Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Jie Li (University of Maryland, College Park) for værdifulde diskussioner om embryonal dissociation og FACS. Vi takker Vi M. Quach og Camille Lombard-Banek for hjælp med prøveforberedelse og dataindsamling i tidligere undersøgelser, der eksemplificerer de proteomiske anvendelser, der er fremhævet i denne protokol. Dele af dette arbejde blev støttet af National Science Foundation under tildelingsnummer IOS-1832968 CAREER (til P.N.), National Institutes of Health under tildelingsnummer R35GM124755 (til P.N.), University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (til P.N.) og COSMOS Club Foundation forskningspriser (til ABB og LRP).

Alle protokoller, der sikrer human vedligeholdelse og håndtering af Xenopus laevis voksne frøer , blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Maryland, College Park (godkendelsesnumre R-DEC-17-57 og R-FEB-21-07).
1. Forbered løsningerne
<ol><li>Til embryologi<ol><li>Forbered 1x, 0,5x og 0,2x Steinbergs opløsning (SS), og autoklav dem derefter (120 °C i 20 minutter) til sterilitet efter standardprotokollerne12...

Denne protokol muliggør karakterisering af proteinekspression i identificerede cellelinjer i embryoner af Xenopus-arten . Metoden stammer fra HRMS og kombinerer udsøgt specificitet i molekylær identifikation, evne til multiproteindetektion uden molekylære sonder (normalt hundreder til tusinder af forskellige proteiner) og en evne til kvantificering. Tilpasningsevne til klassiske værktøjer og arbejdsgange inden for celle- og udviklingsmæssig (neuro)biologi udvider HRMS-proteomics til spændende anvendelser...

Vores forståelse af celledifferentiering og vævs og organers tilblivelse er resultatet af årtiers detaljerede målrettede screeninger af gener og deres produkter. At øge vores viden om alle biomolekylerne og deres mængder under vigtige cellulære begivenheder ville hjælpe med at optrævle molekylære mekanismer, der styrer det rumlige og tidsmæssige mønster af hvirveldyrs kropsplan. Teknologier, der muliggør molekylær amplifikation og sekventering, er nu i stand til rutinemæssigt at rapportere om et stort antal gener og transkripter, hvilket understøtter hypotesedrevne undersøgelser inden for grundlæggende biologisk og translationel forskning. For at forstå udviklingssystemer går et komplekst forhold mellem transkription og oversættelse ind for direkte analyse af flere proteiner og deres posttranslationelle modifikationer. Global proteomics ved hjælp af in vitro biologiske systemer, såsom inducerede pluripotente stamceller, begyndte at afgrænse mekanismer for vævsinduktion 1,2. I komplekse organismer, såsom hvirveldyrembryoet, afhænger udviklingen af morfogengradienter i sammenhæng med rum og tid3. Det følger heraf, at det at få viden om proteomiske ændringer, når celler differentierer sig til dannelse af specialiserede væv, såsom neurale væv, giver en nøgle til at låse op for molekylære programmer, der styrer normal og defekt udvikling og guide næste generations terapi.
Hvirveldyret sydafrikansk klofrø (Xenopus laevis) er en veletableret model inden for celle- og udviklings-, neuro- og regenerativ biologi. Sir John Gurdons Nobelpris i fysiologi eller medicin 4,5 i 2012 for opdagelsen af pluripotens af den somatiske kerne fremhævede betydningen af denne model for opdagelser i grundlæggende og translationelle studier. Xenopus-embryoner udvikler sig eksternt til moderen, hvilket letter direkte manipulation af celler, cellekloner og genekspression over forskellige udviklingsstadier. Asymmetrisk pigmentering og stereotype celledelinger gjorde det muligt at kortlægge reproducerbare skæbnekort fra 16-6 og 32-celle 7,8-stadieembryoet. For proteomics baseret på massespektrometri med høj opløsning (HRMS) omfatter yderligere fordele ved modellen relativt stor størrelse (~1 mm i diameter), hvilket giver rigeligt proteinindhold til analyse (~130 μg i embryoner i tidlig spaltningsfase, ~10 μg proteinindhold i enkeltceller i det 16-cellede embryo)9,10.
På nuværende tidspunkt er HRMS den førende foretrukne teknologi til påvisning af proteiner. Denne teknologi muliggør direkte, følsom og specifik detektion og kvantificering af flere, normalt hundreder til tusinder af forskellige proteiner11. Bottom-up proteomics af HRMS involverer en række indbyrdes forbundne trin. Efter ekstraktion fra celle/vævsprøven fordøjes proteiner med et proteolytisk enzym, såsom trypsin (bottom-up proteomics). De resulterende peptider adskilles baseret på deres forskellige fysisk-kemiske egenskaber, herunder hydrofobicitet (omvendt fase væskekromatografi, LC), nettoladning (ionbytterkromatografi), størrelse (størrelseseksklusionskromatografi) eller elektroforetisk mobilitet (kapillærelektroforese, CE). Peptider lades derefter (ioniseres), typisk ved hjælp af elektrosprayionisering (ESI), og peptidioner detekteres og sekventeres via gasfasefragmentering ved tandem HRMS. De resulterende peptiddata kortlægges til proteomet af organismen, der undersøges. Med proteinspecifik (proteotypisk) peptidionsignalintensitet, der korrelerer med koncentration, kan proteinkvantificering udføres etiketfri eller etiketbaseret (multiplexingkvantificering). HRMS proteomics giver en rig ressource af information om den molekylære tilstand af det undersøgte system, hvilket giver mulighed for generering af hypoteser og opfølgende funktionelle undersøgelser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Figur 1: Spatiotemporalt skalerbar proteomics, der muliggør celleafstamningsstyret HRMS-proteomics i det udviklende (frø) embryo. (A) Visualisering af prøven (1) ved hjælp af et stereomikroskop (2) til injektion af en identificeret celle (indsats) ved hjælp af en fabrikeret mikropipette (3) under kontrol ved hjælp af et translationstrin (4). B) Subcellulær prøveudtagning af den identificerede venstre D11-celle i et 16-cellet embryo. C) Dissektion af en hel D11-celle fra et 16-cellet embryo. (D) Fluorescerende (grøn) sporing af venstre og højre D111-afkom fra et 32-cellet embryo for at styre dissektion af neurale ektoderm (NE) i gastrula (trin 10) og isolering af det nedadgående væv fra haletudsen ved hjælp af FACS. Skalastænger: 200 μm for embryoner, 1,25 mm for hætteglasset. Tallene er tilpasset med tilladelse fra referencerne 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Den protokol, der præsenteres her, muliggør HRMS-baseret kvantificering af et stort antal proteiner i identificerede celler/væv ved udvikling af X. laevis-embryoner. Tilgangen bygger på nøjagtig celleidentifikation, reproducerbare celleskæbnekort og etablerede metoder til at spore cellelinjer i denne biologiske model 6,7,8. Som vist i figur 1 studerer vi proteomer fra enkeltceller ved at anvende helcelledissektion eller kapillær mikrosampling til at aspirere cellulært indhold. Overvågning af en celles afstamning giver os mulighed for at studere proteomets rumlige temporale udvikling, når celler danner væv under gastrulation. Celleafkom markeres fluorescerende ved at injicere en fluorofor konjugeret til inert dextran eller mRNA til fluorescerende protein (fx grønt fluorescerende protein eller GFP). Det mærkede afkom isoleres på ønskede udviklingstidspunkter. Under gastrulation kan cellekloner, der er tæt grupperet, isoleres ved dissektion. Efter gastrulation kan cellekloner fordeles i embryoet på grund af migrationsbevægelser og kan isoleres fra dissocieret væv ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Proteiner i disse celler og væv måles via bottom-up proteomics ved hjælp af HPLC eller CE til separation og ESI tandem HRMS til identifikation. Celleafstamningsstyret HRMS-proteomics er skalerbar til forskellige cellestørrelser og slægter i embryoet og er specifik, følsom og kvantitativ. Gennem udvalgte eksempler vist her demonstrerer vi også, at denne protokol er skalerbar og bredt tilpasningsdygtig til forskellige typer celler og cellelinjer.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Figur 2: Den bioanalytiske arbejdsgang. Mikrodissektion og kapillær aspiration eller FACS lettede prøveudtagning af cellulært og klonalt proteinindhold. Udtømning af rigelige æggeblommeproteiner og adskillelse ved kapillær elektroforese (CE) eller nano-flow væskekromatografi (LC) forbedret identifikation (ID) følsomhed ved hjælp af elektrospray ionisering (ESI) massespektrometri med høj opløsning (HRMS). Kvantificering afslørede dysregulering og leverede ny information til hypotesedrevne undersøgelser i forbindelse med information tilgængelig fra genontologi (GO). Tallene er tilpasset med tilladelse fra reference15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

Karakterisering af molekylære begivenheder, når celler giver anledning til væv og organer, rejser et potentiale for bedre at forstå normal udvikling og designe effektive midler mod sygdomme. Teknologier, der muliggør nøjagtig identifikation og kvantificering af forskellige typer og et stort antal proteiner, vil give stadig manglende information om molekylære mekanismer, der orkestrerer vævs- og organismeudvikling i rum og tid. Her præsenterer vi en massespektrometribaseret protokol, der muliggør måling af tusindvis af proteiner i identificerede cellelinjer i Xenopus laevis (frø) embryoner. Tilgangen bygger på reproducerbare celleskæbnekort og etablerede metoder til at identificere, fluorescerende mærke, spore og prøve celler og deres afkom (kloner) fra denne model af hvirveldyrs udvikling. Efter indsamling af cellulært indhold ved hjælp af mikrosampling eller isolerende celler ved dissektion eller fluorescensaktiveret cellesortering ekstraheres proteiner og behandles til bottom-up proteomisk analyse. Væskekromatografi og kapillærelektroforese anvendes til at tilvejebringe skalerbar adskillelse til proteindetektion og kvantificering med massespektrometri med høj opløsning (HRMS). Repræsentative eksempler er tilvejebragt til proteomisk karakterisering af neurale vævsceller. Celleafstamningsstyret HRMS-proteomics kan tilpasses forskellige væv og organismer. Det er tilstrækkeligt følsomt, specifikt og kvantitativt til at kigge ind i proteomets rumlige-tidsmæssige dynamik under hvirveldyrs udvikling.

Denne protokol muliggjorde undersøgelsen af proteiner i enkeltceller og deres slægter, da de etablerer væv i X. laevis embryoner. Figur 1 illustrerer en sådan anvendelse af tilgangen til at studere proteiner i neurale vævsskæbneceller og den nyligt inducerede neurale ektoderm i embryoet. Som vist i figur 1A integrerede den bioanalytiske arbejdsgang traditionelle værktøjer inden for celle- og udviklingsbiologi til at identificere, injicere / aspi...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Her beskrives en massespektrometribaseret proteomisk karakterisering af cellelinjer med kendte vævsskæbner i hvirveldyrets Xenopus laevis embryo.

Celle-afstamning guidet massespektrometri proteomics i udviklingen (frø) embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Denne afstamningsstyrede tilgang muliggør proteomisk analyse af vigtige udviklingsbegivenheder med rumlig og tidsmæssig opløsning inden for hvirveldyrembryoet, der giver information, der ikke ville være tilgængelig gennem hele embryomålinger. Denne tilgang kan let udvides til at studere proteiner, metabolitter og transkripter fra forskellige embryonale celler, når de differentierer under udviklingen. Denne metode kan fremme vores forståelse af molekylære mekanismer, der styrer normal og sygdomsudvikling, herunder mekanismer for vævsinduktion og celleskæbneforpligtelse under tidlig udvikling.Brug en hårsløjfe til at lede hvert embryo ind i en brønd og placer dem forsigtigt, så den målrettede celle af interesse er i den rigtige vinkel i forhold til mikronålen. Følg xenopus laevis vævsskæbnekort for at identificere forløbercellen i den interessante slægt. Brug to skærpede tang til forsigtigt at fjerne vitellinmembranen, der omgiver embryoet.Isoler enkeltcellerne fra embryoet ved manuel dissektion ved hjælp af tang. Begynd med at opsætte kanylen, der indeholder afstamningssporopløsningen. Monter mikroinjektionsnålen i en mikropipetteholder, der styres af en multiakset mikromanipulator.Tilslut mikropipetteholderen til en mikroinjektor, og fyld nålen med afstamningssporstoffet ved at anvende undertryk. Kalibrer nålen, og juster størrelsen på nålespidsen og injektionstiden for at levere ca. en nanoliter af afstamningssporopløsningen målt i mineralolie. Sørg for, at dråbestørrelsen, der injiceres, er nøjagtig, og juster injektorindstillingerne, hvis det kræves.Oversprøjt lerskålen med mikroinjektion med en 3 % fCAL-opløsning, og overfør ca. 10 embryoner til lerskålen ved hjælp af en overførselspipette. Injicer cellerne af interesse med ca. en nanoliter fluorescerende dextran eller 200 picogram GFP mRNA. Brug et stereomikroskop til at bekræfte succesen med cellemærkning.Sørg for, at kun den tilsigtede celle injiceres. Kassér embryoner, der indeholder skadede eller forkert mærkede celler i henhold til institutionelle politikker. De injicerede embryoner overføres til en petriskål indeholdende 0,5x Steinberg-opløsning.Dyrk dem mellem 14 og 25 grader Celsius, indtil de når det ønskede udviklingsstadium. Overfør tre til fem embryoner til en agarskål indeholdende 0,2x Steinberg-opløsning til mikrodissektioner. Brug tang til at dissekere den mærkede klon fra embryoet.Saml det dissekerede væv med en 0,5 til 10 mikroliter pipette og deponer dem i en mikrocentrifugefil. Brug en pipette til at aspirere mediet omkring det opsamlede væv for at begrænse salte i prøven for at undgå interferens med HRMS-analyse. De isolerede celler fryses straks ved at lægge hætteglasset på tøris eller flydende nitrogen.Opbevar prøverne ved minus 80 grader Celsius indtil massespektrometrianalyse. Til behandling af enkeltcelleprøver med CE denatureres proteinerne ved opvarmning af prøven til 60 grader Celsius i ca. 15 minutter. Derefter ligevægtes prøven til stuetemperatur i fem minutter, og der tilsættes trypsin til prøverne til fordøjelse.Til analyse af NanoLC lyses op til fem dissekerede væv i 50 mikroliter lysisbuffer. Lette processen ved at pipettere prøven op og ned. For at behandle de dissekerede væv inkuberes lysatet ved fire grader Celsius i 10 minutter.Derefter pellet celleaffaldet og æggeblommepladerne ved fire grader Celsius ved centrificering ved 4.500 RCF. Supernatanten overføres til et rent hætteglas med mikrocentrifuger, og der tilsættes 10 % SDS for at opnå en slutkoncentration på 1 % SDS i lysatet. Til væv tilsættes 0,5 molær dithiothreitol til lysatet for at opnå en slutkoncentration på ca. 25 millimolære.Derefter inkuberes lysatet i 30 minutter ved 60 grader Celsius for kemisk at reducere disulfidbindinger i proteiner. Der tilsættes 0,5 molært iodoacetamid for at opnå den endelige koncentration på ca. 75 millimolar i lysatet og inkuberes blandingen i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Tilsæt 0,5 molær dithiothreitol samme som det oprindelige volumen for at slukke de reaktanter, der er tilbage fra alkyleringsreaktionen.Udfæld proteiner i acetone natten over som beskrevet i tekstprotokollen og rekonstituer i 0,5 molært ammoniumbicarbonat. Tilsæt trypsin til prøvefordøjelse og inkuber hætteglassene ved 37 grader Celsius. For at adskille peptiderne ved hjælp af CE rekonstitueres proteinet fordøjet i en til to mikroliter af prøveopløsningsmidlet.Vortex den blandede prøve og centrifusion ved 10.000 RCF i to minutter ved fire grader Celsius til pelletcelleaffald. Initialiser CE-ESI-instrumentet ved at skylle CE-kapillæret med BGE. Anbring en mikroliter prøve i prøvehætteglasset og injicer en til 10 nanoliter af prøven i CE-separationskapillæren ved hydrodynamisk injektion.Indløbsetenden af CE-separationskapillæren overføres til BGE. Start elektroforetisk adskillelse ved gradvist at ramme CE-separationsspændingen fra jordjorden. Potentialer på 20 til 28 kilovolt med en strøm under 10 mikroampere sikrer stabil og reproducerbar instrumentel ydeevne til analyse.For at adskille ved hjælp af Nano LC skal peptidprøven resuspenderes i mobil fase A.Prøvens koncentration og injektionsvolumen afhænger af det tilgængelige LC-system og kolonne. Overfør prøven til et LC-hætteglas. Der lægges ca. 200 nanogram til to mikrogram peptidprøve i C18-analysekolonnen, og peptiderne adskilles med en strømningshastighed på 300 nanoliter pr. minut ved hjælp af gradienteluering som beskrevet i tekstmanuskriptet.Brug et kamera til at kontrollere væskestrømmen gennem elektrosprøjtesenderen og visuelt inspicere opsætningen for mulige lækager. Erhverve massespektrometrihændelser og sekvensere peptiderne som beskrevet i tekstmanuskriptet. Gentranslationelle forskelle blev påvist mellem D11-celler dissekeret fra forskellige embryoner ved hjælp af CE-ESI-HRMS.Afstamningsmærkede dissekerede cellekloner blev analyseret af LC-HRMS. Pathway analyse af proteiner viste opreguleret proteinoversættelse og energimetabolisme i Spemanns organisator med neuroectoderm. Neuroectoderm prodeum blev beriget med proteiner forbundet med nuklear transport af proteinlast i cellen, hvilket sandsynligvis indikerer nedstrøms begivenheder efter signalering.Berigelsesanalysen af molekylære funktioner indikerede opregulering i translationsinitiering, RNA-binding og binding af proteasomkomplekset, hvilket tyder på en rolle for dynamisk proteinomsætning, der udvikler Spemanns organisator. Vælg kun stereotype embryoner til denne protokol for at forbedre reproducerbarheden og resultatfortolkningen. Dissekeret væv skal overføres til et hætteglas og straks fryses indeholdende så minimal mediebuffer som muligt for at minimere kontaminering fra buffersalte.Denne tilgang har gjort det muligt for os at studere proteindynamik i identificerede celler og cellelinjer i levende embryoner. De nye oplysninger, vi har fået om den rumlige tidsmæssige produktion af vigtige proteiner i udviklingen af væv, har gjort det muligt for os at designe målrettede eksperimenter for at vurdere deres biologiske funktion.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Large Scale Ikke-målrettet metabolomisk profilering af Serum fra Ultra Performance Liquid Chromatography-massespektrometri (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Målrettede Metabolomics fra biologiske kilder Brug Ultraperformance væskekromatografi-højopløsningsmassespektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

En guidet Materials Screening tilgang til udvikling af Kvantitative Sol-gel protein Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekventering af Plant Wall Heteroxylans Brug Enzymatisk, Chemical (Methylering) og fysiske (massespektrometri Nuclear Magnetic Resonance) Teknikker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering af Ambient massespektrometri med brug af Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse af Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...