Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
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Siamo grati a Jie Li (University of Maryland, College Park) per le preziose discussioni sulla dissociazione embrionale e sulla FACS. Ringraziamo Vi M. Quach e Camille Lombard-Banek per l'assistenza nella preparazione dei campioni e nella raccolta dei dati in studi precedenti che esemplificano le applicazioni proteomiche evidenziate in questo protocollo. Parti di questo lavoro sono state sostenute dalla National Science Foundation con il numero di premio IOS-1832968 CAREER (a P.N.), dal National Institutes of Health con il numero di premio R35GM124755 (a P.N.), dall'Università del Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (a P.N.) e dai premi di ricerca della COSMOS Club Foundation (ad A.B.B. e L.R.P.).

Tutti i protocolli che garantiscono il mantenimento e la manipolazione umana delle rane adulte di Xenopus laevis sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Maryland, College Park (numeri di approvazione R-DEC-17-57 e R-FEB-21-07).
1. Preparare le soluzioni
<ol><li>Per l'embriologia<ol><li>Preparare 1x, 0,5x e 0,2x la soluzione di Steinberg (SS), quindi sterilizzarli in autoclave (120 °C per 20 min) fin...

Questo protocollo consente la caratterizzazione dell'espressione proteica in linee cellulari identificate in embrioni della specie Xenopus . Derivando dalla HRMS, la metodologia combina una squisita specificità nell'identificazione molecolare, capacità di rilevamento multi-proteina senza sonde molecolari (di solito centinaia o migliaia di proteine diverse) e una capacità di quantificazione. L'adattabilità agli strumenti e ai flussi di lavoro classici nella (neuro)biologia cellulare e dello sviluppo espande l...

La nostra comprensione della differenziazione cellulare e della genesi di tessuti e organi è il risultato di decenni di elaborati screening mirati di geni e dei loro prodotti. Aumentare la nostra conoscenza di tutte le biomolecole e delle loro quantità durante importanti eventi cellulari aiuterebbe a svelare i meccanismi molecolari che controllano il modello spaziale e temporale del piano corporeo dei vertebrati. Le tecnologie che consentono l'amplificazione molecolare e il sequenziamento sono ora in grado di riferire regolarmente su un gran numero di geni e trascrizioni, supportando studi basati su ipotesi nella ricerca biologica e traslazionale di base. Per comprendere i sistemi in via di sviluppo, una complessa relazione tra trascrizione e traduzione sostiene l'analisi diretta di più proteine e le loro modificazioni post-traduzionali. La proteomica globale che utilizza sistemi biologici in vitro, come le cellule staminali pluripotenti indotte, ha iniziato a delineare i meccanismi di induzione tissutale 1,2. Negli organismi complessi, come l'embrione vertebrato, lo sviluppo si basa su gradienti morfogeni nel contesto dello spazio e del tempo3. Ne consegue che acquisire conoscenze sui cambiamenti proteomici man mano che le cellule si differenziano per formare tessuti specializzati, come i tessuti neurali, offre una chiave per sbloccare programmi molecolari che controllano lo sviluppo normale e difettoso e guidare le terapie di prossima generazione.
La rana artigliata sudafricana vertebrata (Xenopus laevis) è un modello consolidato nella biologia cellulare e dello sviluppo, neuro e rigenerativa. Il Premio Nobel 2012 per la Fisiologia ola Medicina 4,5 di Sir John Gurdon per la scoperta della pluripotenza del nucleo somatico ha evidenziato l'importanza di questo modello per le scoperte negli studi di base e traslazionali. Gli embrioni di Xenopus si sviluppano esternamente alla madre, facilitando così la manipolazione diretta delle cellule, dei cloni cellulari e dell'espressione genica nelle varie fasi di sviluppo. La pigmentazione asimmetrica e le divisioni cellulari stereotipate hanno permesso di tracciare mappe del destino riproducibili dall'embrione a 7,8 e 16-6e 32 cellule. Per la proteomica basata sulla spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS), ulteriori vantaggi del modello includono dimensioni relativamente grandi (~ 1 mm di diametro), che producono un abbondante contenuto proteico per l'analisi (~ 130 μg negli embrioni in fase di scissione precoce, ~ 10 μg di contenuto proteico in singole cellule dell'embrione a 16 cellule)9,10.
Attualmente, HRMS è la tecnologia leader di scelta per la rilevazione delle proteine. Questa tecnologia consente il rilevamento e la quantificazione diretti, sensibili e specifici di proteine multiple, di solito da centinaia a migliaia di proteine diverse11. La proteomica bottom-up di HRMS comporta una serie di passaggi interconnessi. Dopo l'estrazione dal campione di cellula/tessuto, le proteine vengono digerite con un enzima proteolitico, come la tripsina (proteomica bottom-up). I peptidi risultanti vengono separati in base alle loro diverse proprietà fisico-chimiche, tra cui idrofobicità (cromatografia liquida a fase inversa, LC), carica netta (cromatografia a scambio ionico), dimensioni (cromatografia di esclusione dimensionale) o mobilità elettroforetica (elettroforesi capillare, CE). I peptidi vengono quindi caricati (ionizzati), tipicamente utilizzando la ionizzazione elettrospray (ESI), e gli ioni peptide vengono rilevati e sequenziati tramite frammentazione in fase gassosa mediante HRMS tandem. I dati peptidici risultanti sono mappati sul proteoma dell'organismo studiato. Con l'intensità del segnale dello ione peptidico specifica per proteine (proteotipica) correlata alla concentrazione, la quantificazione delle proteine può essere eseguita senza etichetta o basata sull'etichetta (quantificazione multiplexing). La proteomica HRMS fornisce una ricca risorsa di informazioni sullo stato molecolare del sistema in studio, consentendo la generazione di ipotesi e studi funzionali di follow-up.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Figura 1: Proteomica spaziotemporalmente scalabile che consente la proteomica HRMS guidata dalla linea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana). (A) Visualizzazione del campione (1) utilizzando uno stereomicroscopio (2) per l'iniezione di una cellula identificata (inserto), utilizzando una micropipetta fabbricata (3) sotto controllo da uno stadio di traslazione (4). (B) Campionamento subcellulare della cellula D11 sinistra identificata in un embrione a 16 cellule. (C) Dissezione di un'intera cellula D11 da un embrione a 16 cellule. (D) Tracciamento fluorescente (verde) delle progenie D111 sinistra e destra da un embrione a 32 cellule per guidare la dissezione dell'ectoderma neurale (NE) nella gastrula (stadio 10) e l'isolamento del tessuto discendente dal girino mediante FACS. Barre della scala: 200 μm per gli embrioni, 1,25 mm per la fiala. Le figure sono state adattate con il permesso dei riferimenti 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Il protocollo qui presentato consente la quantificazione basata su HRMS di un gran numero di proteine in cellule/tessuti identificati nello sviluppo di embrioni di X. laevis. L'approccio si basa su un'accurata identificazione cellulare, mappe del destino cellulare riproducibili e metodologie consolidate per tracciare le linee cellulari in questo modello biologico 6,7,8. Come mostrato nella Figura 1, studiamo i proteomi da singole cellule impiegando la dissezione dell'intera cellula o il microcampionamento capillare per aspirare il contenuto cellulare. Il monitoraggio del lignaggio di una cellula ci permette di studiare l'evoluzione spaziotemporale del proteoma quando le cellule formano i tessuti durante la gastrulazione. La progenie cellulare è marcata in modo fluorescente iniettando un fluoroforo coniugato a destrano inerte o mRNA per proteine fluorescenti (ad esempio, proteina fluorescente verde o GFP). La progenie marcata è isolata nei punti temporali di sviluppo desiderati. Durante la gastrulazione, i cloni cellulari che sono strettamente raggruppati possono essere isolati per dissezione. Dopo la gastrulazione, i cloni cellulari possono essere distribuiti all'interno dell'embrione a causa di movimenti migratori e possono essere isolati dai tessuti dissociati mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Le proteine in queste cellule e tessuti sono misurate tramite proteomica bottom-up che impiega HPLC o CE per la separazione e HRMS tandem ESI per l'identificazione. La proteomica HRMS guidata dalla linea cellulare è scalabile a diverse dimensioni cellulari e linee cellulari all'interno dell'embrione ed è specifica, sensibile e quantitativa. Attraverso esempi selezionati mostrati qui, dimostriamo anche che questo protocollo è scalabile e ampiamente adattabile a diversi tipi di cellule e linee cellulari.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Figura 2: Il flusso di lavoro bioanalitico. Micro-dissezione e aspirazione capillare, o FACS ha facilitato il campionamento del contenuto proteico cellulare e clonale. Deplezione delle abbondanti proteine del tuorlo e separazione mediante elettroforesi capillare (CE) o cromatografia liquida a nanoflusso (LC) con sensibilità di identificazione migliorata (ID) mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) a ionizzazione elettrospray (ESI). La quantificazione ha rivelato la disregolazione, fornendo nuove informazioni per studi basati su ipotesi in combinazione con le informazioni disponibili dall'ontologia genica (GO). Le cifre sono state adattate con il permesso del riferimento15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

La caratterizzazione degli eventi molecolari quando le cellule danno origine a tessuti e organi aumenta il potenziale per comprendere meglio lo sviluppo normale e progettare rimedi efficaci per le malattie. Le tecnologie che consentono l'identificazione e la quantificazione accurate di diversi tipi e di un gran numero di proteine fornirebbero informazioni ancora mancanti sui meccanismi molecolari che orchestrano lo sviluppo di tessuti e organismi nello spazio e nel tempo. Qui, presentiamo un protocollo basato sulla spettrometria di massa che consente la misurazione di migliaia di proteine in linee cellulari identificate in embrioni di Xenopus laevis (rana). L'approccio si basa su mappe riproducibili del destino cellulare e metodi consolidati per identificare, etichettare, tracciare e campionare in modo fluorescente le cellule e la loro progenie (cloni) da questo modello di sviluppo dei vertebrati. Dopo aver raccolto il contenuto cellulare utilizzando il microcampionamento o isolando le cellule mediante dissezione o selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, le proteine vengono estratte e processate per l'analisi proteomica bottom-up. La cromatografia liquida e l'elettroforesi capillare vengono utilizzate per fornire una separazione scalabile per il rilevamento e la quantificazione delle proteine con spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS). Vengono forniti esempi rappresentativi per la caratterizzazione proteomica delle cellule adipose del tessuto neurale. La proteomica HRMS guidata dalla linea cellulare è adattabile a diversi tessuti e organismi. È sufficientemente sensibile, specifico e quantitativo per scrutare le dinamiche spazio-temporali del proteoma durante lo sviluppo dei vertebrati.

Questo protocollo ha permesso lo studio delle proteine nelle singole cellule e dei loro lignaggi mentre stabiliscono i tessuti negli embrioni di X. laevis. La Figura 1 illustra una di queste applicazioni dell'approccio per studiare le proteine nelle cellule fatali del tessuto neurale e l'ectoderma neurale appena indotto nell'embrione. Come mostrato nella Figura 1A, il flusso di lavoro bioanalitico ha integrato gli strumenti tradizionali della biologia c...

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Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .

Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Questo approccio guidato dal lignaggio consente l'analisi proteomica di importanti eventi di sviluppo con risoluzione spaziale e temporale all'interno dell'embrione vertebrato impartendo informazioni che non sarebbero accessibili attraverso misurazioni dell'intero embrione. Questo approccio può essere facilmente esteso allo studio di proteine, metaboliti e trascritti da diverse cellule embrionali mentre si differenziano durante lo sviluppo. Questo metodo può far progredire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari che controllano lo sviluppo normale e della malattia, compresi i meccanismi di induzione dei tessuti e l'impegno del destino cellulare durante lo sviluppo iniziale.Utilizzare un cappio per guidare ogni embrione in un pozzetto e posizionarli delicatamente in modo che la cellula di interesse mirata sia ad angolo retto rispetto al microago. Seguire le mappe del destino dei tessuti di xenopus laevis per identificare la cellula precursore del lignaggio di interesse. Utilizzare due pinze per affilare per rimuovere delicatamente la membrana vitellina che circonda l'embrione.Isolare le singole cellule dall'embrione mediante dissezione manuale usando una pinza. Iniziare impostando l'ago per iniezione contenente la soluzione tracciante della linea. Montare l'ago per microiniezione in un portapipette controllato da un micromanipolatore multiasse.Collegare il supporto per micropipette a un microiniettore e riempire l'ago con il tracciante di lignaggio applicando una pressione negativa. Calibrare l'ago e regolare le dimensioni della punta dell'ago e il tempo di iniezione per erogare circa un nanolitro della soluzione tracciante della linea misurata in olio minerale. Assicurarsi che la dimensione della goccia iniettata sia accurata e regolare le impostazioni dell'iniettore, se necessario.Inondare il piatto di argilla per microiniezione con una soluzione al 3% fCAL e trasferire circa 10 embrioni nel piatto di argilla utilizzando una pipetta di trasferimento. Iniettare le cellule di interesse con circa un nanolitro di destrano fluorescente o 200 picogrammi di mRNA GFP. Utilizzando un microscopio stereo, confermare il successo dell'etichettatura cellulare.Assicurarsi che venga iniettata solo la cellula desiderata. Scartare gli embrioni contenenti cellule danneggiate o etichettate in modo errato seguendo le politiche istituzionali. Trasferire gli embrioni iniettati in una capsula di Petri contenente 0,5 volte la soluzione di Steinberg.Coltivali tra 14 e 25 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato. Trasferire da tre a cinque embrioni in un piatto di agar contenente 0,2 volte la soluzione di Steinberg per micro dissezioni. Utilizzare una pinza per sezionare il clone etichettato dall'embrione.Raccogliere il tessuto sezionato con una pipetta da 0,5 a 10 microlitri e depositarli in una microcentrifuga. Utilizzando una pipetta, aspirare il mezzo che circonda il tessuto raccolto per limitare i sali nel campione per evitare interferenze con l'analisi HRMS. Congelare immediatamente le cellule isolate ponendo il flaconcino del campione su ghiaccio secco o azoto liquido.Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi della spettrometria di massa. Per l'elaborazione di campioni a singola cellula mediante CE, denaturare le proteine riscaldando il campione a 60 gradi Celsius per circa 15 minuti. Quindi equilibrare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti e aggiungere tripsina ai campioni per la digestione.Per l'analisi mediante NanoLC, lisare fino a cinque tessuti sezionati in 50 microlitri di tampone di lisi. Facilitare il processo pipettando il campione su e giù. Per elaborare i tessuti sezionati, incubare il lisato a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Quindi pellettare i detriti cellulari e le piastrine di tuorlo a quattro gradi Celsius mediante centrificazione a 4.500 RCF. Trasferire il surnatante in un flaconcino di microcentrifuga pulito e aggiungere il 10% di SDS per ottenere una concentrazione finale dell'1% di SDS nel lisato. Per i tessuti, aggiungere 0,5 molari ditiotreitolo al lisato per ottenere una concentrazione finale di circa 25 millimolari.Quindi incubare il lisato per 30 minuti a 60 gradi Celsius per ridurre chimicamente i legami disolfuro nelle proteine. Aggiungere iodoacetammide 0,5 molari per ottenere la concentrazione finale di circa 75 millimolari nel lisato e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Aggiungere 0,5 molari ditiotreitolo come il volume iniziale per estinguere i reagenti rimanenti dalla reazione di alchilazione.Precipitare le proteine in acetone durante la notte come descritto nel protocollo testuale e ricostituirle in bicarbonato di ammonio 0,5 molari. Aggiungere tripsina per la digestione del campione e incubare le fiale a 37 gradi Celsius. Per separare i peptidi utilizzando CE, ricostituire la proteina digerita in uno o due microlitri del solvente campione.Vortice il campione misto e centrifusione a 10.000 RCF per due minuti a quattro gradi Celsius per pellet detriti cellulari. Inizializzare lo strumento CE-ESI lavando il capillare CE con il BGE. Inserire un microlitro di campione nel flaconcino del campione e iniettare da uno a 10 nanolitri del campione nel capillare di separazione CE mediante iniezione idrodinamica.Trasferire l'estremità di ingresso del capillare di separazione CE nel BGE. Avviare la separazione elettroforetica aumentando gradualmente la tensione di separazione CE dalla terra a terra. Potenziali da 20 a 28 kilovolt con una corrente inferiore a 10 microampere garantiscono prestazioni strumentali stabili e riproducibili per l'analisi.Per separare utilizzando Nano LC, risospendere il campione peptidico nella fase mobile A.La concentrazione e il volume di iniezione del campione dipendono dal sistema LC e dalla colonna disponibili. Trasferire il campione in un flaconcino LC. Caricare circa 200 nanogrammi a due microgrammi di campione peptidico nella colonna analitica C18 e separare i peptidi a una velocità di flusso di 300 nanolitri al minuto utilizzando l'eluizione del gradiente come descritto nel manoscritto di testo.Utilizzando una telecamera, controllare il flusso di liquido attraverso l'emettitore di elettrospray e ispezionare visivamente la configurazione per eventuali perdite. Acquisire eventi di spettrometria di massa e sequenziare i peptidi come descritto nel manoscritto testuale. Sono state rilevate differenze di traslazione genica tra cellule D11 sezionate da diversi embrioni utilizzando CE-ESI-HRMS.I cloni cellulari sezionati marcati con lignaggio sono stati analizzati da LC-HRMS. L'analisi del percorso delle proteine ha mostrato una traduzione proteica e un metabolismo energetico sovraregolati nell'organizzatore di Spemann con il neuroectoderma. Il neuroectoderma prodeo è stato arricchito in proteine associate al trasporto nucleare del carico proteico nella cellula, probabilmente indicando eventi a valle dopo la segnalazione.L'analisi di arricchimento delle funzioni molecolari ha indicato una sovraregolazione nell'inizio della traduzione, nel legame dell'RNA e nel legame del complesso del proteasoma, suggerendo un ruolo per il turnover proteico dinamico nello sviluppo dell'organizzatore di Spemann. Selezionare solo embrioni stereotipati per questo protocollo per migliorare la riproducibilità e l'interpretazione dei risultati. Il tessuto sezionato deve essere trasferito in un flaconcino e immediatamente congelato contenente il minor tampone possibile per ridurre al minimo la contaminazione da sali tampone.Questo approccio ci ha permesso di studiare la dinamica delle proteine nelle cellule identificate e nelle linee cellulari negli embrioni vivi. Le nuove informazioni che abbiamo ottenuto sulla produzione spazio-temporale di importanti proteine nei tessuti in via di sviluppo ci hanno permesso di progettare esperimenti mirati per valutare la loro funzione biologica.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Ricerca

Chimica

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolomica non mirati da fonti biologiche Uso UltraPerformance cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Un Materiali guidata approccio di screening per lo sviluppo di sol-gel quantitative derivate microarray di proteine

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualizzazione di ambiente spettrometria di massa con l&#39;uso della fotografia Schlieren

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosione dell'imaging nell'interfaccia Metal-Paint con spettrometria di massa ionica secondaria a tempo di volo

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...