Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Wir danken Jie Li (University of Maryland, College Park) für die wertvollen Diskussionen über embryonale Dissoziation und FACS. Wir danken Vi M. Quach und Camille Lombard-Banek für die Unterstützung bei der Probenvorbereitung und Datenerhebung in früheren Studien, die beispielhaft für die proteomischen Anwendungen stehen, die in diesem Protokoll hervorgehoben werden. Teile dieser Arbeit wurden von der National Science Foundation unter der Fördernummer IOS-1832968 CAREER (an P.N.), den National Institutes of Health unter der Fördernummer R35GM124755 (an P.N.), dem University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (an P.N.) und den Forschungspreisen der COSMOS Club Foundation (an A.B.B. und L.R.P.) unterstützt.

Alle Protokolle, die die humane Pflege und den humanen Umgang mit erwachsenen Fröschen von Xenopus laevis gewährleisten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Maryland, College Park, genehmigt (Zulassungsnummern R-DEC-17-57 und R-FEB-21-07).
1. Bereiten Sie die Lösungen vor
<ol><li>Für die Embryologie<ol><li>Bereiten Sie 1x, 0,5x und 0,2x Steinberg-Lösung (SS) vor und autoklavieren Sie sie dann (120 °C für 20 min) bis zur St...

Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung der Proteinexpression in identifizierten Zelllinien in Embryonen der Xenopus-Spezies . Die Methodik, die auf HRMS zurückgeht, kombiniert eine hervorragende Spezifität bei der molekularen Identifizierung, die Fähigkeit zur Detektion mehrerer Proteine ohne molekulare Sonden (in der Regel Hunderte bis Tausende verschiedener Proteine) und die Fähigkeit zur Quantifizierung. Die Anpassungsfähigkeit an klassische Werkzeuge und Arbeitsabläufe in der Zell- und Entw...

Unser Verständnis der Zelldifferenzierung und der Genese von Geweben und Organen ist das Ergebnis jahrzehntelanger aufwendiger gezielter Screenings von Genen und ihren Produkten. Ein besseres Wissen über alle Biomoleküle und ihre Mengen während wichtiger zellulärer Ereignisse würde dazu beitragen, molekulare Mechanismen zu entschlüsseln, die die räumliche und zeitliche Musterung des Körperbauplans von Wirbeltieren steuern. Technologien, die molekulare Amplifikation und Sequenzierung ermöglichen, sind nun in der Lage, routinemäßig über eine große Anzahl von Genen und Transkripten zu berichten und hypothesengestützte Studien in der biologischen und translationalen Grundlagenforschung zu unterstützen. Um sich entwickelnde Systeme zu verstehen, spricht eine komplexe Beziehung zwischen Transkription und Translation für die direkte Analyse mehrerer Proteine und ihrer posttranslationalen Modifikationen. Die globale Proteomik unter Verwendung biologischer In-vitro-Systeme, wie z. B. induzierter pluripotenter Stammzellen, begann, die Mechanismen der Gewebeinduktion zu beschreiben 1,2. In komplexen Organismen, wie dem Wirbeltierembryo, beruht die Entwicklung auf Morphogengradienten im Kontext von Raum und Zeit3. Daraus folgt, dass das Wissen über proteomische Veränderungen bei der Differenzierung von Zellen zu spezialisierten Geweben, wie z. B. Nervengeweben, einen Schlüssel zur Entschlüsselung molekularer Programme bietet, die die normale und fehlerhafte Entwicklung steuern, und um Therapeutika der nächsten Generation zu steuern.
Der südafrikanische Krallenfrosch (Xenopus laevis) ist ein etabliertes Modell in der Zell- und Entwicklungs-, Neuro- und regenerativen Biologie. Der Nobelpreisfür Physiologie oder Medizin 2012 von Sir John Gurdon 4,5 für die Entdeckung der Pluripotenz des somatischen Kerns unterstrich die Bedeutung dieses Modells für Entdeckungen in Grundlagen- und translationalen Studien. Xenopus-Embryonen entwickeln sich außerhalb der Mutter, was die direkte Manipulation von Zellen, Zellklonen und Genexpression über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg ermöglicht. Asymmetrische Pigmentierung und stereotype Zellteilungen ermöglichten die Kartierung reproduzierbarer Schicksalskarten des 16-6- und 32-zelligen Embryos im 7,8-Stadium. Für die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS)-basierte Proteomik besteht ein weiterer Vorteil des Modells aus der relativ großen Größe (~1 mm Durchmesser), die einen hohen Proteingehalt für die Analyse liefert (~130 μg in Embryonen im frühen Spaltungsstadium, ~10 μg Proteingehalt in einzelnen Zellen des 16-zelligen Embryos)9,10.
Derzeit ist HRMS die führende Technologie der Wahl für den Nachweis von Proteinen. Diese Technologie ermöglicht den direkten, sensitiven und spezifischen Nachweis und die Quantifizierung von mehreren, in der Regel Hunderten bis Tausenden verschiedener Proteine11. Die Bottom-up-Proteomik von HRMS umfasst eine Reihe miteinander verbundener Schritte. Nach der Extraktion aus der Zell-/Gewebeprobe werden Proteine mit einem proteolytischen Enzym, wie z.B. Trypsin, verdaut (Bottom-up-Proteomik). Die resultierenden Peptide werden anhand ihrer unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften getrennt, einschließlich Hydrophobie (Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie, LC), Nettoladung (Ionenaustauschchromatographie), Größe (Größenausschlusschromatographie) oder elektrophoretische Mobilität (Kapillarelektrophorese, CE). Die Peptide werden dann aufgeladen (ionisiert), typischerweise durch Elektrospray-Ionisation (ESI), und Peptidionen werden durch Gasphasenfragmentierung mittels Tandem-HRMS detektiert und sequenziert. Die resultierenden Peptiddaten werden auf das Proteom des untersuchten Organismus abgebildet. Mit proteinspezifischer (proteotypischer) Peptidionen-Signalintensität, die mit der Konzentration korreliert, kann die Proteinquantifizierung markierungsfrei oder markierungsbasiert (Multiplexing-Quantifizierung) durchgeführt werden. Die HRMS-Proteomik liefert eine reichhaltige Informationsquelle über den molekularen Zustand des untersuchten Systems, die die Generierung von Hypothesen und anschließende funktionelle Studien ermöglicht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Räumlich-zeitlich skalierbare Proteomik, die eine zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo ermöglicht. (A) Visualisierung der Probe (1) unter Verwendung eines Stereomikroskops (2) zur Injektion einer identifizierten Zelle (Inset) unter Verwendung einer hergestellten Mikropipette (3) unter Kontrolle durch einen Translationstisch (4). (B) Subzelluläre Probenahme der identifizierten linken D11-Zelle in einem 16-zelligen Embryo. (C) Präparation einer ganzenD-11-Zelle aus einem 16-zelligen Embryo. (D) Fluoreszierende (grüne) Nachverfolgung der linken und rechten D111-Nachkommen aus einem 32-zelligen Embryo zur Steuerung der Dissektion des neuralen Ektoderms (NE) in der Gastrula (Stadium 10) und Isolierung des Nachkommengewebes von der Kaulquappe mittels FACS. Maßstabsbalken: 200 μm für Embryonen, 1,25 mm für das Fläschchen. Die Abbildungen wurden mit Genehmigung der Referenzen 15,19,21,59 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die HRMS-basierte Quantifizierung einer großen Anzahl von Proteinen in identifizierten Zellen/Geweben in sich entwickelnden X. laevis-Embryonen. Der Ansatz baut auf einer genauen Zellidentifikation, reproduzierbaren Zellschicksalskarten und etablierten Methoden zur Verfolgung von Zelllinien in diesem biologischen Modell auf 6,7,8. Wie in Abbildung 1 gezeigt, untersuchen wir Proteome aus einzelnen Zellen, indem wir Ganzzelldissektion oder Kapillarmikroskopie verwenden, um zellulären Inhalt abzusaugen. Die Überwachung der Abstammungslinie einer Zelle ermöglicht es uns, die raumzeitliche Entwicklung des Proteoms zu untersuchen, wenn Zellen während der Gastrulation Gewebe bilden. Die Nachkommen der Zelle werden fluoreszenzmarkiert, indem ein Fluorophor injiziert wird, der an inertes Dextran oder mRNA für fluoreszierendes Protein (z. B. grün fluoreszierendes Protein oder GFP) konjugiert ist. Die markierten Nachkommen werden zu den gewünschten Entwicklungszeitpunkten isoliert. Während der Gastrulation können Zellklone, die eng geclustert sind, durch Dissektion isoliert werden. Nach der Gastrulation können Zellklone aufgrund von Migrationsbewegungen innerhalb des Embryos verteilt und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) aus dissoziierten Geweben isoliert werden. Proteine in diesen Zellen und Geweben werden mittels Bottom-up-Proteomik unter Verwendung von HPLC oder CE zur Trennung und ESI-Tandem-HRMS zur Identifizierung gemessen. Die zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik ist auf verschiedene Zellgrößen und Abstammungslinien innerhalb des Embryos skalierbar und spezifisch, sensitiv und quantitativ. Anhand ausgewählter Beispiele, die hier gezeigt werden, zeigen wir auch, dass dieses Protokoll skalierbar und breit an verschiedene Zelltypen und Zelllinien anpassbar ist.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Abbildung 2: Der bioanalytische Arbeitsablauf. Die Mikrodissektion und Kapillaraspiration (FACS) erleichterte die Probenahme des zellulären und klonalen Proteingehalts. Die Depletion von reichlich vorhandenen Dotterproteinen und die Trennung durch Kapillarelektrophorese (CE) oder Nano-Flow-Flüssigkeitschromatographie (LC) verbesserte die Identifikationsempfindlichkeit (ID) unter Verwendung von hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) mit Elektrospray-Ionisation (ESI). Die Quantifizierung ergab eine Dysregulation, die neue Informationen für hypothesengetriebene Studien in Verbindung mit Informationen aus der Genontologie (GO) lieferte. Die Abbildungen wurden mit Genehmigung von Referenz15 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

Die Charakterisierung molekularer Vorgänge bei der Entstehung von Geweben und Organen in Zellen eröffnet das Potenzial, die normale Entwicklung besser zu verstehen und effiziente Heilmittel für Krankheiten zu entwickeln. Technologien, die eine genaue Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Arten und einer großen Anzahl von Proteinen ermöglichen, würden noch fehlende Informationen über molekulare Mechanismen liefern, die die Entwicklung von Geweben und Organismen in Raum und Zeit orchestrieren. Hier stellen wir ein Massenspektrometrie-basiertes Protokoll vor, das die Messung von Tausenden von Proteinen in identifizierten Zelllinien in Xenopus laevis (Frosch) Embryonen ermöglicht. Der Ansatz baut auf reproduzierbaren Zellschicksalskarten und etablierten Methoden auf, um Zellen und ihre Nachkommen (Klone) aus diesem Modell der Wirbeltierentwicklung zu identifizieren, fluoreszierend zu markieren, zu verfolgen und zu beproben. Nach der Entnahme des Zellinhalts mittels Mikroprobenahme oder der Isolierung von Zellen durch Dissektion oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung werden Proteine extrahiert und für die Bottom-up-Proteomik-Analyse verarbeitet. Flüssigkeitschromatographie und Kapillarelektrophorese werden verwendet, um eine skalierbare Trennung für die Proteindetektion und -quantifizierung mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) zu ermöglichen. Repräsentative Beispiele werden für die proteomische Charakterisierung von Nervengewebe-Schicksalszellen angeführt. Die zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik ist an verschiedene Gewebe und Organismen anpassbar. Es ist sensitiv, spezifisch und quantitativ genug, um in die räumlich-zeitliche Dynamik des Proteoms während der Wirbeltierentwicklung zu blicken.

Dieses Protokoll ermöglichte die Untersuchung von Proteinen in einzelnen Zellen und ihrer Abstammungslinien bei der Etablierung von Geweben in X. laevis-Embryonen. Abbildung 1 veranschaulicht eine solche Anwendung des Ansatzes zur Untersuchung von Proteinen in Zellen mit dem Schicksal von Nervengewebe und des neu induzierten neuralen Ektoderms im Embryo. Wie in Abbildung 1A dargestellt, integrierte der bioanalytische Arbeitsablauf traditionelle Werkzeu...

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Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

In dieser Arbeit beschreiben wir eine massenspektrometriebasierte proteomische Charakterisierung von Zelllinien mit bekannten Gewebeschicksalen im Embryo von Xenopus laevis im Wirbeltier.

Zellliniengesteuerte Massenspektrometrie-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Dieser liniengesteuerte Ansatz ermöglicht die proteomische Analyse wichtiger Entwicklungsereignisse mit räumlicher und zeitlicher Auflösung innerhalb des Wirbeltierembryos und vermittelt Informationen, die durch Messungen des gesamten Embryos nicht zugänglich wären. Dieser Ansatz kann leicht erweitert werden, um Proteine, Metaboliten und Transkripte verschiedener embryonaler Zellen zu untersuchen, während sie sich während der Entwicklung differenzieren. Diese Methode kann unser Verständnis der molekularen Mechanismen verbessern, die die normale Entwicklung und die Entwicklung von Krankheiten steuern, einschließlich der Mechanismen der Gewebeinduktion und des Zellschicksals während der frühen Entwicklung.Verwenden Sie eine Haarschlaufe, um jeden Embryo in eine Vertiefung zu führen, und positionieren Sie ihn vorsichtig so, dass sich die Zielzelle im richtigen Winkel zur Mikronadel befindet. Folgen Sie den Schicksalskarten des Xenopus laevis-Gewebes, um die Vorläuferzelle der interessierenden Abstammungslinie zu identifizieren. Verwenden Sie zwei angespitzte Pinzetten, um die Vitellinmembran, die den Embryo umgibt, vorsichtig zu entfernen.Isolieren Sie die einzelnen Zellen aus dem Embryo durch manuelle Präparation mit einer Pinzette. Beginnen Sie mit dem Einrichten der Injektionsnadel mit der Lineage-Tracer-Lösung. Montieren Sie die Mikroinjektionsnadel in einen Mikropipettenhalter, der von einem mehrachsigen Mikromanipulator gesteuert wird.Schließen Sie den Mikropipettenhalter an einen Mikroinjektor an und füllen Sie die Nadel mit dem Lineage Tracer durch Anlegen von Unterdruck. Kalibrieren Sie die Nadel und passen Sie die Größe der Nadelspitze und die Injektionszeit an, um etwa einen Nanoliter der in Mineralöl gemessenen Tracerlösung zu liefern. Stellen Sie sicher, dass die injizierte Tröpfchengröße genau ist, und passen Sie die Injektoreinstellungen bei Bedarf an.Fluten Sie die Mikroinjektionsschale mit einer 3%igen fCAL-Lösung und übertragen Sie etwa 10 Embryonen mit einer Transferpipette in die Tonschale. Injizieren Sie den zu untersuchenden Zellen etwa einen Nanoliter des fluoreszierenden Dextrans oder 200 Pikogramm GFP-mRNA. Bestätigen Sie mit einem Stereomikroskop den Erfolg der Zellmarkierung.Stellen Sie sicher, dass nur die vorgesehene Zelle injiziert wird. Embryonen, die verletzte oder falsch markierte Zellen enthalten, werden gemäß den institutionellen Richtlinien verworfen. Übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine Petrischale mit 0,5-facher Steinberg-Lösung.Kultivieren Sie sie zwischen 14 und 25 Grad Celsius, bis sie das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben. Übertragen Sie drei bis fünf Embryonen in eine Agarschale mit 0,2-facher Steinberg-Lösung für Mikrodissektionen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den markierten Klon aus dem Embryo zu sezieren.Sammeln Sie das präparierte Gewebe mit einer 0,5- bis 10-Mikroliter-Pipette und geben Sie es in eine Mikrozentrifugenfeile. Saugen Sie mit einer Pipette die Medien ab, die das gesammelte Gewebe umgeben, um Salze in der Probe zu begrenzen und Interferenzen mit der HRMS-Analyse zu vermeiden. Frieren Sie die isolierten Zellen sofort ein, indem Sie das Probenfläschchen auf Trockeneis oder flüssigen Stickstoff legen.Lagern Sie die Proben bis zur massenspektrometrischen Analyse bei minus 80 Grad Celsius. Für die Verarbeitung von Einzelzellproben durch CE denaturieren Sie die Proteine, indem Sie die Probe etwa 15 Minuten lang auf 60 Grad Celsius erhitzen. Bringen Sie die Probe dann fünf Minuten lang auf Raumtemperatur und fügen Sie den Proben Trypsin zum Aufschluss hinzu.Für die Analyse mittels NanoLC werden bis zu fünf präparierte Gewebe in 50 Mikrolitern Lysepuffer lysiert. Erleichtern Sie den Vorgang, indem Sie die Probe auf und ab pipettieren. Um das präparierte Gewebe zu verarbeiten, wird das Lysat 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.Anschließend pelletieren Sie die Zelltrümmer und Eigelbplättchen bei vier Grad Celsius durch Zentrierung bei 4.500 RCF. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenfläschchen und fügen Sie 10 % SDS hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % SDS im Lysat zu erhalten. Bei Geweben werden dem Lysat 0,5 molare Dithiothreitol zugesetzt, um eine Endkonzentration von etwa 25 Millimolaren zu erhalten.Anschließend wird das Lysat 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius inkubiert, um Disulfidbrücken in Proteinen chemisch zu reduzieren. Fügen Sie 0,5 molares Iodacetamid hinzu, um die Endkonzentration von etwa 75 Millimolar im Lysat zu erhalten, und inkubieren Sie das Gemisch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Fügen Sie 0,5 molaren Dithiothreitol hinzu, das dem Anfangsvolumen entspricht, um die von der Alkylierungsreaktion verbleibenden Reaktanten zu löschen.Fallen Sie Proteine in Aceton über Nacht aus, wie im Textprotokoll beschrieben, und rekonstituieren Sie sie in 0,5 molaren Ammoniumbicarbonat. Fügen Sie Trypsin für den Probenaufschluss hinzu und inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 Grad Celsius. Um die Peptide mit CE zu trennen, rekonstituieren Sie das in ein bis zwei Mikrolitern des Probenlösungsmittels verdaute Protein.Die gemischte Probe und die Zentrifusion bei 10.000 RCF zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius vortexen, um Zellreste zu pelletieren. Initialisieren Sie das CE-ESI-Gerät, indem Sie die CE-Kapillare mit dem BGE spülen. Geben Sie einen Mikroliter der Probe in das Probenfläschchen und injizieren Sie ein bis 10 Nanoliter der Probe durch hydrodynamische Injektion in die CE-Trennkapillare.Übertragen Sie das Einlaufende der CE-Trennkapillare in die BGE. Beginnen Sie mit der elektrophoretischen Trennung, indem Sie die CE-Trennspannung von der Erdung aus allmählich erhöhen. Potentiale von 20 bis 28 Kilovolt mit einem Strom unter 10 Mikroampere gewährleisten eine stabile und reproduzierbare instrumentelle Leistung für die Analyse.Um die Peptidprobe mit Nano LC zu trennen, wird sie in der mobilen Phase A erneut suspendiert.Die Konzentration und das Injektionsvolumen der Probe hängen vom verfügbaren LC-System und der Säule ab. Übertragen Sie die Probe in ein LC-Fläschchen. Laden Sie etwa 200 Nanogramm bis zwei Mikrogramm Peptidprobe in die C18-Analysesäule und trennen Sie die Peptide mit einer Flussrate von 300 Nanolitern pro Minute mittels Gradientenelution, wie im Textmanuskript beschrieben.Überprüfen Sie mit einer Kamera den Flüssigkeitsfluss durch den Elektrosprühstrahler und inspizieren Sie den Aufbau visuell auf mögliche Lecks. Erfassen Sie Massenspektrometrieereignisse und sequenzieren Sie die Peptide wie im Textmanuskript beschrieben. Gentranslationale Unterschiede wurden zwischen D11-Zellen nachgewiesen, die mittels CE-ESI-HRMS aus verschiedenen Embryonen präpariert wurden.Linienmarkierte präparierte Zellklone wurden mittels LC-HRMS analysiert. Die Signalwegsanalyse von Proteinen zeigte eine hochregulierte Proteintranslation und einen hochregulierten Energiestoffwechsel im Spemann-Organizer mit dem Neuroektoderm. Das Prodeum des Neuroektoderms war mit Proteinen angereichert, die mit dem nukleären Transport von Proteinfracht in der Zelle assoziiert sind, was wahrscheinlich auf nachgeschaltete Ereignisse nach der Signalübertragung hinweist.Die Anreicherungsanalyse molekularer Funktionen deutete auf eine Hochregulation der Translationsinitiierung, RNA-Bindung und Bindung des Proteasomkomplexes hin, was auf eine Rolle für den dynamischen Proteinumsatz bei der Entwicklung des Spemann-Organizers hindeutet. Wählen Sie für dieses Protokoll nur stereotype Embryonen aus, um die Reproduzierbarkeit und die Interpretation der Ergebnisse zu verbessern. Präpariertes Gewebe sollte in eine Durchstechflasche überführt und sofort eingefroren werden, die so wenig Medienpuffer wie möglich enthält, um die Kontamination durch Puffersalze zu minimieren.Dieser Ansatz hat es uns ermöglicht, die Proteindynamik in identifizierten Zellen und Zelllinien in lebenden Embryonen zu untersuchen. Die neuen Informationen, die wir über die räumlich-zeitliche Produktion wichtiger Proteine in sich entwickelnden Geweben gewonnen haben, haben es uns ermöglicht, gezielte Experimente zu entwerfen, um ihre biologische Funktion zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Forschung

Chemie

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

A Guided Materialien Screening-Ansatz für die Entwicklung von Quantitative Sol-Gel-Derived Protein Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analyse von Proteindynamik mit Wasserstoffwechsel Massenspektrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisierung von Ambient-Massenspektrometrie mit der Verwendung von Schlieren Fotografie

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Mikrosonde Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry für einzellige Metabolomik in Live-Frosch (Xenopus Laevis) Embryonen

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Bildkorrosion an der Metal-Paint-Schnittstelle mit zeitweiliger Ionenmassenspektrometrie

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...