Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

نحن ممتنون ل Jie Li (جامعة ماريلاند ، كوليدج بارك) للمناقشات القيمة حول التفكك الجنيني و FACS. نشكر Vi M. Quach و Camille Lombard-Banek للمساعدة في إعداد العينات وجمع البيانات في الدراسات السابقة التي تجسد التطبيقات البروتينية التي تم تسليط الضوء عليها في هذا البروتوكول. تم دعم أجزاء من هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم تحت رقم الجائزة IOS-1832968 CAREER (إلى PN) ، والمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R35GM124755 (إلى PN) ، وبرنامج شراكة المعهد الوطني للسرطان بجامعة ماريلاند (إلى PN) ، وجوائز أبحاث مؤسسة COSMOS Club (إلى ABB و L.R.P.).

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي تضمن الصيانة الإنسانية والتعامل مع الضفادع البالغة Xenopus laevis من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة ماريلاند ، كوليدج بارك (أرقام الموافقة R-DEC-17-57 و R-FEB-21-07).
1. إعداد الحلول
<ol><li>لعلم الأجنة<ol><li>قم بإعدا...

يتيح هذا البروتوكول توصيف تعبير البروتين في سلالات الخلايا المحددة في أجنة أنواع Xenopus. انطلاقا من نظام إدارة الموارد البشرية ، تجمع المنهجية بين الخصوصية الرائعة في التحديد الجزيئي ، والقدرة على الكشف عن البروتينات المتعددة بدون تحقيقات جزيئية (عادة مئات إلى آلاف البروتينات المختلف...

إن فهمنا لتمايز الخلايا ونشأة الأنسجة والأعضاء هو نتيجة عقود من الشاشات المستهدفة المعقدة للجينات ومنتجاتها. إن زيادة معرفتنا بجميع الجزيئات الحيوية وكمياتها خلال الأحداث الخلوية المهمة من شأنه أن يساعد في كشف الآليات الجزيئية التي تتحكم في الأنماط المكانية والزمانية لخطة جسم الفقاريات. أصبحت التقنيات التي تمكن من التضخيم الجزيئي والتسلسل قادرة الآن على الإبلاغ بشكل روتيني عن أعداد كبيرة من الجينات والنسخ ، مما يدعم الدراسات القائمة على الفرضيات في البحوث البيولوجية الأساسية والانتقالية. لفهم الأنظمة النامية ، تدعو العلاقة المعقدة بين النسخ والترجمة إلى التحليل المباشر للبروتينات المتعددة وتعديلاتها اللاحقة للترجمة. بدأت البروتينات العالمية التي تستخدم الأنظمة البيولوجية في المختبر ، مثل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، في تحديد آليات تحريض الأنسجة 1,2. في الكائنات الحية المعقدة ، مثل جنين الفقاريات ، يعتمد التطور على تدرجات المورفوجين في سياق المكان والزمان3. ويترتب على ذلك أن اكتساب المعرفة بالتغيرات البروتينية مع تمايز الخلايا لتشكيل أنسجة متخصصة ، مثل الأنسجة العصبية ، يوفر مفتاحا لإطلاق البرامج الجزيئية التي تتحكم في التطور الطبيعي والمعيب وتوجيه علاجات الجيل التالي.
الضفدع ذو المخالب الفقارية في جنوب إفريقيا (Xenopus laevis) هو نموذج راسخ في البيولوجيا الخلوية والتنموية والعصبية والتجديدية. سلطت جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاءأو الطب 4,5 لعام 2012 التي حصل عليها السير جون جوردون لاكتشاف تعدد قدرات النواة الجسدية الضوء على أهمية هذا النموذج للاكتشافات في الدراسات الأساسية والانتقالية. تتطور أجنة Xenopus خارجيا إلى الأم ، مما يسهل التلاعب المباشر بالخلايا واستنساخ الخلايا والتعبير الجيني على مراحل مختلفة من التطور. مكن التصبغ غير المتماثل وانقسامات الخلايا النمطية من رسم خرائط المصير القابلة للتكرار من الجنين المكون من 16-6 و 32 خلية 7,8. بالنسبة للبروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS) ، تشمل المزايا الإضافية للنموذج حجما كبيرا نسبيا (~ 1 مم في القطر) ، والذي ينتج محتوى بروتينيا وفيرا للتحليل (~ 130 ميكروغرام في أجنة مرحلة الانقسام المبكرة ، ~ 10 ميكروغرام من محتوى البروتين في خلايا مفردة من الجنين المكون من 16 خلية)9,10.
في الوقت الحاضر ، HRMS هي التكنولوجيا الرائدة المفضلة للكشف عن البروتينات. تتيح هذه التقنية الكشف المباشر والحساس والمحدد والقياس الكمي للبروتينات المتعددة ، وعادة ما تكون مئات إلى آلاف البروتينات المختلفة11. تتضمن البروتينات من أسفل إلى أعلى بواسطة HRMS سلسلة من الخطوات المترابطة. بعد الاستخراج من عينة الخلية / الأنسجة ، يتم هضم البروتينات بإنزيم محلل للبروتين ، مثل التربسين (البروتينات من أسفل إلى أعلى). يتم فصل الببتيدات الناتجة بناء على خصائصها الفيزيائية والكيميائية المختلفة ، بما في ذلك الكارهة للماء (كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي ، LC) ، الشحنة الصافية (كروماتوغرافيا التبادل الأيوني) ، الحجم (كروماتوغرافيا استبعاد الحجم) ، أو الحركة الكهربائية (الرحلان الكهربائي الشعري ، CE). ثم يتم شحن الببتيدات (المتأينة) ، عادة باستخدام التأين بالرش الكهربائي (ESI) ، ويتم الكشف عن أيونات الببتيد وتسلسلها عبر تجزئة الطور الغازي بواسطة نظام إدارة الموارد البشرية الترادفي. يتم تعيين بيانات الببتيد الناتجة إلى بروتين الكائن الحي قيد الدراسة. مع ارتباط شدة إشارة أيون الببتيد الخاصة بالبروتين (البروتيني) بالتركيز ، يمكن إجراء القياس الكمي للبروتين بدون ملصق أو قائم على الملصق (تكميم تعدد الإرسال). تنتج بروتينات HRMS موردا غنيا من المعلومات حول الحالة الجزيئية للنظام قيد الدراسة ، مما يسمح بتوليد الفرضيات ومتابعة الدراسات الوظيفية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> الشكل 1: البروتينات القابلة للتطوير المكاني الزماني التي تمكن بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلية في الجنين النامي (الضفدع). (أ) تصور العينة (1) باستخدام مجهر مجسم (2) لحقن خلية محددة (أقحم) ، باستخدام ماصة دقيقة مصنعة (3) تحت السيطرة من خلال مرحلة الترجمة (4). ب: أخذ عينات تحت خلوية من الخلية D 11 اليسرى المحددة في جنين مكون من16 خلية. ج: تشريح خلية D 11 كاملة من جنين مكون من16 خلية. (د) تتبع الفلورسنت (الأخضر) لنسل D111 الأيسر والأيمن من جنين مكون من 32 خلية لتوجيه تشريح الأديم الظاهر العصبي (NE) في المعدة (المرحلة 10) وعزل النسيج المنحدر من الشرغوف باستخدام FACS. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر للأجنة ، 1.25 مم للقارورة. تم تكييف الأرقام بإذن من المراجع15،19،21،59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يتيح البروتوكول المقدم هنا القياس الكمي القائم على نظام إدارة الموارد البشرية لأعداد كبيرة من البروتينات في الخلايا / الأنسجة المحددة في أجنة X. laevis النامية. يعتمد النهج على التحديد الدقيق للخلايا ، وخرائط مصير الخلية القابلة للتكرار ، والمنهجيات المعمول بها لتتبع سلالات الخلايا في هذا النموذج البيولوجي6،7،8. كما هو موضح في الشكل 1، ندرس البروتينات من الخلايا المفردة عن طريق استخدام تشريح الخلية الكاملة أو أخذ العينات المجهرية الشعرية لشفط المحتوى الخلوي. تسمح لنا مراقبة نسب الخلية بدراسة التطور الزماني المكاني للبروتين حيث تشكل الخلايا الأنسجة أثناء المعدة. يتم تمييز ذرية الخلية بالفلورسنت عن طريق حقن فلوروفور مترافق مع ديكستران خامل أو mRNA للبروتين الفلوري (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر ، أو GFP). يتم عزل النسل المسمى في النقاط الزمنية التطورية المطلوبة. أثناء المعدة ، يمكن عزل الحيوانات المستنسخة الخلوية المتجمعة بإحكام عن طريق التشريح. بعد المعدة ، يمكن توزيع استنساخ الخلايا داخل الجنين بسبب حركات الهجرة ويمكن عزلها عن الأنسجة المنفصلة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). يتم قياس البروتينات في هذه الخلايا والأنسجة عن طريق البروتينات من أسفل إلى أعلى باستخدام HPLC أو CE للفصل و ESI جنبا إلى جنب HRMS لتحديد الهوية. بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلايا قابلة للتطوير لأحجام وسلالات مختلفة داخل الجنين وهي محددة وحساسة وكميتة. من خلال أمثلة مختارة موضحة هنا ، نوضح أيضا أن هذا البروتوكول قابل للتطوير وقابل للتكيف على نطاق واسع مع أنواع مختلفة من الخلايا وسلالات الخلايا.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> الشكل 2: سير عمل التحليل الحيوي. سهل التشريح الدقيق والشفط الشعري ، أو FACS أخذ عينات من محتوى البروتين الخلوي والنسيلي. استنفاد بروتينات صفار البيض الوفيرة وفصلها عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري (CE) أو كروماتوغرافيا السائل ذات التدفق النانوي (LC) حساسية التعريف المعززة (ID) باستخدام التأين الكهربائي (ESI) قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS). كشف القياس الكمي عن عدم التنظيم ، وتوفير معلومات جديدة للدراسات القائمة على الفرضيات بالتزامن مع المعلومات المتاحة من علم الوجود الجيني (GO). تم تكييف الأرقام بإذن من المرجع15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

إن توصيف الأحداث الجزيئية كخلايا تؤدي إلى ظهور الأنسجة والأعضاء يثير إمكانية فهم التطور الطبيعي بشكل أفضل وتصميم علاجات فعالة للأمراض. ومن شأن التكنولوجيات التي تمكن من التحديد الدقيق والقياس الكمي لمختلف أنواع البروتينات وأعدادها الكبيرة أن توفر معلومات لا تزال مفقودة عن الآليات الجزيئية التي تنظم تطور الأنسجة والكائنات الحية في المكان والزمان. هنا ، نقدم بروتوكولا قائما على قياس الطيف الكتلي يتيح قياس آلاف البروتينات في سلالات الخلايا المحددة في أجنة Xenopus laevis (الضفدع). يعتمد هذا النهج على خرائط مصير الخلية القابلة للتكرار والأساليب المعمول بها لتحديد الخلايا وذريتها (الحيوانات المستنسخة) وتسميتها بالفلورسنت وتتبعها وأخذ عينات منها من هذا النموذج لتطور الفقاريات. بعد جمع المحتويات الخلوية باستخدام أخذ العينات المجهرية أو عزل الخلايا عن طريق التشريح أو فرز الخلايا المنشط بالفلورة ، يتم استخراج البروتينات ومعالجتها للتحليل البروتيني من أسفل إلى أعلى. يتم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة والرحلان الكهربائي الشعري لتوفير فصل قابل للتطوير للكشف عن البروتين والقياس الكمي باستخدام قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS). يتم توفير أمثلة تمثيلية للتوصيف البروتيني للخلايا المصيرية للأنسجة العصبية. بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلايا قابلة للتكيف مع الأنسجة والكائنات الحية المختلفة. إنه حساس ومحدد وكمي بما فيه الكفاية للنظر في الديناميات المكانية والزمانية للبروتين أثناء تطور الفقاريات.

مكن هذا البروتوكول من دراسة البروتينات في الخلايا المفردة وأنسابها أثناء قيامها بإنشاء الأنسجة في أجنة X. laevis. يوضح الشكل 1 أحد هذه التطبيقات لنهج دراسة البروتينات في الخلايا المصيرية للأنسجة العصبية والأديم الظاهر العصبي المستحث حديثا في الجنين. كما هو موضح في <strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

نصف هنا توصيفا بروتينيا قائما على قياس الطيف الكتلي لسلالات الخلايا ذات مصائر الأنسجة المعروفة في جنين الفقاريات Xenopus laevis .

البروتيوميات قياس الطيف الكتلي الموجه بسلالة الخلية في الجنين النامي (الضفدع)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

يتيح هذا النهج الموجه بالنسب التحليل البروتيني للأحداث التنموية المهمة بدقة مكانية وزمانية داخل جنين الفقاريات الذي ينقل معلومات لا يمكن الوصول إليها من خلال قياسات الجنين الكاملة. يمكن توسيع هذا النهج بسهولة لدراسة البروتينات والمستقلبات والنسخ من الخلايا الجنينية المختلفة أثناء تمايزها أثناء التطور. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهمنا للآليات الجزيئية التي تتحكم في التطور الطبيعي والمرض ، بما في ذلك آليات تحريض الأنسجة والالتزام بمصير الخلية أثناء التطور المبكر.استخدم حلقة شعر لتوجيه كل جنين إلى بئر ووضعه برفق بحيث تكون الخلية المستهدفة موضع الاهتمام في الزاوية اليمنى للإبرة الدقيقة. اتبع خرائط مصير الأنسجة xenopus laevis لتحديد خلية السلائف من سلالة الاهتمام. استخدم ملقطين شحذين لإزالة غشاء فيتيلين المحيط بالجنين برفق.عزل الخلايا المفردة عن الجنين عن طريق التشريح اليدوي باستخدام الملقط. ابدأ بإعداد إبرة الحقن التي تحتوي على محلول تتبع النسب. قم بتركيب إبرة الحقن المجهري في حامل ماصة دقيق يتم التحكم فيه بواسطة مناور دقيق متعدد المحاور.قم بتوصيل حامل الماصة الصغير بحاقن دقيق واملأ الإبرة بمقتفي النسب عن طريق الضغط السلبي. قم بمعايرة الإبرة وضبط حجم طرف الإبرة ووقت الحقن لتقديم ما يقرب من نانولتر واحد من محلول تتبع النسب المقاس بالزيت المعدني. تأكد من أن حجم القطرة التي يتم حقنها دقيق واضبط إعدادات الحاقن إذا لزم الأمر.اغمر طبق الطين بالحقن الدقيق بمحلول 3٪ fCAL وانقل ما يقرب من 10 أجنة إلى طبق الطين باستخدام ماصة نقل. حقن الخلايا ذات الأهمية مع ما يقرب من نانولتر واحد من ديكستران الفلورسنت أو 200 بيكوغرام من GFP mRNA. باستخدام مجهر ستيريو ، تأكد من نجاح وضع العلامات على الخلايا.تأكد من حقن الخلية المقصودة فقط. تجاهل الأجنة التي تحتوي على خلايا مصابة أو مصنفة بشكل غير صحيح وفقا للسياسات المؤسسية. نقل الأجنة المحقونة إلى طبق بتري يحتوي على 0.5x محلول شتاينبرغ.استزراعهم بين 14 إلى 25 درجة مئوية حتى يصلوا إلى مرحلة النمو المطلوبة. نقل ثلاثة إلى خمسة أجنة إلى طبق أجار يحتوي على 0.2x محلول شتاينبرغ للتشريح الدقيق. استخدم ملقط لتشريح الاستنساخ المسمى من الجنين.اجمع الأنسجة المشرحة باستخدام ماصة من 0.5 إلى 10 ميكرولتر وقم بإيداعها في ملف طرد مركزي صغير. باستخدام ماصة ، قم بشفط الوسائط المحيطة بالأنسجة المجمعة للحد من الأملاح في العينة لتجنب التداخل مع تحليل HRMS. قم بتجميد الخلايا المعزولة على الفور عن طريق وضع قارورة العينة على الثلج الجاف أو النيتروجين السائل.قم بتخزين العينات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليل قياس الطيف الكتلي. لمعالجة عينة الخلية الواحدة بواسطة CE ، قم بتشويه البروتينات عن طريق تسخين العينة إلى 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا. ثم قم بموازنة العينة مع درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق وأضف التربسين إلى العينات للهضم.للتحليل بواسطة NanoLC ، قم بتحليل ما يصل إلى خمسة أنسجة تشريح في 50 ميكرولتر من محلول التحلل. قم بتسهيل العملية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. لمعالجة الأنسجة المشرحة ، احتضان المحللة عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.ثم حبيبات حطام الخلية والصفائح الدموية صفار البيض عند أربع درجات مئوية عن طريق التمركز عند 4،500 RCF. انقل المادة الطافية إلى قارورة طرد مركزي صغيرة نظيفة وأضف 10٪ SDS للحصول على تركيز نهائي قدره 1٪ SDS في المحلل. بالنسبة للأنسجة، أضف 0.5 مولار ديثيوثريتول إلى المحللة للحصول على تركيز نهائي يبلغ حوالي 25 ملي مولار.ثم احتضان المحللة لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية لتقليل روابط ثاني كبريتيد البروتينات كيميائيا. أضف 0.5 مولار يودواسيتاميد للحصول على التركيز النهائي لحوالي 75 مليمولار في المحللة واحتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أضف 0.5 مولار ثنائي ثيوثريتول نفس الحجم الأولي لإخماد المتفاعلات المتبقية من تفاعل الألكلة.ترسب البروتينات في الأسيتون بين عشية وضحاها كما هو موضح في بروتوكول النص وإعادة تكوينها في 0.5 مولار بيكربونات الأمونيوم. أضف التربسين لهضم العينة واحتضان القوارير عند 37 درجة مئوية. لفصل الببتيدات باستخدام CE ، أعد تكوين البروتين المهضوم في واحد إلى اثنين ميكرولتر من مذيب العينة.دوامة العينة المختلطة والصهر المركزي عند 10،000 RCF لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية لحطام خلايا الحبيبات. قم بتهيئة أداة CE-ESI عن طريق شطف الشعيرات الدموية CE باستخدام BGE. ضع ميكرولترا واحدا من العينة في قارورة العينة وحقن واحد إلى 10 نانولتر من العينة في الشعيرات الدموية لفصل CE عن طريق الحقن الهيدروديناميكي.انقل نهاية مدخل الشعيرات الدموية لفصل CE إلى BGE. ابدأ الفصل الكهربائي عن طريق زيادة جهد فصل CE تدريجيا من الأرض الأرضية. تضمن الجهود من 20 إلى 28 كيلوفولت مع تيار أقل من 10 ميكرو أمبير أداء فعالا مستقرا وقابلا للتكرار للتحليل.للفصل باستخدام Nano LC ، أعد تعليق عينة الببتيد في المرحلة المتنقلة A.يعتمد تركيز العينة وحجم الحقن على نظام LC والعمود المتاحين. انقل العينة إلى قارورة LC. قم بتحميل ما يقرب من 200 نانوجرام إلى ميكروغرام من عينة الببتيد في العمود التحليلي C18 وافصل الببتيدات بمعدل تدفق 300 نانولتر في الدقيقة باستخدام شطف التدرج كما هو موضح في مخطوطة النص.باستخدام الكاميرا ، تحقق من تدفق السائل عبر باعث الرش الكهربائي وافحص الإعداد بصريا بحثا عن التسريبات المحتملة. اكتساب أحداث قياس الطيف الكتلي وتسلسل الببتيدات كما هو موضح في مخطوطة النص. تم الكشف عن اختلافات الترجمة الجينية بين خلايا D11 التي تم تشريحها من أجنة مختلفة باستخدام CE-ESI-HRMS.تم تحليل استنساخ الخلايا التشريحية المسمى بالنسب بواسطة LC-HRMS. أظهر تحليل مسار البروتينات ترجمة البروتين غير المنظمة واستقلاب الطاقة في منظم سبيمان مع الأديم الظاهر العصبي. تم إثراء بروديوم الأديم الظاهر العصبي بالبروتينات المرتبطة بالنقل النووي لشحنة البروتين في الخلية التي تشير على الأرجح إلى أحداث المصب بعد الإشارات.أشار تحليل التخصيب للوظائف الجزيئية إلى التنظيم في بدء الترجمة ، وربط الحمض النووي الريبي وربط مركب البروتيازوم مما يشير إلى دور دوران البروتين الديناميكي في تطوير منظم سبيمان. حدد الأجنة النمطية فقط لهذا البروتوكول لتحسين قابلية التكاثر وتفسير النتائج. يجب نقل الأنسجة المقطعة إلى قنينة وتجميدها على الفور تحتوي على أقل قدر ممكن من المخزن المؤقت للوسائط لتقليل التلوث من الأملاح العازلة.وقد مكننا هذا النهج من دراسة ديناميكيات البروتين في الخلايا المحددة وسلالات الخلايا في الأجنة الحية. مكنتنا المعلومات الجديدة التي حصلنا عليها حول الإنتاج الزماني المكاني للبروتينات المهمة في الأنسجة النامية من تصميم تجارب مستهدفة لتقييم وظيفتها البيولوجية.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

نطاق واسع غير المستهدفة التنميط Metabolomic من المصل بواسطة الترا الطيف الأداء اللوني الكتلة السائل (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

الايض غير مستهدفة من مصادر بيولوجية عن طريق Ultraperformance اللوني السائل عالية الدقة الطيف الكتلي (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

A مواد إرشادية النهج فحص لتطوير الكمي سول جل ميكروأرس بروتين المشتقة

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

تسلسل مصنع ستريت Heteroxylans عن طريق إنزيمي، والمواد الكيميائية (مثلأيشن) والمادية (الطيف الكتلي، الرنين المغناطيسي النووي) تقنيات

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

تصور المحيطة الطيف الكتلي مع استخدام انعراجي التصوير الفوتوغرافي

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

توليف وتحليل الطيف الكتلي اليغو-بيبتويدس

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...