable biomarker in a cecal ligation and puncture-induced mouse model of sepsis
Uploaded: 2022-12-09T12:30:00
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Nous remercions le professeur Wang Wei et le docteur Liu Shuai pour leur aide dans les expériences. Ce travail a été financé par des subventions du Young Research Funding de l’hôpital Xiangya, Central South University (n ° 2019Q10), de la Fondation nationale et scientifique de la province du Hunan (n ° 2020JJ4902) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 82202394).

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives approuvées par le Comité d’examen des animaux de l’hôpital Xiangya et de l’Université centrale du Sud (n ° 202103149).
1. Préparation
<ol><li>Sélectionnez les souris C57BL/6J mâles (poids : 20-25 g ; âge : 8-12 semaines) et hébergez-les pendant 3 jours avant d’effectuer toute procédure.</li>
	<li>Pesez la souris.</li>
	<li>Anesthésiez la souris avec 1,5% d’isoflur...

<ol>
	<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+international+consensus+definitions+for+sepsis+and+septic+shock+(Sepsis-3).">The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Shankar-Hari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+new+definition+and+assessing+new+clinical+criteria+for+septic+shock:+For+the+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).</li><li>Fleischmann-Struzek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+of+hospital-+and+ICU-treated+sepsis:+results+from+an+updated+and+expanded+systematic+review+and+meta-analysis.">Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis.</a> Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).</li><li>Evans, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+sepsis+campaign:+international+guidelines+for+management+of+sepsis+and+septic+shock+2021.">Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021.</a> Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).</li><li>Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+interventions+to+reduce+peripheral+blood+culture+contamination+in+acute+care:+a+systematic+review+protocol.">The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol.</a> Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).</li><li>Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+sepsis+in+critical+care.">Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).</li><li>Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture:+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis.">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis.</a> Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).</li><li>Hotchkiss, R., Karl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+sepsis.">The pathophysiology and treatment of sepsis.</a> The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).</li><li>Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+peptidylarginine+deiminase+reduces+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+tissue+injury+in+severe+acute+pancreatitis.">Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+peptidylarginine+deiminase+alleviates+LPS-induced+pulmonary+dysfunction+and+improves+survival+in+a+mouse+model+of+lethal+endotoxemia.">Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia.</a> European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullinated+histone+H3+as+a+therapeutic+target+for+endotoxic+shock+in+mice.">Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).</li><li>Li, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+citrullinated+histone+H3+as+a+potential+serum+protein+biomarker+in+a+lethal+model+of+lipopolysaccharide-induced+shock.">Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock.</a> Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).</li><li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CitH3:+a+reliable+blood+biomarker+for+diagnosis+and+treatment+of+endotoxic+shock.">CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+plasmo-photoelectronic+nanostructure+biosensor+detects+an+infection+biomarker+accompanying+cell+death+in+neutrophils.">An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils.</a> Small. 16 (1), 1905611 (2020).</li><li>Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+various+methods+of+blood+sampling+in+mice+and+rats:+Effects+on+animal+welfare.">A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare.</a> Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).</li><li>Brook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+mouse+model+for+neonatal+polymicrobial+sepsis.">A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).</li><li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture.">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).</li><li>Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+factors+affecting+mortality+rate+after+sepsis+in+a+murine+cecal+ligation+and+puncture+model.">Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model.</a> Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).</li></ol>

CLP introduit des agents pathogènes dans l’abdomen pour créer un modèle préclinique de septicémie. Lors de l’exécution du CLP, il est important d’utiliser des conditions stériles pour éliminer l’interférence des bactéries exogènes et d’utiliser des dosages précis d’anesthésiques16. Les trois aspects techniques du CLP qui affectent la gravité et la reproductibilité du modèle de septicémie sont le pourcentage de caecum ligaturé, la taille de l’aiguille utilisée pour ...

La septicémie est définie comme un dysfonctionnement d’organe potentiellement mortel causé par une réponse dérégulée de l’hôte à l’infection1, et le choc septique est la principale cause de décès dans les cas graves de septicémie2. La septicémie et le choc septique causent des millions de décès dans le monde chaque année3. La clé pour améliorer les résultats des patients atteints de septicémie est l’initiation rapide de traitements tels que les antibiotiques4. La méthode de référence pour le diagnostic de la septicémie est la culture microbienne; Cependant, la culture microbienne prend beaucoup de temps et peut conduire à des résultats faussement positifs et faussement négatifs, ce qui limite considérablement la signification clinique5. Ainsi, il est hautement souhaitable d’identifier un biomarqueur sanguin de la septicémie. La procalcitonine est reconnue comme un biomarqueur idéal de la septicémie mais a une efficacité diagnostique limitée car elle est incapable de distinguer la septicémie des maladies stériles6. 
La ligature et la ponction des cæcaux de souris (CLP) sont couramment utilisées pour créer un modèle de septicémie dans la recherche scientifique. Le CLP est l’un des modèles de septicémie les plus utilisés car il imite la péritonite polymicrobienne, activant à la fois les réponses immunitaires pro-inflammatoires et anti-inflammatoires7. Il est bien admis que le CLP crée un modèle de septicémie plus pertinent sur le plan clinique que les techniques alternatives, telles que l’injection d’endotoxines bactériennes. Par conséquent, le CLP est considéré comme le modèle classique de septicémie à utiliser dans la recherche8. Cependant, un inconvénient majeur du CLP est sa reproductibilité, car la gravité du modèle est affectée par plusieurs facteurs tels que le pourcentage de caecum ligaturé, la taille de l’aiguille, le nombre de ponctions et la technique de laparotomie. Par conséquent, il est nécessaire de normaliser le modèle de septicémie induite par CLP. La présente étude décrit les détails du protocole du modèle de septicémie induite par CLP pour montrer la procédure standardisée et augmenter sa reproductibilité.
La réponse inflammatoire se produit au stade précoce de la septicémie, les neutrophiles libérant des quantités excessives d’oxydants et de protéases qui causent des dommages aux organes8. Un facteur clé dans la physiopathologie de la septicémie est la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui libèrent des composants nucléaires et cytosoliques tels que l’ADN, les histones citrullinées et les protéinases antimicrobiennes9. Des études récentes suggèrent qu’une production excessive de TNE médie la pathologie de la septicémie; pendant ce temps, une diminution des TNE, par inhibition enzymatique de la peptidyl arginine déiminase (PAD) par des produits chimiques comme YW3-56 ou Cl-amidine, exerce un effet pro-survie dans des modèles murins de septicémie10,11. L’histone citrullinée H3 (CitH3) a été identifiée comme une protéine spécifique de la septicémie en 201112, et des publications ultérieures ont démontré que la concentration circulante de CitH3 est un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie13,14. CitH3 est considéré comme un biomarqueur plus sensible et durable que la procalcitonine, et est plus spécifique pour distinguer la septicémie que les cytokines inflammatoires13.
Dans cette étude, nous avons évalué un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie dans un modèle murin de septicémie induit par CLP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;,5,5&#8217;-tetramethylbenzidine&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems Inc</td>
			<td>DY999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CitH3 monoclonal antibody</td>
			<td>laboratory self developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CitH3 polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Xiangya School of Medicine, Central South University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cl-amidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML2250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>depilatory cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketoprofen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silk sutures (4-0 &#38; 6-0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YW3-56</td>
			<td>GLPBIO</td>
			<td>GC48263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a reliable biomarker in a cecal ligation and puncture-induced mouse model of sepsis

La septicémie est une maladie grave qui met la vie en danger et qui se développe rapidement et qui cause des millions de décès chaque année dans le monde. Les chercheurs ont déployé d’énormes efforts pour élucider la physiopathologie de la septicémie à l’aide de divers modèles animaux; le modèle murin de septicémie induite par ligature et ponction des cæcaux (CLP) est largement utilisé dans les laboratoires. Les trois aspects techniques qui affectent la sévérité et la reproductibilité du modèle CLP sont le pourcentage de caecum ligaturé, la taille de l’aiguille utilisée pour la ponction cæcale et le volume de matières fécales pressées dans la cavité abdominale. Le diagnostic rapide et spécifique de la septicémie est un facteur crucial qui affecte le résultat. L’étalon-or pour le diagnostic de la septicémie est la culture microbienne; Cependant, ce processus prend du temps et est parfois inexact. La détection des biomarqueurs spécifiques de la septicémie est rapide, mais les biomarqueurs existants ne sont pas satisfaisants en raison d’une courte demi-vie, de la non-spécificité et d’une sensibilité insuffisante. Par conséquent, il existe un besoin urgent d’un biomarqueur fiable de la septicémie dans les premiers stades. Des publications antérieures suggèrent que des pièges extracellulaires (TNE) excessifs de neutrophiles se produisent dans la septicémie. L’histone citrullinée H3 (CitH3), en tant que composant NET, est élevée à la fois chez les animaux septiques et les patients, et la présence de CitH3 est un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie. La présente étude visait à décrire un modèle murin standardisé de septicémie induite par CLP et à établir un biomarqueur sanguin fiable de la septicémie. Notre travail pourrait contribuer au diagnostic précoce et précis de la septicémie à l’avenir.

Comme le montre la figure 2A, aucun CitH3 n’a été détecté dans le groupe simulé par transfert Western. La concentration sérique de CitH3 a augmenté de manière significative après la CLP, et cette augmentation a été bloquée par l’inhibition de la formation de TNE via l’administration de YW3-56, un inhibiteur de la MAP10. La figure 2B montre les concentrations de sérumCitH3 déterminées par ELISA. À 24 heures a...

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Evaluation of a Reliable Biomarker in a Cecal Ligation and Puncture-Induced Mouse Model of Sepsis

Ce protocole présente les détails opératoires de la ligature et de la ponction des cæcaux (CLP) dans un modèle murin de septicémie. CLP est l’une des techniques les plus largement utilisées pour créer un modèle animal de septicémie. Par conséquent, un protocole CLP normalisé est nécessaire pour obtenir des résultats de recherche fiables.

Évaluation d’un biomarqueur fiable dans un modèle murin de septicémie induit par ligature et ponction

Sepsis is a severe life-threatening and rapidly developing disease that causes millions of deaths annually worldwide. Researchers have made tremendous ...

L’objectif principal de cette étude est d’utiliser un modèle murin de ligature des cæcaux et de la septicémie induite par ponction pour évaluer un biomarqueur sanguin fiable de la septicémie. La ligature et la ponction des cæcales, ou CLP en abrégé, est un modèle cliniquement pertinent de septicémie. CLP est un modèle couramment utilisé dans la recherche sur la septicémie.L’histone citrullinée H3, ou CitH3, provient de la NETosis induite par la septicémie. Notre étude précédente démontre que CitH3 est un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie. Sélectionnez les souris C57BL/6 mâles.Peser la souris et anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane à 1,5%. Fixez la souris sur un coussin chauffant. Appliquez une crème dépilatoire sur l’abdomen et ne laissez pas plus d’une minute avant de retirer la crème et les cheveux.Préparer des instruments chirurgicaux stériles adaptés à la chirurgie des rongeurs. Désinfectez la peau abdominale avec de l’iode au moins trois fois. Couvrez la zone chirurgicale opératoire avec la draperie chirurgicale stérile appropriée.Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour faire une incision d’environ deux centimètres dans la paroi abdominale, le long de la linea alba. Identifier et isoler le caecum hors de la cavité péritonéale avec une pince à épiler stérile. Ligate 75 volume du caecum avec suture de soie 4-0.Ne ligaturez pas les vaisseaux sanguins mésentériques. À noter, un pourcentage différent de caecum ligaturé détermine la gravité de la septicémie. 25 % conduit à une septicémie de bas grade, 50 % conduit à la septicémie de grade moyen et 75 % conduit à une septicémie de haut grade.Percer le caecum par une perforation traversante avec une aiguille de calibre 21 au milieu entre l’extrémité de la queue et la ligature. Pressez doucement les matières fécales hors du caecum par des trous de pénétration. À noter, la quantité de matières fécales pressées dans la cavité péritonéale doit être constante, car les matières fécales déterminent également la gravité de la septicémie.Replacez doucement le caecum ainsi que les matières fécales dans la cavité abdominale. Fermez la couche musculaire abdominale et la couche de peau avec une suture de soie 6-0. Désinfectez l’incision avec de l’iode.L’injection de kétoprofène, cinq milligrammes par kilogramme, doit être effectuée sur le quadrant inférieur gauche de l’abdomen pour éviter le caecum. Placez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à récupération complète. La souris est logée dans une pièce à température contrôlée et a libre accès à la nourriture et à l’eau.Les animaux seront euthanasiés par surdose de dioxyde de carbone avec des symptômes de septicémie, pertinents pour nos critères d’évaluation prédéfinis basés sur notre étude présentée. Les souris sont divisées au hasard en groupe placebo, groupe CLP et groupe de traitement CLP plus Cl-amidine ou YW3-56. Les souris du groupe simulé reçoivent toutes les procédures CLP, à l’exception de la ligature du caecum et de la ponction.Prélever le sang périphérique 24 heures après l’opération et préparer le sérum par centrifugation. La concentration de CitH3 a été déterminée par transfert Western et un kit ELISA développé par l’unité. Comme le montre la figure deux, aucun CitH3 n’a été détecté dans le groupe fictif.Les taux de CitH3 étaient élevés après l’insertion de CLP, ce qui a été atténué par l’inhibition de la PAD de manière significative. Sur la base de nos données, nous concluons que le CitH3 circulant est un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie.

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