Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
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我们感谢Jie Li（马里兰大学帕克分校）关于胚胎解离和FACS的宝贵讨论。我们感谢Vi M. Quach和Camille Lombard-Banek在先前的研究中为样品制备和数据收集提供的帮助，这些研究举例说明了本协议中强调的蛋白质组学应用。这项工作的部分内容得到了美国国家科学基金会的支持，奖励号为IOS-1832968 CAREER（授予P.N.），美国国立卫生研究院的奖励号为R35GM124755（授予P.N.），马里兰大学 - 国家癌症研究所合作计划（授予P.N.）和COSMOS俱乐部基金会研究奖（授予ABB和L.R.P.）。

确保非洲 爪蟾 成年蛙的人道维护和处理的所有协议均已获得马里兰大学帕克分校机构动物护理和使用委员会的批准（批准号R-DEC-17-57和R-FEB-21-07）。
1. 准备解决方案
<ol><li>用于胚胎学<ol><li>准备1x，0.5x和0.2x斯坦伯格溶液（SS），然后按照标准方案12将它们高压灭菌（120°C20分钟）至无菌。</li>
		<li>按照标准方案在灭菌的 1x SS 中制备 3% （w/...

该协议能够表征 非洲爪蟾 物种胚胎中已鉴定细胞谱系中的蛋白质表达。该方法源于HRMS，结合了分子鉴定的精湛特异性，无需分子探针即可进行多蛋白检测的能力（通常是数百到数千种不同的蛋白质）以及定量能力。对细胞和发育（神经）生物学中经典工具和工作流程的适应性将HRMS蛋白质组学扩展到令人兴奋的应用，包括脊椎动物X . laevis 胚胎中干细胞分化的整体表征。
<p class="j...

我们对细胞分化以及组织和器官起源的理解是数十年来精心设计的基因及其产物靶向筛选的结果。在重要的细胞事件中，增加我们对所有生物分子及其数量的了解将有助于解开控制脊椎动物身体计划的空间和时间模式的分子机制。能够进行分子扩增和测序的技术现在能够定期报告大量基因和转录本，支持基础生物学和转化研究中的假设驱动研究。为了理解发展中的系统，转录和翻译之间的复杂关系主张直接分析多种蛋白质及其翻译后修饰。使用 体外 生物系统（如诱导多能干细胞）的全球蛋白质组学开始描绘组织诱导的机制1，2。在复杂的生物中，例如脊椎动物胚胎，发育依赖于空间和时间背景下的形态原梯度3。因此，随着细胞分化形成专门的组织（如神经组织），获得蛋白质组学变化的知识，为解锁控制正常和缺陷发育的分子程序和指导下一代疗法提供了一把钥匙。
脊椎动物南非爪蛙（非洲爪蟾）是细胞和发育、神经和再生生物学的成熟模型。约翰·戈登爵士（Sir John Gurdon）因发现体细胞核的多能性而获得2012年诺贝尔生理学或医学奖4，5，强调了该模型对基础和转化研究发现的重要性。非洲爪蟾胚胎在母体外部发育，从而促进细胞、细胞克隆和基因表达在不同发育阶段的直接操作。不对称的色素沉着和刻板的细胞分裂使得能够绘制出来自 16-6 和 32 细胞7，8 期胚胎的可重复命运图。对于基于高分辨率质谱（HRMS）的蛋白质组学，该模型的其他优点包括相对较大的尺寸（直径~1毫米），这会产生丰富的蛋白质含量进行分析（早期切割阶段胚胎~130μg，16细胞胚胎的单细胞中~10μg蛋白质含量）9，10。
目前，HRMS是检测蛋白质的首选领先技术。该技术能够直接、灵敏、特异性地检测和定量多种（通常是数百到数千种不同的蛋白质）11。HRMS自下而上的蛋白质组学涉及一系列相互关联的步骤。从细胞/组织样品中提取后，用蛋白水解酶（如胰蛋白酶（自下而上的蛋白质组学））消化蛋白质。所得肽根据其不同的物理化学性质进行分离，包括疏水性（反相液相色谱，LC），净电荷（离子交换色谱），大小（尺寸排阻色谱）或电泳迁移率（毛细管电泳，CE）。然后对肽进行充电（电离），通常使用电喷雾电离（ESI），并通过串联HRMS通过气相碎裂检测和测序肽离子。所得肽数据映射到所研究生物体的蛋白质组。由于蛋白质特异性（蛋白型）肽离子信号强度与浓度相关，蛋白质定量可以无标记或基于标记（多重定量）进行。HRMS蛋白质组学产生了有关所研究系统分子状态的丰富信息资源，允许生成假设和后续功能研究。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> 图 1：时空可扩展的蛋白质组学，使细胞谱系引导发育（青蛙）胚胎中的 HRMS 蛋白质组学成为可能。 （A）在平移阶段（4）的控制下，使用体视显微镜（2）注射已识别的细胞（插图）的样品（1）用于注射已识别的细胞（插图）。（B）对16细胞胚胎中鉴定的左D11细胞进行亚细胞采样。（C）从16细胞胚胎中解剖整个D11细胞。（D）从32细胞胚胎中对左右D111后代进行荧光（绿色）示踪，以指导解剖原肠胚中的神经外胚层（NE）（第10阶段），并使用FACS从蝌蚪中分离后代组织。比例尺：胚胎200μm，小瓶1.25mm。数字经参考文献15，19，21，59许可改编。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
这里介绍的方案能够基于HRMS对发育中的X. laevis胚胎中鉴定的细胞/组织中的大量蛋白质进行定量。该方法建立在准确的细胞鉴定、可重复的细胞命运图谱和在该生物模型中跟踪细胞谱系的既定方法之上6，7，8。如图1所示，我们通过采用全细胞解剖或毛细管微量采样来抽吸细胞内容物来研究来自单细胞的蛋白质组。监测细胞的谱系使我们能够研究蛋白质组的时空演变，因为细胞在原肠胚形成过程中形成组织。通过注射与惰性葡聚糖或mRNA偶联的荧光团来标记细胞后代，以用于荧光蛋白（例如，绿色荧光蛋白或GFP）。标记的后代在所需的发育时间点分离。在原肠胚形成过程中，可以通过解剖分离紧密聚集的细胞克隆。原肠胚形成后，由于迁移运动，细胞克隆可能分布在胚胎内，并且可以通过荧光激活细胞分选（FACS）从解离组织中分离出来。这些细胞和组织中的蛋白质通过自下而上的蛋白质组学进行测量，采用HPLC或CE进行分离，ESI串联HRMS进行鉴定。细胞谱系引导的HRMS蛋白质组学可扩展到胚胎内的不同细胞大小和谱系，并且具有特异性、灵敏度和定量性。通过此处显示的精选示例，我们还证明了该协议具有可扩展性，并且广泛适用于不同类型的细胞和细胞谱系。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> 图 2：生物分析工作流程。 显微解剖和毛细管抽吸，或FACS有助于细胞和克隆蛋白含量的采样。使用电喷雾电离 （ESI） 高分辨率质谱 （HRMS） 去除丰度蛋黄蛋白并通过毛细管电泳 （CE） 或纳流液相色谱 （LC） 增强鉴定 （ID） 灵敏度进行分离。量化揭示了失调，结合基因本体（GO）提供的信息，为假设驱动的研究提供了新的信息。数字经参考文献15许可改编。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

当细胞产生组织和器官时，分子事件的表征提高了更好地了解正常发育和设计有效的疾病疗法的潜力。能够准确鉴定和定量各种类型和大量蛋白质的技术将提供关于在空间和时间上协调组织和生物体发育的分子机制的信息。在这里，我们提出了一种基于质谱的方案，该协议能够测量非洲 爪 蟾（青蛙）胚胎中已鉴定细胞谱系中的数千种蛋白质。该方法建立在可重复的细胞命运图谱和既定方法的基础上，以从这种脊椎动物发育模型中鉴定，荧光标记，跟踪和采样细胞及其后代（克隆）。使用微量采样或通过解剖或荧光激活细胞分选分离细胞收集细胞内容物后，提取并处理蛋白质以进行自下而上的蛋白质组学分析。液相色谱和毛细管电泳用于通过高分辨率质谱（HRMS）为蛋白质检测和定量提供可扩展的分离。为神经组织命运细胞的蛋白质组学表征提供了代表性的例子。细胞谱系引导的HRMS蛋白质组学适用于不同的组织和生物体。它具有足够的灵敏度、特异性和定量性，可以窥探脊椎动物发育过程中蛋白质组的时空动态。

该协议能够研究单细胞中的蛋白质及其谱系，因为它们在X. laevis胚胎中建立组织。图1说明了该方法在神经组织命运细胞和胚胎中新诱导的神经外胚层中研究蛋白质的一种应用。如图1A所示，生物分析工作流程集成了传统的细胞和发育生物学工具，用于鉴定、注射/吸出细胞和收集标本。图1B显示了使用显微注射器对体内</e...

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Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

在这里，我们描述了脊椎动物非洲 爪蟾 胚胎中具有已知组织命运的细胞谱系的基于质谱的蛋白质组学表征。

发育（青蛙）胚胎中的细胞谱系引导质谱蛋白质组学

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

这种谱系指导的方法能够对脊椎动物胚胎内具有空间和时间分辨率的重要发育事件进行蛋白质组学分析，从而传递无法通过全胚胎测量获得的信息。这种方法可以很容易地扩展到研究来自不同胚胎细胞的蛋白质、代谢物和转录物，因为它们在发育过程中分化。这种方法可以促进我们对控制正常和疾病发展的分子机制的理解，包括早期发育期间组织诱导和细胞命运承诺的机制。使用毛环将每个胚胎引导到孔中并轻轻定位它们，使感兴趣的目标细胞与微针成直角。按照非洲爪蟾组织命运图谱，鉴定目标谱系的前体细胞。使用两个锋利的镊子轻轻去除胚胎周围的卵黄碱膜。通过使用镊子手动解剖从胚胎中分离单个细胞。首先设置含有谱系示踪剂溶液的注射针。将显微注射针安装到由多轴微型机械手控制的微量移液器支架中。将微量移液器支架连接到微量注射器，并通过施加负压将血统示踪剂填充针头。校准针头并调整针尖的大小和注射时间，以提供大约一纳升在矿物油中测量的谱系示踪剂溶液。确保注射的液滴尺寸准确，并根据需要调整注射器设置。用3%fCAL溶液淹没显微注射粘土培养皿，并使用移液管将大约10个胚胎转移到粘土培养皿中。向感兴趣的细胞注射约1纳升荧光葡聚糖或200皮克GFP mRNA。使用体视显微镜，确认细胞标记的成功。确保仅注入预期的细胞。按照机构政策丢弃含有受伤或错误标记细胞的胚胎。将注射的胚胎转移到含有0.5x斯坦伯格溶液的培养皿中。在14至25摄氏度之间培养它们，直到它们达到所需的发育阶段。将三到五个胚胎转移到含有0.2x Steinberg溶液的琼脂培养皿中进行微解剖。使用镊子从胚胎中解剖标记的克隆。用0.5至10微升移液管收集解剖的组织，并将其放入微量离心机文件中。使用移液器吸出收集的组织周围的培养基以限制样品中的盐分，以避免干扰HRMS分析。通过将样品瓶放在干冰或液氮上，立即冷冻分离的细胞。将样品储存在零下80摄氏度，直到质谱分析。对于通过CE进行单细胞样品处理，通过将样品加热到60摄氏度约15分钟来使蛋白质变性。然后将样品平衡至室温五分钟，并将胰蛋白酶添加到样品中进行消化。对于NanoLC分析，在50微升裂解缓冲液中裂解多达五个解剖组织。通过上下移液样品来简化该过程。为了处理解剖的组织，将裂解物在4摄氏度下孵育10分钟。然后在4， 500 RCF下离心，在4摄氏度下沉淀细胞碎片和卵黄血小板。将上清液转移到干净的微量离心瓶中，并加入10%SDS，以获得裂解物中1%SDS的终浓度。对于组织，向裂解物中加入0.5摩尔二硫苏糖醇以获得约25毫摩尔的终浓度。然后将裂解物在60摄氏度下孵育30分钟，以化学方式减少蛋白质中的二硫键。加入0.5摩尔碘乙酰胺以获得裂解物中约75毫摩尔的终浓度，并将混合物在室温下在黑暗中孵育15分钟。加入与初始体积相同的0.5摩尔二硫苏糖醇，以淬灭烷基化反应中残留的反应物。如文本协议中所述，在丙酮中沉淀蛋白质过夜，并在0.5摩尔碳酸氢铵中复溶。加入胰蛋白酶进行样品消化，并将小瓶在37摄氏度下孵育。要使用CE分离肽，请重新配制成一至两微升样品溶剂中消化的蛋白质。涡旋混合样品并在 10， 000 RCF 下在 4 摄氏度下离心两分钟以沉淀细胞碎片。通过用BGE冲洗CE毛细管来初始化CE-ESI仪器。将一微升样品放入样品瓶中，并通过流体动力注射将1至10纳升样品注入CE分离毛细管中。将CE分离毛细管的入口端转移到BGE中。通过逐渐从接地斜坡上升CE分离电压来开始电泳分离。电流低于 10 微安的 20 至 28 kV 电位可确保稳定且可重复的分析仪器性能。要使用Nano LC进行分离，请将肽样品重新悬浮在流动相A中，样品的浓度和进样体积取决于可用的LC系统和色谱柱。将样品转移到液相色谱瓶中。将大约200纳克至2微克的肽样品加载到C18分析柱中，并使用文本手稿中所述的梯度洗脱以每分钟300纳升的流速分离肽。使用相机检查通过电喷雾发射器的液体流量，并目视检查设置是否存在可能的泄漏。获取质谱事件并按照文本手稿中的描述对肽进行测序。使用CE-ESI-HRMS从不同胚胎解剖的D11细胞之间检测到基因翻译差异。通过LC-HRMS分析谱系标记的解剖细胞克隆。蛋白质的通路分析显示，Spemann组织者与神经外胚层的蛋白质翻译和能量代谢上调。神经外胚层富含与细胞中蛋白质货物的核转运相关的蛋白质，这可能表明信号传导后的下游事件。分子功能的富集分析表明，蛋白酶体复合物的翻译起始、RNA结合和结合上调，表明Spemann组织者的动态蛋白质周转具有作用。仅为该协议选择刻板的胚胎，以提高可重复性和结果解释。解剖的组织应转移到小瓶中并立即冷冻，其中包含尽可能少的培养基缓冲液，以尽量减少缓冲盐的污染。这种方法使我们能够研究活胚胎中已鉴定细胞和细胞谱系中的蛋白质动力学。我们获得的关于发育组织中重要蛋白质的空间时间产生的新信息使我们能够设计有针对性的实验来评估它们的生物学功能。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

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科研

化学

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