Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

אנו אסירי תודה לג'יה לי (אוניברסיטת מרילנד, קולג' פארק) על דיונים חשובים על דיסוציאציה עוברית ו- FACS. אנו מודים ל- Vi M. Quach ול- Camille Lombard-Banek על הסיוע בהכנת הדגימות ואיסוף הנתונים במחקרים קודמים המדגימים את היישומים הפרוטאומיים המודגשים בפרוטוקול זה. חלקים מעבודה זו נתמכו על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מספר IOS-1832968 CAREER (ל- P.N.), המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R35GM124755 (ל- P.N.), תוכנית השותפות של אוניברסיטת מרילנד-המכון הלאומי לסרטן (ל- P.N.), ופרסי המחקר של קרן מועדון קוסמוס (ל- A.B.B. ו- L.R.P).

כל הפרוטוקולים המבטיחים תחזוקה אנושית וטיפול בצפרדעים בוגרות של Xenopus laevis אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מרילנד, קולג' פארק (מספרי אישור R-DEC-17-57 ו- R-FEB-21-07).
1. הכינו את הפתרונות
<ol><li>לאמבריולוגיה<ol><li>הכינו את התמיסה של שטיינברג (SS...

פרוטוקול זה מאפשר אפיון ביטוי חלבונים בשושלות תאים מזוהות בעוברים מזן הקסנופוס . המתודולוגיה, המבוססת על HRMS, משלבת ספציפיות מעולה בזיהוי מולקולרי, יכולת לגילוי רב-חלבוני ללא בדיקות מולקולריות (בדרך כלל מאות עד אלפי חלבונים שונים), ויכולת כימות. הסתגלות לכלים קלאסיים ולתהליכי עבודה בב...

הבנתנו את התמיינות התאים ואת היווצרותם של רקמות ואיברים היא תוצאה של עשרות שנים של בדיקות ממוקדות מורכבות של גנים ותוצריהם. הגדלת הידע שלנו על כל הביומולקולות וכמותן במהלך אירועים תאיים חשובים תסייע לפענח מנגנונים מולקולריים השולטים בתבניות המרחביות והזמניות של תוכנית הגוף של בעלי החוליות. טכנולוגיות המאפשרות הגברה מולקולרית וריצוף מסוגלות כיום לדווח באופן שגרתי על מספר רב של גנים ותעתיקים, ותומכות במחקרים מונחי השערות במחקר ביולוגי ותרגומי בסיסי. כדי להבין מערכות מתפתחות, מערכת יחסים מורכבת בין שעתוק לתרגום דוגלת בניתוח ישיר של חלבונים מרובים ובשינויים שלאחר התרגום. פרוטאומיקה גלובלית המשתמשת במערכות ביולוגיות במבחנה, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, החלה לשרטט מנגנונים של השראת רקמות 1,2. באורגניזמים מורכבים, כגון עובר בעל חוליות, ההתפתחות מסתמכת על שיפועים מורפוגניים בהקשר של מרחב וזמן3. מכאן נובע כי רכישת ידע על שינויים פרוטאומיים כאשר תאים מתמיינים ליצירת רקמות מיוחדות, כגון רקמות עצביות, מציעה מפתח לפתיחת תוכניות מולקולריות השולטות בהתפתחות נורמלית ופגומית ומנחה את הדור הבא של הטיפולים.
צפרדע בעלת טפרים דרום אפריקאית (Xenopus laevis) היא מודל מבוסס היטב בביולוגיה תאית והתפתחותית, נוירו ורגנרטיבית. פרס נובללפיזיולוגיה או לרפואה 4,5 של סר ג'ון גורדון לשנת 2012 על גילוי הפלוריפוטנטיות של הגרעין הסומטי הדגיש את חשיבותו של מודל זה לתגליות במחקרים בסיסיים ותרגומיים. עוברי קסנופוס מתפתחים חיצונית לאם, ובכך מאפשרים מניפולציה ישירה של תאים, שיבוטים של תאים וביטוי גנים בשלבי התפתחות שונים. פיגמנטציה אסימטרית וחלוקות תאים סטריאוטיפיות אפשרו לשרטט מפות גורל הניתנות לשחזור מהעובר בן 16-6 ו-32 תאים 7,8. עבור פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS), יתרונות נוספים של המודל כוללים גודל גדול יחסית (~ 1 מ"מ קוטר), אשר מניב תכולת חלבון בשפע לניתוח (~ 130 מיקרוגרם בעוברים בשלב המחשוף המוקדם, ~ 10 מיקרוגרם של תכולת חלבון בתאים בודדים של עובר בן 16 תאים)9,10.
כיום, HRMS היא הטכנולוגיה המובילה המועדפת לגילוי חלבונים. טכנולוגיה זו מאפשרת איתור וכימות ישיר, רגיש וספציפי של חלבונים מרובים, בדרך כלל מאות עד אלפי חלבונים שונים11. פרוטאומיקה מלמטה למעלה על ידי HRMS כוללת סדרה של שלבים הקשורים זה בזה. לאחר מיצוי מדגימת התא/רקמה, חלבונים מתעכלים עם אנזים מפרקי חלבון, כגון טריפסין (פרוטאומיקה מלמטה למעלה). הפפטידים המתקבלים מופרדים בהתבסס על התכונות הפיזיקוכימיות השונות שלהם, כולל הידרופוביות (כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה, LC), מטען נטו (כרומטוגרפיה של החלפת יונים), גודל (כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל), או ניידות אלקטרופורטית (אלקטרופורזה נימית, CE). לאחר מכן פפטידים נטענים (מיוננים), בדרך כלל באמצעות יינון אלקטרוספריי (ESI), ויונים פפטידים מזוהים ומרוצפים באמצעות פיצול פאזת גז על ידי טנדם HRMS. הנתונים הפפטידים המתקבלים ממופים לפרוטאום של האורגניזם הנחקר. עם מתאם בין עוצמת אות יון פפטידי ספציפי לחלבון (פרוטטיפי) לבין ריכוז, ניתן לבצע כימות חלבון ללא תווית או מבוסס תווית (כימות ריבוב). פרוטאומיקה HRMS מניבה משאב עשיר של מידע על המצב המולקולרי של המערכת הנחקרת, ומאפשרת יצירת השערות ומחקרים פונקציונליים עוקבים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> איור 1: פרוטאומיקה מרחבית-זמנית המאפשרת פרוטאומיקה מונחית שושלת תאים HRMS בעובר המתפתח (צפרדע). (A) הדמיה של הדגימה (1) באמצעות סטריאומיקרוסקופ (2) להזרקה של תא מזוהה (inset), באמצעות מיקרופיפטה מפוברקת (3) תחת בקרה על ידי שלב תרגום (4). (B) דגימה תת-תאית של תא D 11 השמאלי שזוהה בעובר בן16 תאים. (C) דיסקציה של תא D 11 שלם מעובר בן16 תאים. (D) מעקב פלואורסצנטי (ירוק) של צאצאי D111 משמאל ומימין מעובר בן 32 תאים כדי להנחות דיסקציה של האקטודרם העצבי (NE) בגסטרולה (שלב 10) ובידוד הרקמה היורדת מהראשנים באמצעות FACS. מוטות קנה מידה: 200 מיקרומטר לעוברים, 1.25 מ"מ לבקבוקון. הנתונים אומצו באישור הפניות 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר כימות מבוסס HRMS של מספר רב של חלבונים בתאים/רקמות מזוהים בעוברי X. laevis מתפתחים. הגישה מתבססת על זיהוי מדויק של תאים, מפות גורל תאים הניתנות לשחזור, ומתודולוגיות מבוססות למעקב אחר שושלות תאים במודל ביולוגיזה 6,7,8. כפי שניתן לראות באיור 1, אנו חוקרים פרוטאומים מתאים בודדים על-ידי שימוש בדיסקציה של תאים שלמים או במיקרו-דגימה נימית כדי לשאוף תוכן תאי. ניטור השושלת של התא מאפשר לנו לחקור את האבולוציה המרחבית-זמנית של הפרוטאום כאשר תאים יוצרים רקמות במהלך גסטרולציה. צאצאי התא מסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי הזרקת פלואורופור מצומד לדקסטרן אינרטי או mRNA עבור חלבון פלואורסצנטי (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, או GFP). הצאצא המסומן מבודד בנקודות זמן התפתחותיות רצויות. במהלך הגסטרולציה, שיבוטים של תאים המקובצים היטב עשויים להיות מבודדים על ידי דיסקציה. לאחר הגסטרולציה, שיבוטים של תאים עשויים להיות מופצים בתוך העובר עקב תנועות נדידה וניתן לבודד אותם מרקמות מנותקות על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS). חלבונים בתאים וברקמות אלה נמדדים באמצעות פרוטאומיקה מלמטה למעלה המשתמשת ב- HPLC או CE להפרדה ו- ESI טנדם HRMS לזיהוי. פרוטאומיקה HRMS מונחית שושלת תאים ניתנת להרחבה לגדלי תאים ושושלות שונות בתוך העובר והיא ספציפית, רגישה וכמותית. באמצעות דוגמאות נבחרות המוצגות כאן, אנו גם מדגימים שפרוטוקול זה ניתן להרחבה ולהתאמה רחבה לסוגים שונים של תאים ושושלות תאים.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> איור 2: תהליך העבודה הביואנליטי. מיקרו-דיסקציה ושאיפה נימית, או FACS הקל על דגימה של תכולת חלבון תאי ושבטי. דלדול חלבוני חלמון בשפע והפרדה על ידי אלקטרופורזה נימית (CE) או כרומטוגרפיה נוזלית ננו-זרימה (LC) רגישות זיהוי משופר (ID) באמצעות יינון אלקטרוספריי (ESI) ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS). הכימות חשף חוסר ויסות, וסיפק מידע חדש למחקרים מונחי השערות בשילוב עם מידע זמין מאונטולוגיה גנטית (GO). האיורים עובדו באישור הפניה15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

אפיון אירועים מולקולריים כתאים המולידים רקמות ואיברים מעלה פוטנציאל להבין טוב יותר התפתחות תקינה ולתכנן תרופות יעילות למחלות. טכנולוגיות המאפשרות זיהוי וכימות מדויקים של סוגים שונים ומספר גדול של חלבונים יספקו מידע שעדיין חסר על מנגנונים מולקולריים המתזמרים התפתחות רקמות ואורגניזמים במרחב ובזמן. כאן אנו מציגים פרוטוקול מבוסס ספקטרומטריית מסות המאפשר מדידה של אלפי חלבונים בשושלות תאים מזוהות בעוברי צפרדע (Xenopus laevis ). הגישה מתבססת על מפות גורל התא הניתנות לשחזור ושיטות מבוססות לזיהוי, תיוג, מעקב ודגימה פלואורסצנטית של תאים וצאצאיהם (שיבוטים) ממודל זה של התפתחות בעלי חוליות. לאחר איסוף תוכן תאי באמצעות מיקרו-דגימה או בידוד תאים על ידי דיסקציה או מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, חלבונים מופקים ומעובדים לאנליזה פרוטאומית מלמטה למעלה. כרומטוגרפיה נוזלית ואלקטרופורזה נימית משמשות כדי לספק הפרדה ניתנת להרחבה לזיהוי וכימות חלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (HRMS). דוגמאות מייצגות ניתנות לאפיון פרוטאומי של תאים בעלי גורל לרקמה עצבית. פרוטאומיקה HRMS מונחית שושלת תאים ניתנת להתאמה לרקמות ואורגניזמים שונים. הוא רגיש, ספציפי וכמותי מספיק כדי להציץ לתוך הדינמיקה המרחבית-טמפורלית של הפרוטאום במהלך התפתחות בעלי חוליות.

פרוטוקול זה איפשר לחקור חלבונים בתאים בודדים ואת השושלות שלהם כאשר הם מקימים רקמות בעוברים X. laevis. איור 1 מדגים יישום אחד כזה של הגישה לחקר חלבונים בתאים שגורלם רקמה עצבית והאקטודרם העצבי החדש שהושרה בעובר. כפי שניתן לראות באיור 1A, זרימת העבודה הביואנלי...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

כאן אנו מתארים אפיון פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסות של שושלות תאים עם גורלות רקמות ידועים בעובר בעל חוליות Xenopus laevis .

ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

גישה מונחית שושלת זו מאפשרת ניתוח פרוטאומי של אירועים התפתחותיים חשובים ברזולוציה מרחבית וזמנית בתוך העובר בעל החוליות, ומקנה מידע שלא יהיה נגיש באמצעות מדידות עובר שלם. גישה זו יכולה להיות מורחבת בקלות כדי לחקור חלבונים, מטבוליטים ותעתיקים מתאים עובריים שונים כפי שהם מתמיינים במהלך ההתפתחות. שיטה זו יכולה לקדם את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים השולטים בהתפתחות תקינה ומחלות, כולל מנגנונים של השראת רקמות ומחויבות לגורל התא במהלך ההתפתחות המוקדמת.השתמש בלולאת שיער כדי להנחות כל עובר לתוך באר ולמקם אותם בעדינות כך שתא היעד של העניין יהיה בזווית הנכונה למיקרו-מחט. עקוב אחר מפות גורל הרקמה של xenopus laevis כדי לזהות את התא המבשר של השושלת המעניינת. השתמש בשני מלקחיים מחדדים כדי להסיר בעדינות את קרום ויטלין המקיף את העובר.בודדו את התאים הבודדים מהעובר על ידי דיסקציה ידנית באמצעות מלקחיים. התחל על ידי הגדרת מחט ההזרקה המכילה את תמיסת נותב השושלת. הרכיבו את מחט המיקרו-הזרקה לתוך מחזיק מיקרו פיפטה הנשלט על ידי מניפולטור מיקרו רב צירים.חבר את מחזיק המיקרו פיפטה למזרק מיקרו ומלא את המחט בעוקב השושלת על ידי הפעלת לחץ שלילי. כייל את המחט והתאם את גודל קצה המחט ואת זמן ההזרקה כדי לספק כננוליטר אחד של תמיסת נותב השושלת הנמדדת בשמן מינרלי. ודא שגודל הטיפה המוזרק מדויק והתאם את הגדרות המזרק במידת הצורך.הציפו את צלחת החימר במיקרו-הזרקה בתמיסת fCAL 3% והעבירו כ-10 עוברים לצלחת החימר באמצעות פיפטת העברה. הזריקו לתאים המעניינים כננוליטר אחד של דקסטרן פלואורסצנטי או 200 פיקוגרמות של GFP mRNA. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, לאשר את ההצלחה של תיוג תאים.ודא שרק התא המיועד מוזרק. יש להשליך עוברים המכילים תאים פגומים או מסומנים באופן שגוי בהתאם למדיניות מוסדית. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי המכילה תמיסת שטיינברג פי 0.5.תרבית אותם בין 14 ל 25 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי. מעבירים שלושה עד חמישה עוברים לצלחת אגר המכילה תמיסת שטיינברג 0.2x לדיסקציות מיקרו. השתמש במלקחיים כדי לנתח את השיבוט המסומן מהעובר.לאסוף את הרקמה מנותחת עם פיפטה 0.5 עד 10 מיקרוליטר ולהפקיד אותם לתוך קובץ צנטריפוגה מיקרו. באמצעות פיפטה, שאפו את המדיה סביב הרקמה שנאספה להגביל מלחים בדגימה כדי למנוע הפרעה לניתוח HRMS. מיד להקפיא את התאים המבודדים על ידי הנחת בקבוקון הדגימה על קרח יבש או חנקן נוזלי.אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח ספקטרומטריית מסות. עבור עיבוד דגימה של תא בודד על ידי CE, denature החלבונים על ידי חימום הדגימה ל 60 מעלות צלזיוס במשך כ -15 דקות. לאחר מכן אזנו את הדגימה לטמפרטורת החדר למשך חמש דקות והוסיפו טריפסין לדגימות לעיכול.לניתוח על ידי NanoLC, ליז עד חמש רקמות מנותחות ב 50 מיקרוליטר של חיץ ליזיס. להקל על התהליך על ידי pipeting את הדגימה למעלה ולמטה. כדי לעבד את הרקמות המנותחות, לדגור את הליזט בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לאחר מכן מטילים את פסולת התא ואת טסיות החלמון בארבע מעלות צלזיוס על ידי צנטריפיקציה ב 4, 500 RCF. מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון מיקרו-צנטריפוגה נקי ומוסיפים 10%SDS לקבלת ריכוז סופי של 1% SDS בליזט. עבור רקמות, להוסיף 0.5 dithiothreitol מולארי ליזט כדי לקבל ריכוז סופי של כ 25 מילימולר.לאחר מכן לדגור על הליזט במשך 30 דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כדי להפחית כימית את הקשרים הדיסולפידים בחלבונים. מוסיפים 0.5 יודואצטמיד מולארי כדי לקבל את הריכוז הסופי של כ 75 מילימולר בליזט ולדגור על התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף 0.5 dithiothreitol מולארי זהה לנפח הראשוני כדי להרוות את המגיבים שנותרו מתגובת האלקילציה.לזרז חלבונים באצטון בן לילה כמתואר בפרוטוקול הטקסט וליצור מחדש ב 0.5 אמוניום ביקרבונט מולארי. מוסיפים טריפסין לעיכול הדגימה ודגרים על הבקבוקונים ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להפריד את הפפטידים באמצעות CE, לשחזר את החלבון מעוכל אחד עד שני מיקרוליטר של ממס הדגימה.מערבול את הדגימה המעורבת ואת הצנטריפויה ב 10, 000 RCF במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי פסולת תא גלולה. אתחל את מכשיר CE-ESI על ידי שטיפת נימי CE עם BGE. הכניסו מיקרוליטר אחד של דגימה לבקבוקון הדגימה והזריקו אחד עד 10 ננוליטר מהדגימה לנימי הפרדת CE בהזרקה הידרודינמית.מעבירים את קצה הכניסה של נימי ההפרדה CE לתוך BGE. התחל הפרדה אלקטרופורטית על ידי העלאה הדרגתית של מתח ההפרדה CE מאדמת כדור הארץ. פוטנציאלים של 20 עד 28 קילו-וולט עם זרם מתחת ל-10 מיקרו-אמפר מבטיחים ביצועים אינסטרומנטליים יציבים וניתנים לשחזור לצורך ניתוח.כדי להפריד באמצעות Nano LC, השהה מחדש את דגימת הפפטיד בשלב הנייד A.ריכוז הדגימה ונפח ההזרקה תלויים במערכת LC ובעמודה הזמינה. מעבירים את הדגימה לבקבוקון LC. לטעון כ-200 ננוגרם לשני מיקרוגרם של דגימת פפטיד לתוך העמודה האנליטית C18 ולהפריד את הפפטידים בקצב זרימה של 300 ננו-ליטר לדקה באמצעות אלוציה הדרגתית כמתואר בכתב היד של הטקסט.באמצעות מצלמה, בדוק את זרימת הנוזל דרך פולט התרסיס האלקטרוני ובדוק חזותית את ההתקנה עבור דליפות אפשריות. לרכוש אירועי ספקטרומטריית מסות ולרצף את הפפטידים כמתואר בכתב היד של הטקסט. הבדלים תרגומיים גנטיים התגלו בין תאי D11 שנותחו מעוברים שונים באמצעות CE-ESI-HRMS.שיבוטים של תאים מנותחים עם תווית שושלת נותחו על ידי LC-HRMS. ניתוח מסלול של חלבונים הראה תרגום חלבונים מווסת ומטבוליזם אנרגיה במארגן של Spemann עם neuroectoderm. הנוירואקטודרם פרודאום הועשר בחלבונים הקשורים להובלה גרעינית של מטען חלבונים בתא, מה שככל הנראה מצביע על אירועים במורד הזרם בעקבות איתות.ניתוח ההעשרה של פונקציות מולקולריות הצביע על upregulation בהתחלת תרגום, קשירת RNA וקשירה של קומפלקס פרוטאזום, מה שמרמז על תפקיד לתחלופת חלבונים דינמית בפיתוח המארגן של Spemann. בחר רק עוברים סטריאוטיפיים עבור פרוטוקול זה כדי לשפר את יכולת השחזור ואת פרשנות התוצאה. יש להעביר רקמה מנותחת לבקבוקון ולהקפיא מיד המכילה חיץ מדיה מינימלי ככל האפשר כדי למזער את הזיהום ממלחי חיץ.גישה זו אפשרה לנו לחקור דינמיקה של חלבונים בתאים מזוהים ושושלות תאים בעוברים חיים. המידע החדש שהשגנו על הייצור הזמני המרחבי של חלבונים חשובים ברקמות מתפתחות אפשר לנו לתכנן ניסויים ממוקדים כדי להעריך את תפקודם הביולוגי.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח Microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

ויזואליזציה של ספקטרומטריית אמביינט המוני עם השימוש של צילומי שליארן

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...