Name: evaluation of a reliable biomarker in a cecal ligation and puncture-induced mouse model of sepsis
Uploaded: 2022-12-09T12:30:00
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Ringraziamo il professor Wang Wei e il dottor Liu Shuai per l'aiuto negli esperimenti. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni del Young Research Funding of Xiangya Hospital, Central South University (n. 2019Q10), dalla National and Science Foundation della provincia di Hunan (n. 2020JJ4902) e dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82202394).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate dal Comitato di revisione degli animali presso l'ospedale di Xiangya e la Central South University (n. 202103149).
1. Preparazione
<ol><li>Selezionare topi maschi C57BL/6J (peso: 20-25 g; età: 8-12 settimane) e alloggiare per 3 giorni prima di eseguire qualsiasi procedura.</li>
	<li>Pesare il mouse.</li>
	<li>Anestetizzare il topo con isoflurano all'1,5% per inalazione e pizz...

<ol>
	<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+international+consensus+definitions+for+sepsis+and+septic+shock+(Sepsis-3).">The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Shankar-Hari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+new+definition+and+assessing+new+clinical+criteria+for+septic+shock:+For+the+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).</li><li>Fleischmann-Struzek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+of+hospital-+and+ICU-treated+sepsis:+results+from+an+updated+and+expanded+systematic+review+and+meta-analysis.">Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis.</a> Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).</li><li>Evans, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+sepsis+campaign:+international+guidelines+for+management+of+sepsis+and+septic+shock+2021.">Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021.</a> Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).</li><li>Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+interventions+to+reduce+peripheral+blood+culture+contamination+in+acute+care:+a+systematic+review+protocol.">The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol.</a> Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).</li><li>Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+sepsis+in+critical+care.">Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).</li><li>Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture:+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis.">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis.</a> Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).</li><li>Hotchkiss, R., Karl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+sepsis.">The pathophysiology and treatment of sepsis.</a> The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).</li><li>Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+peptidylarginine+deiminase+reduces+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+tissue+injury+in+severe+acute+pancreatitis.">Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+peptidylarginine+deiminase+alleviates+LPS-induced+pulmonary+dysfunction+and+improves+survival+in+a+mouse+model+of+lethal+endotoxemia.">Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia.</a> European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullinated+histone+H3+as+a+therapeutic+target+for+endotoxic+shock+in+mice.">Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).</li><li>Li, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+citrullinated+histone+H3+as+a+potential+serum+protein+biomarker+in+a+lethal+model+of+lipopolysaccharide-induced+shock.">Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock.</a> Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).</li><li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CitH3:+a+reliable+blood+biomarker+for+diagnosis+and+treatment+of+endotoxic+shock.">CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+plasmo-photoelectronic+nanostructure+biosensor+detects+an+infection+biomarker+accompanying+cell+death+in+neutrophils.">An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils.</a> Small. 16 (1), 1905611 (2020).</li><li>Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+various+methods+of+blood+sampling+in+mice+and+rats:+Effects+on+animal+welfare.">A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare.</a> Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).</li><li>Brook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+mouse+model+for+neonatal+polymicrobial+sepsis.">A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).</li><li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture.">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).</li><li>Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+factors+affecting+mortality+rate+after+sepsis+in+a+murine+cecal+ligation+and+puncture+model.">Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model.</a> Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).</li></ol>

Il CLP introduce agenti patogeni nell'addome per creare un modello preclinico di sepsi. Quando si esegue il CLP, è importante utilizzare condizioni sterili per eliminare l'interferenza dei batteri esogeni e utilizzare dosaggi accurati di anestetici16. I tre aspetti tecnici del CLP che influenzano la gravità e la replicabilità del modello di sepsi sono la percentuale del cieco legato, la dimensione dell'ago utilizzato per la puntura cecale e il volume di feci schiacciate nella cavità addominale...

La sepsi è definita come una disfunzione d'organo pericolosa per la vita causata da una risposta disregolata dell'ospite all'infezione1 e lo shock settico è la principale causa di morte nei casi gravi di sepsi2. La sepsi e lo shock settico causano milioni di morti in tutto il mondo ogni anno3. La chiave per migliorare l'esito dei pazienti con sepsi è l'inizio tempestivo di trattamenti come gli antibiotici4. Il metodo gold standard per la diagnosi di sepsi è la coltura microbica; Tuttavia, la coltura microbica richiede molto tempo e può portare a risultati falsi positivi e falsi negativi, che limitano notevolmente il significato clinico5. Pertanto, è altamente desiderabile identificare un biomarcatore del sangue della sepsi. La procalcitonina è riconosciuta come un biomarcatore ideale per la sepsi, ma ha un'efficacia diagnostica limitata perché non è in grado di distinguere la sepsi dalle malattie sterili6. 
La legatura e puntura cecale del topo (CLP) è comunemente usata per creare un modello di sepsi nella ricerca scientifica. Il CLP è uno dei modelli di sepsi più utilizzati perché imita la peritonite polimicrobica, attivando risposte immunitarie sia proinfiammatorie che antinfiammatorie7. È ben noto che il CLP crea un modello di sepsi clinicamente più rilevante rispetto a tecniche alternative, come l'iniezione di endotossina batterica. Pertanto, il CLP è considerato il modello classico di sepsi da utilizzare nella ricerca8. Tuttavia, uno dei principali svantaggi del CLP è la sua riproducibilità, poiché la gravità del modello è influenzata da diversi fattori come la percentuale di cieco legato, la dimensione dell'ago, il numero di punture e la tecnica di laparotomia. Pertanto, è necessario standardizzare il modello di sepsi indotta da CLP. Il presente studio descrive i dettagli del protocollo del modello di sepsi indotta da CLP per mostrare la procedura standardizzata e aumentarne la riproducibilità.
La risposta infiammatoria si verifica nella fase iniziale della sepsi, con i neutrofili che rilasciano quantità eccessive di ossidanti e proteasi che causano danni agli organi8. Un fattore chiave nella fisiopatologia della sepsi è la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET), che rilasciano componenti nucleari e citosolici come DNA, istoni citrullinati e proteinasi antimicrobiche9. Studi recenti suggeriscono che l'eccessiva generazione di NET media la patologia della sepsi; nel frattempo, una diminuzione dei NET, attraverso l'inibizione enzimatica della peptidil arginina deiminasi (PAD) da parte di sostanze chimiche come YW3-56 o Cl-amidina, esercita un effetto pro-sopravvivenza nei modelli murini di sepsi10,11. L'istone citrullinato H3 (CitH3) è stato identificato come proteina specifica per la sepsi nel 201112, e successive pubblicazioni hanno dimostrato che la concentrazione circolante di CitH3 è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi13,14. CitH3 è considerato un biomarcatore più sensibile e duraturo della procalcitonina ed è più specifico nel distinguere la sepsi rispetto alle citochine infiammatorie13.
In questo studio, abbiamo valutato un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi in un modello murino di sepsi indotto da CLP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;,5,5&#8217;-tetramethylbenzidine&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems Inc</td>
			<td>DY999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CitH3 monoclonal antibody</td>
			<td>laboratory self developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CitH3 polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Xiangya School of Medicine, Central South University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cl-amidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML2250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>depilatory cream</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketoprofen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silk sutures (4-0 &#38; 6-0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical instruments&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YW3-56</td>
			<td>GLPBIO</td>
			<td>GC48263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a reliable biomarker in a cecal ligation and puncture-induced mouse model of sepsis

La sepsi è una grave malattia pericolosa per la vita e in rapido sviluppo che causa milioni di morti ogni anno in tutto il mondo. I ricercatori hanno compiuto enormi sforzi per chiarire la fisiopatologia della sepsi utilizzando vari modelli animali; il modello murino di sepsi indotta dalla legatura e puntura cecale (CLP) è ampiamente utilizzato nei laboratori. I tre aspetti tecnici che influenzano la gravità e la replicabilità del modello CLP sono la percentuale di cieco legato, la dimensione dell'ago utilizzato per la puntura cecale e il volume di feci schiacciate nella cavità addominale. La diagnosi rapida e specifica della sepsi è un fattore cruciale che influenza l'esito. Il gold standard per la diagnosi della sepsi è la coltura microbica; Tuttavia, questo processo richiede molto tempo e talvolta è impreciso. La rilevazione di biomarcatori specifici per la sepsi è rapida, ma i biomarcatori esistenti sono insoddisfacenti a causa di una breve emivita, non specificità e sensibilità insufficiente. Pertanto, vi è un urgente bisogno di un biomarcatore affidabile di sepsi nelle fasi iniziali. Pubblicazioni precedenti suggeriscono che eccessive trappole extracellulari dei neutrofili (NET) si verificano nella sepsi. L'istone citrullinato H3 (CitH3), come componente NET, è elevato sia negli animali settici che nei pazienti e la presenza di CitH3 è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi. Il presente studio mirava a descrivere un modello murino standardizzato di sepsi indotta da CLP e stabilire un biomarcatore ematico affidabile della sepsi. Il nostro lavoro può contribuire alla diagnosi precoce e accurata della sepsi in futuro.

Come mostrato nella Figura 2A, nessun CitH3 è stato rilevato nel gruppo fittizio mediante western blotting. La concentrazione sierica di CitH3 è aumentata significativamente dopo CLP, e questo aumento è stato bloccato dall'inibizione della formazione di NET attraverso la somministrazione di YW3-56, un inibitore della PAD10. La Figura 2B mostra le concentrazioni sieroCitH3 determinate da ELISA. A 24 ore dopo CLP, la concentrazi...

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Evaluation of a Reliable Biomarker in a Cecal Ligation and Puncture-Induced Mouse Model of Sepsis

Questo protocollo presenta i dettagli operativi della legatura e puntura cecale (CLP) in un modello murino di sepsi. Il CLP è una delle tecniche più utilizzate per creare un modello animale di sepsi. Pertanto, è necessario un protocollo CLP standardizzato per il raggiungimento di risultati di ricerca affidabili.

Valutazione di un biomarcatore affidabile in un modello murino di sepsi indotta da legatura cecale e puntura

Sepsis is a severe life-threatening and rapidly developing disease that causes millions of deaths annually worldwide. Researchers have made tremendous ...

Lo scopo principale di questo studio è quello di utilizzare il modello murino di legatura cecale e sepsi indotta da puntura per valutare biomarcatori ematici affidabili della sepsi. La legatura e la puntura cecale, o CLP in breve, sono un modello clinicamente rilevante di sepsi. Il CLP è un modello comunemente usato nella ricerca sulla sepsi.L'istone citrullinato H3, o CitH3, ha origine dalla NETosi indotta dalla sepsi. Il nostro studio precedente dimostra che CitH3 è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi. Seleziona topi maschi C57BL / 6.Pesare il topo e anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano all'1,5%. Fissare il mouse su una piastra riscaldante. Applicare la crema depilatoria sull'addome e lasciare per non più di un minuto prima di rimuovere la crema e i capelli.Preparare strumenti chirurgici sterili adatti alla chirurgia degli animali roditori. Disinfettare la pelle addominale con iodio almeno tre volte. Coprire l'area chirurgica operatoria con il giusto panno chirurgico sterile.Utilizzare forbici chirurgiche sterili per fare un'incisione di circa due centimetri nella parete addominale, lungo la linea alba. Identificare e isolare il cieco dalla cavità peritoneale con pinzette sterili. Ligate 75 volume del cieco con sutura di seta 4-0.Non ligare i vasi sanguigni mesenterici. Da notare, una diversa percentuale di cieco legato determina la gravità della sepsi. Il 25% porta a una sepsi di basso grado, il 50% porta alla sepsi di medio grado e il 75% porta a una sepsi di alto grado.Forare il cieco con una perforazione passante con un ago di calibro 21 nel punto medio tra l'estremità della coda e la legatura. Spremere delicatamente le feci dal cieco attraverso i fori di penetrazione. Da notare, la quantità di feci schiacciate nella cavità peritoneale dovrebbe essere coerente, poiché le feci determinano anche la gravità della sepsi.Sostituire delicatamente il cieco e le feci nella cavità addominale. Chiudere lo strato muscolare addominale e lo strato di pelle con sutura di seta 6-0. Disinfettare l'incisione con iodio.L'iniezione di ketoprofene, cinque milligrammi per chilogrammo, deve essere eseguita sul quadrante inferiore sinistro dell'addome per evitare il cieco. Posizionare il mouse su una piastra riscaldante fino al completo recupero. Il topo è alloggiato in una stanza a temperatura controllata e ha libero accesso a cibo e acqua.Gli animali saranno sottoposti a eutanasia per overdose di anidride carbonica con sintomi di sepsi, rilevanti per i nostri endpoint predefiniti sulla base del nostro studio presentato. I topi sono divisi casualmente nel gruppo sham, nel gruppo CLP e nel gruppo di trattamento CLP più Cl-amidina o YW3-56. I topi nel gruppo fittizio ricevono tutte le procedure CLP tranne la legatura e la puntura del cieco.Prelevare il sangue periferico a 24 ore dopo l'intervento e preparare il siero mediante centrifugazione. La concentrazione di CitH3 è stata determinata mediante western blotting e un kit ELISA auto-sviluppato. Come mostrato nella figura due, nessun CitH3 è stato rilevato nel gruppo fittizio.I livelli di CitH3 erano elevati dopo l'inserimento di CLP, che è stato attenuato dall'inibizione della PAD in modo significativo. Sulla base dei nostri dati, concludiamo che CitH3 circolante è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi.

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