Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

We zijn Jie Li (University of Maryland, College Park) dankbaar voor waardevolle discussies over embryonale dissociatie en FACS. We danken Vi M. Quach en Camille Lombard-Banek voor hun hulp bij de voorbereiding van monsters en het verzamelen van gegevens in eerdere studies die een voorbeeld zijn van de proteomische toepassingen die in dit protocol worden benadrukt. Delen van dit werk werden ondersteund door de National Science Foundation onder toekenningsnummer IOS-1832968 CAREER (aan P.N.), de National Institutes of Health onder toekenningsnummer R35GM124755 (aan P.N.), de University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (aan P.N.), en COSMOS Club Foundation onderzoeksprijzen (aan A.B.B. en L.R.P.).

Alle protocollen die het humane onderhoud en de behandeling van Xenopus laevis volwassen kikkers garanderen, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Maryland, College Park (goedkeuringsnummers R-DEC-17-57 en R-FEB-21-07).
1. Bereid de oplossingen voor
<ol><li>Voor embryologie<ol><li>Bereid 1x, 0,5x en 0,2x Steinberg's oplossing (SS), autoclaaf ze vervolgens (120 °C gedurende 20 min) tot steriliteit volgens stand...

Dit protocol maakt de karakterisering van eiwitexpressie in geïdentificeerde cellijnen in embryo's van de Xenopus-soort mogelijk. Voortkomend uit HRMS, combineert de methodologie voortreffelijke specificiteit in moleculaire identificatie, vermogen voor multi-eiwitdetectie zonder moleculaire sondes (meestal honderden tot duizenden verschillende eiwitten) en een vermogen tot kwantificering. Aanpassingsvermogen aan klassieke hulpmiddelen en workflows in cel- en ontwikkelingsbiologie (neuro)biologie breiden HRMS-pr...

Ons begrip van celdifferentiatie en het ontstaan van weefsels en organen is het resultaat van tientallen jaren van uitgebreide gerichte screenings van genen en hun producten. Het vergroten van onze kennis van alle biomoleculen en hun hoeveelheden tijdens belangrijke cellulaire gebeurtenissen zou helpen bij het ontrafelen van moleculaire mechanismen die de ruimtelijke en temporele patronen van het gewervelde lichaamsplan beheersen. Technologieën die moleculaire amplificatie en sequencing mogelijk maken, zijn nu in staat om routinematig te rapporteren over grote aantallen genen en transcripten, ter ondersteuning van hypothesegestuurde studies in fundamenteel biologisch en translationeel onderzoek. Om ontwikkelende systemen te begrijpen, pleit een complexe relatie tussen transcriptie en translatie voor directe analyse van meerdere eiwitten en hun posttranslationele modificaties. Globale proteomics met behulp van in vitro biologische systemen, zoals geïnduceerde pluripotente stamcellen, begonnen mechanismen van weefselinductieaf te bakenen 1,2. In complexe organismen, zoals het gewervelde embryo, is de ontwikkeling afhankelijk van morfogene gradiënten in de context van ruimte en tijd3. Hieruit volgt dat het verkrijgen van kennis van proteomische veranderingen naarmate cellen differentiëren om gespecialiseerde weefsels te vormen, zoals neurale weefsels, een sleutel biedt om moleculaire programma's te ontgrendelen die de normale en defecte ontwikkeling beheersen en therapieën van de volgende generatie begeleiden.
De gewervelde Zuid-Afrikaanse klauwkikker (Xenopus laevis) is een beproefd model in de cel- en ontwikkelings-, neuro- en regeneratieve biologie. Sir John Gurdon's 2012 Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde 4,5 voor de ontdekking van pluripotentie van de somatische kern benadrukte het belang van dit model voor ontdekkingen in fundamentele en translationele studies. Xenopus-embryo's ontwikkelen zich extern voor de moeder, waardoor directe manipulatie van cellen, celklonen en genexpressie over verschillende stadia van ontwikkeling mogelijk wordt. Asymmetrische pigmentatie en stereotiepe celdelingen maakten het mogelijk om reproduceerbare lotkaarten van het 16-6 en 32-cel 7,8 stadium embryo in kaart te brengen. Voor op hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) gebaseerde proteomics zijn bijkomende voordelen van het model een relatief grote omvang (~ 1 mm in diameter), die een overvloedig eiwitgehalte oplevert voor analyse (~ 130 μg in embryo's in het vroege splitsingsstadium, ~ 10 μg eiwitgehalte in enkele cellen van het 16-celembryo)9,10.
Op dit moment is HRMS de toonaangevende technologie bij uitstek voor het detecteren van eiwitten. Deze technologie maakt directe, gevoelige en specifieke detectie en kwantificering van meerdere, meestal honderden tot duizenden verschillende eiwittenmogelijk 11. Bottom-up proteomics door HRMS omvat een reeks onderling verbonden stappen. Na extractie uit het cel/weefselmonster worden eiwitten verteerd met een proteolytisch enzym, zoals trypsine (bottom-up proteomics). De resulterende peptiden worden gescheiden op basis van hun verschillende fysisch-chemische eigenschappen, waaronder hydrofobiciteit (reversed-phase vloeistofchromatografie, LC), nettolading (ionenwisselingschromatografie), grootte (grootte-uitsluitingschromatografie) of elektroforetische mobiliteit (capillaire elektroforese, CE). Peptiden worden vervolgens geladen (geïoniseerd), meestal met behulp van elektrospray-ionisatie (ESI), en peptide-ionen worden gedetecteerd en gesequenced via gasfasefragmentatie door tandem HRMS. De resulterende peptidegegevens worden toegewezen aan het proteoom van het organisme dat wordt bestudeerd. Met eiwitspecifieke (proteotypische) peptide-ionsignaalintensiteit die correleert met concentratie, kan eiwitkwantificering labelvrij of labelgebaseerd (multiplexingkwantificering) worden uitgevoerd. HRMS-proteomics levert een rijke bron van informatie op over de moleculaire toestand van het bestudeerde systeem, waardoor hypothesen kunnen worden gegenereerd en functionele vervolgstudies kunnen worden uitgevoerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Figuur 1: Spatiotemporaal schaalbare proteomics die cel-afstamming geleide HRMS proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo mogelijk maken. (A) Visualisatie van het monster (1) met behulp van een stereomicroscoop (2) voor injectie van een geïdentificeerde cel (inzet), met behulp van een gefabriceerde micropipette (3) onder controle door een translatiestadium (4). B) Subcellulaire bemonstering van de geïdentificeerde linker D11-cel in een embryo met 16 cellen. (C) Dissectie van een hele D11-cel uit een embryo van 16 cellen. (D) Fluorescerende (groene) tracering van de linker en rechter D111 nakomelingen van een 32-celig embryo om dissectie van het neurale ectoderm (NE) in de gastrula (stadium 10) en isolatie van het afstammelingsweefsel van het kikkervisje met behulp van FACS te begeleiden. Schaalstaven: 200 μm voor embryo's, 1,25 mm voor de injectieflacon. De cijfers werden met toestemming aangepast van referenties 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het hier gepresenteerde protocol maakt hrms-gebaseerde kwantificering mogelijk van grote aantallen eiwitten in geïdentificeerde cellen / weefsels bij het ontwikkelen van X. laevis-embryo's. De aanpak bouwt voort op nauwkeurige celidentificatie, reproduceerbare cellotkaarten en gevestigde methodologieën om cellijnen te volgen in dit biologische model 6,7,8. Zoals te zien is in figuur 1, bestuderen we proteomen van afzonderlijke cellen door gebruik te maken van hele-celdissectie of capillaire microsampling om cellulaire inhoud te aspirateren. Het monitoren van de afstamming van een cel stelt ons in staat om de spatiotemporale evolutie van het proteoom te bestuderen als cellen weefsels vormen tijdens gastrulatie. Het celprogenaat wordt fluorescerend gemarkeerd door het injecteren van een fluorofoor geconjugeerd aan inert dextran of mRNA voor fluorescerend eiwit (bijv. Groen fluorescerend eiwit of GFP). Het gelabelde nageslacht wordt geïsoleerd op de gewenste ontwikkelingstijdstippen. Tijdens gastrulatie kunnen celklonen die strak geclusterd zijn, worden geïsoleerd door dissectie. Na gastrulatie kunnen celklonen in het embryo worden verspreid als gevolg van migratiebewegingen en kunnen ze worden geïsoleerd uit gedissocieerde weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Eiwitten in deze cellen en weefsels worden gemeten via bottom-up proteomics met HPLC of CE voor scheiding en ESI tandem HRMS voor identificatie. Cel-lineage-geleide HRMS proteomics is schaalbaar naar verschillende celgroottes en afstammingslijnen binnen het embryo en is specifiek, gevoelig en kwantitatief. Aan de hand van geselecteerde voorbeelden die hier worden getoond, laten we ook zien dat dit protocol schaalbaar en breed aanpasbaar is aan verschillende soorten cellen en cellijnen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Figuur 2: De bioanalytische workflow. Microdissectie en capillaire aspiratie, of FACS, vergemakkelijkten de bemonstering van cellulair en klonaal eiwitgehalte. Uitputting van overvloedige dooiereiwitten en scheiding door capillaire elektroforese (CE) of nano-flow vloeistofchromatografie (LC) verbeterde identificatie (ID) gevoeligheid met behulp van elektrospray ionisatie (ESI) hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS). Kwantificering onthulde ontregeling en leverde nieuwe informatie op voor hypothese-gedreven studies in combinatie met informatie die beschikbaar was via genontologie (GO). De cijfers zijn met toestemming aangepast aan referentie15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

Karakterisering van moleculaire gebeurtenissen als cellen aanleiding geven tot weefsels en organen verhoogt een potentieel om de normale ontwikkeling beter te begrijpen en efficiënte remedies voor ziekten te ontwerpen. Technologieën die een nauwkeurige identificatie en kwantificering van verschillende soorten en grote aantallen eiwitten mogelijk maken, zouden nog steeds ontbrekende informatie opleveren over moleculaire mechanismen die de ontwikkeling van weefsels en organismen in ruimte en tijd orkestreren. Hier presenteren we een op massaspectrometrie gebaseerd protocol dat de meting van duizenden eiwitten in geïdentificeerde cellijnen in Xenopus laevis (kikker) embryo's mogelijk maakt. De aanpak bouwt voort op reproduceerbare cel-lotkaarten en gevestigde methoden om cellen en hun nakomelingen (klonen) te identificeren, fluorescerend te labelen, te volgen en te bemonsteren vanuit dit model van gewervelde ontwikkeling. Na het verzamelen van cellulaire inhoud met behulp van microsampling of het isoleren van cellen door dissectie of fluorescentie-geactiveerde celsortering, worden eiwitten geëxtraheerd en verwerkt voor bottom-up proteomische analyse. Vloeistofchromatografie en capillaire elektroforese worden gebruikt om schaalbare scheiding te bieden voor eiwitdetectie en kwantificering met hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS). Representatieve voorbeelden worden gegeven voor de proteomische karakterisering van neurale weefselvette cellen. Cel-lineage-geleide HRMS proteomics is aanpasbaar aan verschillende weefsels en organismen. Het is voldoende gevoelig, specifiek en kwantitatief om in de spatio-temporele dynamiek van het proteoom te kijken tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren.

Dit protocol maakte de studie van eiwitten in afzonderlijke cellen en hun afstamming mogelijk terwijl ze weefsels in X. laevis-embryo's vaststellen. Figuur 1 illustreert een dergelijke toepassing van de benadering om eiwitten in neurale weefsel-vette cellen en het nieuw geïnduceerde neurale ectoderm in het embryo te bestuderen. Zoals te zien is in figuur 1A, integreerde de bioanalytische workflow traditionele hulpmiddelen van cel- en ontwikkelingsbiolo...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Hier beschrijven we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische karakterisering van cellijnen met bekende weefsellotgevallen in het gewervelde Xenopus laevis-embryo .

Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Deze afstammingsgeleide benadering maakt proteomische analyse van belangrijke ontwikkelingsgebeurtenissen met ruimtelijke en temporele resolutie binnen het gewervelde embryo mogelijk, waardoor informatie wordt verstrekt die niet toegankelijk zou zijn via metingen van het hele embryo. Deze aanpak kan gemakkelijk worden uitgebreid om eiwitten, metabolieten en transcripties van verschillende embryonale cellen te bestuderen terwijl ze differentiëren tijdens de ontwikkeling. Deze methode kan ons begrip van moleculaire mechanismen die de normale en ziekteontwikkeling beheersen, bevorderen, inclusief mechanismen van weefselinductie en cellotbetrokkenheid tijdens de vroege ontwikkeling.Gebruik een haarlus om elk embryo in een put te leiden en plaats ze voorzichtig zo dat de beoogde cel van belang zich in de juiste hoek ten opzichte van de micronaald bevindt. Volg de xenopus laevis weefsel lot kaarten om de voorlopercel van de afstamming van belang te identificeren. Gebruik twee slijptangen om voorzichtig het vitellinemembraan rond het embryo te verwijderen.Isoleer de afzonderlijke cellen uit het embryo door handmatige dissectie met behulp van een tang. Begin met het instellen van de injectienaald met de lineage tracer-oplossing. Monteer de micro-injectienaald in een micropipethouder die wordt bestuurd door een meerassige micromanipulator.Sluit de micropipethouder aan op een micro-injector en vul de naald met de lineage tracer door negatieve druk uit te oefenen. Kalibreer de naald en pas de grootte van de naaldpunt en de injectietijd aan om ongeveer één nanoliter van de afstammingstraceroplossing te leveren, gemeten in minerale olie. Zorg ervoor dat de druppelgrootte die wordt geïnjecteerd nauwkeurig is en pas indien nodig de instellingen van de injector aan.Overspoel de micro-injectie kleischaal met een 3%fCAL oplossing en breng ongeveer 10 embryo's over naar de kleischaal met behulp van een transferpipet. Injecteer de cellen van belang met ongeveer een nanoliter van het fluorescerende dextran of 200 picogram GFP-mRNA. Bevestig met behulp van een stereomicroscoop het succes van cellabeling.Zorg ervoor dat alleen de beoogde cel wordt geïnjecteerd. Gooi embryo's weg die gewonde of onjuist gelabelde cellen bevatten volgens institutioneel beleid. Breng de geïnjecteerde embryo's over in een petrischaaltje met 0,5x Steinberg-oplossing.Kweek ze tussen 14 en 25 graden Celsius totdat ze het gewenste ontwikkelingsstadium bereiken. Breng drie tot vijf embryo's over in een agarschaal met 0,2x Steinberg-oplossing voor microdissecties. Gebruik een tang om de gelabelde kloon van het embryo te ontleden.Verzamel het ontleedde weefsel met een pipet van 0,5 tot 10 microliter en deponeer ze in een microcentrifugevijl. Zuig met behulp van een pipet de media rond het verzamelde weefsel op om zouten in het monster te beperken om interferentie met HRMS-analyse te voorkomen. Bevries de geïsoleerde cellen onmiddellijk door de injectieflacon met het monster op droogijs of vloeibare stikstof te plaatsen.Bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius tot massaspectrometrie-analyse. Voor eencellige monsterverwerking door CE, denatureer de eiwitten door het monster gedurende ongeveer 15 minuten te verwarmen tot 60 graden Celsius. Breng het monster vervolgens gedurende vijf minuten in evenwicht met kamertemperatuur en voeg trypsine toe aan de monsters voor vertering.Voor analyse door NanoLC, lyse tot vijf ontlede weefsels in 50 microliter lysisbuffer. Faciliteer het proces door het monster op en neer te pipetteren. Om de ontleedde weefsels te verwerken, incubeer je het lysaat gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Pellet vervolgens de celresten en dooierplaatjes bij vier graden Celsius door centrificatie bij 4.500 RCF. Breng het supernatant over in een schone injectieflacon met microcentrifuges en voeg 10% SDS toe om een eindconcentratie van 1% SDS in het lysaat te verkrijgen. Voeg voor weefsels 0,5 molair dithiothreitol toe aan het lysaat om een eindconcentratie van ongeveer 25 millimolair te verkrijgen.Incubeer het lysaat vervolgens gedurende 30 minuten bij 60 graden Celsius om disulfidebindingen in eiwitten chemisch te verminderen. Voeg 0,5 molair jodoacetamide toe om de uiteindelijke concentratie van ongeveer 75 millimolair in het lysaat te verkrijgen en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg 0,5 molaire dithiothreitol toe hetzelfde als het oorspronkelijke volume om de reactanten die overblijven van de alkyleringsreactie te doven.Precipiteer eiwitten in aceton 's nachts zoals beschreven in het tekstprotocol en reconstitueer in 0,5 molair ammoniumbicarbonaat. Voeg trypsine toe voor monstervertering en incubeer de injectieflacons bij 37 graden Celsius. Om de peptiden te scheiden met behulp van CE, reconstitueert u het eiwit dat is verteerd in één tot twee microliter van het monsteroplosmiddel.Vortex het gemengde monster en centrifusie bij 10.000 RCF gedurende twee minuten bij vier graden Celsius tot pelletcelresten. Initialiseer het CE-ESI-instrument door het CE-capillair te spoelen met de BGE. Plaats één microliter monster in de injectieflacon van het monster en injecteer één tot 10 nanoliter van het monster in het CE-scheidingscapillair door hydrodynamische injectie.Breng het inlaatuiteinde van het CE-scheidingscapillair over in de BGE. Start elektroforetische scheiding door de CE-scheidingsspanning geleidelijk op te voeren vanaf de aarde. Potentialen van 20 tot 28 kilovolt met een stroom van minder dan 10 microampère zorgen voor stabiele en reproduceerbare instrumentele prestaties voor analyse.Om te scheiden met behulp van Nano LC, suspensie van het peptidemonster opnieuw in mobiele fase A.De concentratie en het injectievolume van het monster zijn afhankelijk van het beschikbare LC-systeem en de beschikbare kolom. Breng het monster over in een LC-injectieflacon. Laad ongeveer 200 nanogram tot twee microgram peptidemonster in de C18-analytische kolom en scheid de peptiden met een stroomsnelheid van 300 nanoliter per minuut met behulp van gradiënge-elutie zoals beschreven in het tekstmanuscript.Controleer met behulp van een camera de vloeistofstroom door de elektrospray-emitter en inspecteer de opstelling visueel op mogelijke lekken. Verkrijg massaspectrometriegebeurtenissen en sequentieer de peptiden zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gentranslationele verschillen werden gedetecteerd tussen D11-cellen ontleed uit verschillende embryo's met behulp van CE-ESI-HRMS.Lineage-gelabelde ontlede celklonen werden geanalyseerd door LC-HRMS. Pathway-analyse van eiwitten toonde upregulated eiwittranslatie en energiemetabolisme in de Spemann's organizer met het neuro-ectoderm. Het neuro-ectoderm prodeum was verrijkt met eiwitten geassocieerd met nucleair transport van eiwitlading in de cel, wat waarschijnlijk wijst op stroomafwaartse gebeurtenissen na signalering.De verrijkingsanalyse van moleculaire functies wees op upregulatie in translatie-initiatie, RNA-binding en binding van het proteasoomcomplex, wat een rol suggereert voor dynamische eiwitvernieuwing die de organisator van Spemann ontwikkelt. Selecteer alleen stereotiepe embryo's voor dit protocol om de reproduceerbaarheid en resultaatinterpretatie te verbeteren. Ontleed weefsel moet worden overgebracht in een injectieflacon en onmiddellijk worden ingevroren met zo min mogelijk mediabuffer om besmetting door bufferzouten te minimaliseren.Deze benadering heeft ons in staat gesteld om eiwitdynamica te bestuderen in geïdentificeerde cellen en cellijnen in levende embryo's. De nieuwe informatie die we hebben verkregen over de ruimtelijke temporele productie van belangrijke eiwitten in ontwikkelende weefsels heeft ons in staat gesteld om gerichte experimenten te ontwerpen om hun biologische functie te beoordelen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

A Guided Materialen Screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve Sol-gel Afgeleid Eiwit Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisatie van Ambient Massaspectrometrie met het gebruik van Schlieren fotografie

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Synthese en analyse van de Spectrometrie van de massa van Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...