Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

हम भ्रूण पृथक्करण और एफएसीएस पर मूल्यवान चर्चा के लिए जी ली (मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क) के आभारी हैं। क्वाच और केमिली लोम्बार्ड-बैनेक को पिछले अध्ययनों में नमूना तैयार करने और डेटा संग्रह के साथ सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं जो इस प्रोटोकॉल में हाइलाइट किए गए प्रोटिओमिक अनुप्रयोगों का उदाहरण देते हैं। इस काम के कुछ हिस्सों को पुरस्कार संख्या आईओएस -1832968 करियर (पीएन को), पुरस्कार संख्या आर 35 जीएम 124755 (पीएन को) के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, मैरीलैंड विश्वविद्यालय-राष्ट्रीय कैंसर संस्थान साझेदारी कार्यक्रम (पीएन को), और कॉसमॉस क्लब फाउंडेशन अनुसंधान पुरस्कार (एबीबी और एलआरपी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।

जेनोपस लेविस वयस्क मेंढकों के मानवीय रखरखाव और हैंडलिंग को सुनिश्चित करने वाले सभी प्रोटोकॉल मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (अनुमोदन संख्या आर-डीईसी-17...

यह प्रोटोकॉल जेनोपस प्रजातियों के भ्रूण में पहचाने गए सेल वंश में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है। एचआरएमएस से उपजी, कार्यप्रणाली आणविक पहचान में उत्तम विशिष्टता, आणविक जांच क...

सेल भेदभाव और ऊतकों और अंगों की उत्पत्ति की हमारी समझ जीन और उनके उत्पादों की विस्तृत लक्षित स्क्रीन के दशकों का परिणाम है। महत्वपूर्ण सेलुलर घटनाओं के दौरान सभी बायोमोलेक्यूल्स और उनकी मात्रा के बारे में हमारे ज्ञान को बढ़ाने से आणविक तंत्र को उजागर करने में मदद मिलेगी जो कशेरुक शरीर योजना के स्थानिक और लौकिक पैटर्निंग को नियंत्रित करते हैं। आणविक प्रवर्धन और अनुक्रमण को सक्षम करने वाली प्रौद्योगिकियां अब बड़ी संख्या में जीन और प्रतिलेख पर नियमित रूप से रिपोर्ट करने में सक्षम हैं, जो बुनियादी जैविक और अनुवाद अनुसंधान में परिकल्पना-संचालित अध्ययनों का समर्थन करती हैं। विकासशील प्रणालियों को समझने के लिए, प्रतिलेखन और अनुवाद के बीच एक जटिल संबंध कई प्रोटीनों और उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के प्रत्यक्ष विश्लेषण की वकालत करता है। इन विट्रो जैविक प्रणालियों का उपयोग करके वैश्विक प्रोटिओमिक्स, जैसे कि प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल, ऊतक प्रेरण 1,2 के तंत्र को चित्रित करना शुरू कर दिया। जटिल जीवों में, जैसे कशेरुक भ्रूण, विकास अंतरिक्ष और समय 3 के संदर्भ में मोर्फोजेन ग्रेडिएंट पर निर्भर करताहै। यह इस प्रकार है कि प्रोटिओमिक परिवर्तनों का ज्ञान प्राप्त करना क्योंकि कोशिकाएं विशेष ऊतकों, जैसे तंत्रिका ऊतकों को बनाने के लिए अंतर करती हैं, सामान्य और दोषपूर्ण विकास को नियंत्रित करने वाले आणविक कार्यक्रमों को अनलॉक करने और अगली पीढ़ी के चिकित्सीय मार्गदर्शन के लिए एक कुंजी प्रदान करती हैं।
कशेरुक दक्षिण अफ्रीकी पंजे वाला मेंढक (जेनोपस लेविस) सेल और विकासात्मक, न्यूरो-और पुनर्योजी जीव विज्ञान में एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है। दैहिक नाभिक की प्लूरिपोटेंसी की खोज के लिए सर जॉन गुरडन के 2012 के फिजियोलॉजी या मेडिसिन 4,5 में नोबेल पुरस्कार ने बुनियादी और ट्रांसलेशनल अध्ययनों में खोजों के लिए इस मॉडल के महत्व पर प्रकाश डाला। जेनोपस भ्रूण मां के लिए बाहरी रूप से विकसित होते हैं, इस प्रकार विकास के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं, सेल क्लोन और जीन अभिव्यक्ति के प्रत्यक्ष हेरफेर की सुविधा प्रदान करते हैं। विषम रंजकता और रूढ़िवादी कोशिका विभाजन ने 16-6 और 32-सेल 7,8 चरण भ्रूण से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य भाग्यमानचित्रों के चार्टिंग को सक्षम किया। उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआरएमएस) आधारित प्रोटिओमिक्स के लिए, मॉडल के अतिरिक्त लाभों में अपेक्षाकृत बड़ा आकार (~ 1 मिमी व्यास) शामिल है, जो विश्लेषण के लिए प्रचुर मात्रा में प्रोटीन सामग्री पैदा करता है (प्रारंभिक दरार-चरण भ्रूण में ~ 130 μg, 16-सेल भ्रूण की एकल कोशिकाओं में ~ 10 μg प्रोटीन सामग्री)9,10।
वर्तमान में, एचआरएमएस प्रोटीन का पता लगाने के लिए पसंद की अग्रणी तकनीक है। यह तकनीक कई, आमतौर पर सैकड़ों से हजारों विभिन्न प्रोटीनों का प्रत्यक्ष, संवेदनशील और विशिष्ट पता लगाने और परिमाणीकरण करने में सक्षम बनातीहै। एचआरएमएस द्वारा बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स में परस्पर जुड़े चरणों की एक श्रृंखला शामिल है। ऊतक के नमूने से निष्कर्षण के बाद, प्रोटीन को प्रोटियोलिटिक एंजाइम के साथ पचाया जाता है, जैसे ट्रिप्सिन (बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स)। परिणामी पेप्टाइड्स को उनके विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों के आधार पर अलग किया जाता है, जिसमें हाइड्रोफोबिसिटी (उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी, एलसी), नेट चार्ज (आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी), आकार (आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी), या इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता (केशिका वैद्युतकणसंचलन, सीई) शामिल हैं। पेप्टाइड्स को तब चार्ज (आयनित) किया जाता है, आमतौर पर इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) का उपयोग करके, और पेप्टाइड आयनों का पता लगाया जाता है और अग्रानुक्रम एचआरएमएस द्वारा गैस-चरण विखंडन के माध्यम से अनुक्रमित किया जाता है। परिणामी पेप्टाइड डेटा का अध्ययन किए जा रहे जीव के प्रोटिओम में मैप किया जाता है। प्रोटीन-विशिष्ट (प्रोटिओटिपिक) पेप्टाइड आयन सिग्नल तीव्रता एकाग्रता के साथ सहसंबंध के साथ, प्रोटीन परिमाणीकरण लेबल-मुक्त या लेबल-आधारित (मल्टीप्लेक्सिंग मात्रा) किया जा सकता है। एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स अध्ययन के तहत सिस्टम की आणविक स्थिति पर जानकारी का एक समृद्ध संसाधन उत्पन्न करता है, जिससे परिकल्पनाओं और अनुवर्ती कार्यात्मक अध्ययनों की पीढ़ी की अनुमति मिलती है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> चित्रा 1: विकासशील (मेंढक) भ्रूण में सेल-वंश निर्देशित एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स को सक्षम करने वाले स्थानिक स्केलेबल प्रोटिओमिक्स। (ए) एक पहचान किए गए सेल (इनसेट) के इंजेक्शन के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (2) का उपयोग करके नमूने का विज़ुअलाइज़ेशन, अनुवाद-चरण द्वारा नियंत्रण में एक निर्मित माइक्रोपिपेट (3) का उपयोग करना (4). (बी) 16-सेल भ्रूण में पहचाने गए बाएं डी11 सेल का उपकोशिकीय नमूना। (सी) 16-सेल भ्रूण से पूरे डी 11 सेल का विच्छेदन। (डी) गैस्ट्रुला (चरण10) में तंत्रिका एक्टोडर्म (एनई) के विच्छेदन और एफएसीएस का उपयोग करके टैडपोल से वंशज ऊतक के अलगाव का मार्गदर्शन करने के लिए 32-सेल भ्रूण से बाएं और दाएं डी 111 संतानों का फ्लोरोसेंट (हरा) अनुरेखण। स्केल बार: भ्रूण के लिए 200 μm, शीशी के लिए 1.25 मिमी। आंकड़ेसंदर्भ 15,19,21,59 से अनुमति के साथ अनुकूलित किए गए थे। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एचआरएमएस-आधारित मात्रा में एक्स लेविस भ्रूण विकसित करने में पहचाने गए कोशिकाओं / ऊतकों में प्रोटीन की बड़ी संख्या का परिमाणीकरण करने में सक्षम बनाता है। दृष्टिकोण इस जैविक मॉडल 6,7,8 में सेल वंशावली को ट्रैक करने के लिए सटीक सेल पहचान, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल भाग्य मानचित्र और स्थापित पद्धतियों पर आधारित है। जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, हम पूरे सेल विच्छेदन या केशिका माइक्रोसैंपलिंग को एस्पिरेट सेलुलर सामग्री को नियोजित करके एकल कोशिकाओं से प्रोटिओम का अध्ययन करते हैं। एक कोशिका के वंश की निगरानी हमें प्रोटिओम के स्थानिक विकास का अध्ययन करने की अनुमति देती है क्योंकि कोशिकाएं गैस्ट्रुलेशन के दौरान ऊतक बनाती हैं। सेल संतान को फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, या जीएफपी) के लिए निष्क्रिय डेक्सट्रान या एमआरएनए के संयुग्मित फ्लोरोफोरे को इंजेक्ट करके फ्लोरोसेंट रूप से चिह्नित किया जाता है। लेबल की गई संतान को वांछित विकास समय बिंदुओं पर अलग किया जाता है। गैस्ट्रुलेशन के दौरान, सेल क्लोन जो कसकर क्लस्टर होते हैं, उन्हें विच्छेदन द्वारा अलग किया जा सकता है। गैस्ट्रुलेशन के बाद, सेल क्लोन को प्रवासी आंदोलनों के कारण भ्रूण के भीतर वितरित किया जा सकता है और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा अलग ऊतकों से अलग किया जा सकता है। इन कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन को पृथक्करण के लिए एचपीएलसी या सीई और पहचान के लिए ईएसआई टेंडम एचआरएमएस का उपयोग करके बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स के माध्यम से मापा जाता है। सेल-वंश-निर्देशित एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स भ्रूण के भीतर विभिन्न सेल आकारों और वंशों के लिए स्केलेबल है और विशिष्ट, संवेदनशील और मात्रात्मक है। यहां दिखाए गए चुनिंदा उदाहरणों के माध्यम से, हम इस प्रोटोकॉल को स्केलेबल और व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और सेल वंशों के लिए अनुकूलनीय होने का भी प्रदर्शन करते हैं।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> चित्रा 2: जैव-विश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो। सूक्ष्म विच्छेदन और केशिका आकांक्षा, या एफएसीएस ने सेलुलर और क्लोनल प्रोटीन सामग्री के नमूने की सुविधा प्रदान की। इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआरएमएस) का उपयोग करके प्रचुर मात्रा में जर्दी प्रोटीन की कमी और केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) या नैनो-प्रवाह तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) बढ़ी हुई पहचान (आईडी) संवेदनशीलता द्वारा पृथक्करण। परिमाणीकरण ने डिसरेग्यूलेशन का खुलासा किया, जीन ऑन्कोलॉजी (जीओ) से उपलब्ध जानकारी के साथ संयोजन में परिकल्पना-संचालित अध्ययनों के लिए नई जानकारी प्रदान की। आंकड़े संदर्भ15 से अनुमति के साथ अनुकूलित किए गए थे। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

आणविक घटनाओं का लक्षण वर्णन क्योंकि कोशिकाएं ऊतकों और अंगों को जन्म देती हैं, सामान्य विकास को बेहतर ढंग से समझने और रोगों के लिए कुशल उपचार डिजाइन करने की क्षमता बढ़ाती हैं। विभिन्न प्रकारों और बड़ी संख्या में प्रोटीन की सटीक पहचान और परिमाणीकरण को सक्षम करने वाली प्रौद्योगिकियां अंतरिक्ष और समय में ऊतक और जीव विकास को व्यवस्थित करने वाले आणविक तंत्र पर अभी भी लापता जानकारी प्रदान करेंगी। यहां, हम एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो जेनोपस लेविस (मेंढक) भ्रूण में पहचाने गए सेल वंश में हजारों प्रोटीन के माप को सक्षम बनाता है। दृष्टिकोण प्रजनन योग्य सेल-भाग्य मानचित्रों और कशेरुक विकास के इस मॉडल से कोशिकाओं और उनकी संतान (क्लोन) की पहचान, फ्लोरोसेंटली लेबल, ट्रैक और नमूना करने के लिए स्थापित तरीकों पर आधारित है। माइक्रोसैंपलिंग का उपयोग करके सेलुलर सामग्री एकत्र करने या विच्छेदन या प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कोशिकाओं को अलग करने के बाद, प्रोटीन को निकाला जाता है और नीचे-ऊपर प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए संसाधित किया जाता है। तरल क्रोमैटोग्राफी और केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआरएमएस) के साथ प्रोटीन का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए स्केलेबल पृथक्करण प्रदान करने के लिए किया जाता है। तंत्रिका-ऊतक वसा कोशिकाओं के प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान किए जाते हैं। सेल-वंश-निर्देशित एचआरएमएस प्रोटिओमिक्स विभिन्न ऊतकों और जीवों के लिए अनुकूलनीय है। कशेरुक विकास के दौरान प्रोटिओम की स्थानिक-अस्थायी गतिशीलता में देखने के लिए यह पर्याप्त रूप से संवेदनशील, विशिष्ट और मात्रात्मक है।

इस प्रोटोकॉल ने एकल कोशिकाओं और उनके वंशों में प्रोटीन के अध्ययन को सक्षम किया क्योंकि वे एक्स लेविस भ्रूण में ऊतक स्थापित करते हैं। चित्रा 1 तंत्रिका-ऊतक-वसा कोशिकाओं और भ्रूण में नए प्?...

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Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

यहां हम कशेरुक जेनोपस लेविस भ्रूण में ज्ञात ऊतक भाग्य के साथ सेल वंश के मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन का वर्णन करते हैं।

विकासशील (मेंढक) भ्रूण में सेल-वंश निर्देशित मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

यह वंश निर्देशित दृष्टिकोण कशेरुक भ्रूण के भीतर स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ महत्वपूर्ण विकास ता्मक घटनाओं के प्रोटिओमिक विश्लेषण को सक्षम बनाता है जो जानकारी प्रदान करता है जो पूरे भ्रूण माप के माध्यम से सुलभ नहीं होगा। इस दृष्टिकोण को विभिन्न भ्रूण कोशिकाओं से प्रोटीन, मेटाबोलाइट्स और प्रतिलेख का अध्ययन करने के लिए आसानी से बढ़ाया जा सकता है क्योंकि वे विकास के दौरान अंतर करते हैं। यह विधि आणविक तंत्र की हमारी समझ को आगे बढ़ा सकती है जो सामान्य और रोग के विकास को नियंत्रित करती है, जिसमें प्रारंभिक विकास के दौरान ऊतक प्रेरण और सेल भाग्य प्रतिबद्धता के तंत्र शामिल हैं।प्रत्येक भ्रूण को एक कुएं में मार्गदर्शन करने के लिए एक हेयर लूप का उपयोग करें और धीरे से उन्हें स्थिति में रखें ताकि रुचि का लक्षित सेल माइक्रोनीडल के सही कोण पर हो। रुचि के वंश के अग्रदूत सेल की पहचान करने के लिए जेनोपस लेविस ऊतक भाग्य मानचित्रों का पालन करें। भ्रूण के आसपास के विटेलिन झिल्ली को धीरे से हटाने के लिए दो तेज बल का उपयोग करें।बल का उपयोग करके मैन्युअल विच्छेदन द्वारा भ्रूण से एकल कोशिकाओं को अलग करें। वंश अनुरेखक समाधान युक्त इंजेक्शन सुई स्थापित करके शुरू करें। माइक्रोइंजेक्शन सुई को एक मल्टी-एक्सिस माइक्रो मैनिपुलेटर द्वारा नियंत्रित माइक्रो पिपेट होल्डर में माउंट करें।माइक्रो पिपेट धारक को माइक्रो इंजेक्टर से कनेक्ट करें और नकारात्मक दबाव लगाकर वंशावली ट्रेसर के साथ सुई भरें। सुई को कैलिब्रेट करें और खनिज तेल में मापा गया वंश ट्रेसर समाधान के लगभग एक नैनोलीटर वितरित करने के लिए सुई टिप और इंजेक्शन समय के आकार को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन दिया जा रहा ड्रॉपलेट आकार सटीक है और यदि आवश्यक हो तो इंजेक्टर सेटिंग्स को समायोजित करें।माइक्रोइंजेक्शन क्ले डिश को 3% एफसीएएल समाधान के साथ भरें और ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके लगभग 10 भ्रूण को मिट्टी के पकवान में स्थानांतरित करें। फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के लगभग एक नैनोलीटर या जीएफपी एमआरएनए के 200 पिकोग्राम के साथ रुचि की कोशिकाओं को इंजेक्ट करें। स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सेल लेबलिंग की सफलता की पुष्टि करें।सुनिश्चित करें कि केवल इच्छित सेल इंजेक्शन दिया गया है। संस्थागत नीतियों का पालन करते हुए घायल या गलत तरीके से लेबल वाली कोशिकाओं वाले भ्रूण को छोड़ दें। इंजेक्शन वाले भ्रूण को 0.5x स्टाइनबर्ग समाधान युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।उन्हें 14 से 25 डिग्री सेल्सियस के बीच कल्चर करें जब तक कि वे वांछित विकास चरण तक नहीं पहुंच जाते। सूक्ष्म विच्छेदन के लिए 0.2x स्टीनबर्ग समाधान युक्त एगर डिश में तीन से पांच भ्रूण स्थानांतरित करें। भ्रूण से लेबल किए गए क्लोन को विच्छेदित करने के लिए बल का उपयोग करें।0.5 से 10 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ विच्छेदित ऊतक एकत्र करें और उन्हें माइक्रो सेंट्रीफ्यूज फ़ाइल में जमा करें। एक पिपेट का उपयोग करके, एचआरएमएस विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए नमूने में लवण को सीमित करने के लिए एकत्रित ऊतक के आसपास के मीडिया को उत्तेजित करें। नमूना शीशी को सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन पर रखकर पृथक कोशिकाओं को तुरंत फ्रीज करें।मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण तक नमूनों को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे स्टोर करें। सीई द्वारा एकल कोशिका नमूना प्रसंस्करण के लिए, नमूने को लगभग 15 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके प्रोटीन को डिनेचर करें। फिर नमूने को पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बराबर करें और पाचन के लिए नमूनों में ट्रिप्सिन जोड़ें।नैनोएलसी द्वारा विश्लेषण के लिए, लाइसिस बफर के 50 माइक्रोलीटर में पांच विच्छेदित ऊतकों को शामिल करें। नमूने को ऊपर और नीचे पाइप करके प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाएं। विच्छेदित ऊतकों को संसाधित करने के लिए, लाइसेट को 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।फिर 4,500 आरसीएफ पर सेंट्रिफिकेशन द्वारा सेल मलबे और जर्दी प्लेटलेट्स को चार डिग्री सेल्सियस पर पेलेट करें। सुपरनैटेंट को एक स्वच्छ माइक्रो सेंट्रीफ्यूज शीशी में स्थानांतरित करें और लाइसेट में 1% एसडीएस की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10% एसडीएस जोड़ें। ऊतकों के लिए, लगभग 25 मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए लाइसेट में 0.5 मोलर डिथियोथ्रेइटोल जोड़ें।फिर प्रोटीन में डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को रासायनिक रूप से कम करने के लिए लाइसेट को 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। लाइसेट में लगभग 75 मिलीमोलर की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए 0.5 मोलर आयोडोसेटामाइड जोड़ें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर मिश्रण को 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। क्षारीकरण प्रतिक्रिया से शेष अभिकारकों को बुझाने के लिए प्रारंभिक मात्रा के समान 0.5 मोलर डिथियोथ्रेइटोल जोड़ें।टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित एसीटोन में प्रोटीन को रात भर अवक्षेपित करें और 0.5 मोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट में पुनर्गठित करें। नमूना पाचन के लिए ट्रिप्सिन जोड़ें और शीशियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सीई का उपयोग करके पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए, नमूना विलायक के एक से दो माइक्रोलीटर में पचने वाले प्रोटीन का पुनर्गठन करें।10,000 आरसीएफ पर मिश्रित नमूना और सेंट्रीफ्यूशन को चार डिग्री सेल्सियस पर दो मिनट के लिए पेलेट सेल मलबे में बदल दिया जाता है। बीजीई के साथ सीई केशिका को फ्लश करके सीई-ईएसआई उपकरण को शुरू करें। नमूना शीशी में नमूने के एक माइक्रोलीटर रखें और हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन द्वारा सीई पृथक्करण केशिका में नमूने के एक से 10 नैनोलीटर इंजेक्ट करें।सीई पृथक्करण केशिका के इनलेट छोर को बीजीई में स्थानांतरित करें। पृथ्वी की जमीन से सीई पृथक्करण वोल्टेज को धीरे-धीरे बढ़ाकर इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण शुरू करें। 10 माइक्रो एम्पीयर से नीचे की धारा के साथ 20 से 28 किलोवोल्ट की क्षमता विश्लेषण के लिए स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वाद्य प्रदर्शन सुनिश्चित करती है।नैनो एलसी का उपयोग करने के लिए, मोबाइल चरण ए में पेप्टाइड नमूने को फिर से निलंबित करें। नमूने की एकाग्रता और इंजेक्शन की मात्रा उपलब्ध एलसी सिस्टम और कॉलम पर निर्भर करती है। नमूने को एलसी शीशी में स्थानांतरित करें। सी 18 विश्लेषणात्मक कॉलम में पेप्टाइड नमूने के दो माइक्रोग्राम के लिए लगभग 200 नैनोग्राम लोड करें और टेक्स्ट पांडुलिपि में वर्णित ग्रेडिएंट एलिशन का उपयोग करके पेप्टाइड्स को 300 नैनोलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर अलग करें।एक कैमरे का उपयोग करके, इलेक्ट्रो स्प्रे उत्सर्जक के माध्यम से तरल प्रवाह की जांच करें और संभावित लीक के लिए सेटअप का निरीक्षण करें। मास स्पेक्ट्रोमेट्री घटनाओं को प्राप्त करें और पाठ पांडुलिपि में वर्णित पेप्टाइड्स को अनुक्रमित करें। सीई-ईएसआई-एचआरएमएस का उपयोग करके विभिन्न भ्रूणों से विच्छेदित डी 11 कोशिकाओं के बीच जीन ट्रांसलेशनल अंतर का पता लगाया गया था।वंश-लेबल विच्छेदित सेल क्लोन का विश्लेषण एलसी-एचआरएमएस द्वारा किया गया था। प्रोटीन के पाथवे विश्लेषण ने न्यूरोएक्टोडर्म के साथ स्पेमन के आयोजक में अनियमित प्रोटीन अनुवाद और ऊर्जा चयापचय दिखाया। न्यूरोएक्टोडर्म प्रोड्यूम को सेल में प्रोटीन कार्गो के परमाणु परिवहन से जुड़े प्रोटीन में समृद्ध किया गया था, जो सिग्नलिंग के बाद डाउनस्ट्रीम घटनाओं का संकेत देता है।आणविक कार्यों के संवर्धन विश्लेषण ने प्रोटियासम कॉम्प्लेक्स के अनुवाद दीक्षा, आरएनए बाइंडिंग और बाइंडिंग में अपरेग्यूलेशन का संकेत दिया, जो स्पेमन के आयोजक को विकसित करने वाले गतिशील प्रोटीन टर्नओवर के लिए एक भूमिका का सुझाव देता है। प्रजनन क्षमता और परिणाम व्याख्या में सुधार के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए केवल रूढ़िवादी भ्रूण का चयन करें। विच्छेदित ऊतक को एक शीशी में स्थानांतरित किया जाना चाहिए और बफर लवण से संदूषण को कम करने के लिए जितना संभव हो उतना न्यूनतम मीडिया बफर युक्त तुरंत जम जाना चाहिए।इस दृष्टिकोण ने हमें जीवित भ्रूण में पहचाने गए कोशिकाओं और कोशिका वंशों में प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन करने में सक्षम बनाया है। विकासशील ऊतकों में महत्वपूर्ण प्रोटीन के स्थानिक अस्थायी उत्पादन पर हमने जो नई जानकारी प्राप्त की है, उसने हमें उनके जैविक कार्य का आकलन करने के लिए लक्षित प्रयोगों को डिजाइन करने में सक्षम बनाया है।

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

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