Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
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胚の解離とFACSに関する貴重な議論をしてくれたJie Li(メリーランド大学カレッジパーク校)に感謝します。Vi M. QuachとCamille Lombard-Banekには、このプロトコルで強調されているプロテオミクスアプリケーションを例示する以前の研究におけるサンプル調製とデータ収集を支援していただき、感謝します。この研究の一部は、国立科学財団(賞番号IOS-1832968 CAREER)(P.N.)、国立衛生研究所(賞番号R35GM124755)(P.N.)、メリーランド大学-国立がん研究所パートナーシッププログラム(P.N.)、およびCOSMOSクラブ財団研究賞(A.B.B.およびL.R.P.)によって支援されました。

アフリカツメガエルの成体のカエルの人道的な維持と取り扱いを保証するすべてのプロトコルは、メリーランド大学カレッジパーク校の施設動物管理および使用委員会によって承認されました(承認番号R-DEC-17-57およびR-FEB-21-07)。
1.ソリューションを準備します
<ol><li>発生学用<ol><li>1x、0.5x、および0.2x Steinberg溶液(SS)を調製し、標準プロトコル<sup class="...

このプロトコルにより、 アフリカツメガエル 種の胚における同定された細胞系譜におけるタンパク質発現の特性評価が可能になります。HRMSに由来するこの方法論は、分子同定における絶妙な特異性、分子プローブ(通常は数百から数千の異なるタンパク質)を使用しないマルチタンパク質検出能力、および定量能力を兼ね備えています。細胞および発生(神経)生物学における古典的なツ...

細胞分化と組織や臓器の起源に関する私たちの理解は、遺伝子とその産物の何十年にもわたる精巧な標的スクリーニングの結果です。重要な細胞イベント中のすべての生体分子とその量に関する知識を増やすことは、脊椎動物のボディプランの空間的および時間的パターンを制御する分子メカニズムを解明するのに役立ちます。分子増幅とシーケンシングを可能にする技術は、現在、多数の遺伝子と転写物について日常的に報告できるようになり、基礎生物学およびトランスレーショナル研究における仮説主導の研究をサポートしています。発達中のシステムを理解するために、転写と翻訳の間の複雑な関係は、複数のタンパク質とその翻訳後修飾の直接分析を提唱しています。人工多能性幹細胞などのin vitro生物学的システムを使用したグローバルプロテオミクスは、組織誘導のメカニズムを描写し始めました1,2。脊椎動物の胚のような複雑な生物では、発生は空間と時間の文脈でモルフォゲン勾配に依存しています3。したがって、細胞が分化して神経組織などの特殊な組織を形成する際のプロテオミクス変化の知識を得ることは、正常および欠陥のある発生を制御する分子プログラムを解き放ち、次世代の治療法を導くための鍵を提供します。
脊椎動物の南アフリカのツメガエル(アフリカツメガエル)は、細胞および発生、神経、および再生生物学において確立されたモデルです。体細胞核の多能性の発見に対するジョン・ガードン卿の2012年ノーベル生理学・医学賞4,5は、基礎研究およびトランスレーショナル研究における発見のためのこのモデルの重要性を強調しました。アフリカツメガエル胚は母親の外部で発生するため、さまざまな発生段階にわたる細胞、細胞クローン、および遺伝子発現の直接操作が容易になります。非対称色素沈着とステレオタイプの細胞分裂により、16-6および32細胞の7,8段階の胚からの再現可能な運命マップのチャート作成が可能になりました。高分解能質量分析(HRMS)ベースのプロテオミクスでは、比較的大きなサイズ(直径~1 mm)で、分析用の豊富なタンパク質含有量が得られる(初期卵割段階の胚では~130 μg、16細胞胚の単一細胞では~10 μgのタンパク質含有量)9,10。
現在、HRMSはタンパク質の検出に最適な最先端の技術です。この技術により、複数の、通常は数百から数千の異なるタンパク質の直接的、高感度、特異的な検出と定量が可能になります11。HRMSによるボトムアッププロテオミクスには、相互に関連する一連のステップが含まれます。細胞/組織サンプルからの抽出後、タンパク質はトリプシン(ボトムアッププロテオミクス)などのタンパク質分解酵素で消化されます。得られたペプチドは、疎水性(逆相液体クロマトグラフィー、LC)、正味電荷(イオン交換クロマトグラフィー)、サイズ(サイズ排除クロマトグラフィー)、または電気泳動移動度(キャピラリー電気泳動、CE)など、さまざまな物理化学的特性に基づいて分離されます。次に、通常はエレクトロスプレーイオン化(ESI)を使用してペプチドを荷電(イオン化)し、タンデムHRMSによる気相フラグメンテーションを介してペプチドイオンを検出および配列決定します。得られたペプチドデータは、研究されている生物のプロテオームにマッピングされます。タンパク質特異的(プロテオタイプ)ペプチドイオンシグナル強度は濃度と相関するため、タンパク質定量は、ラベルフリーまたはラベルベース(マルチプレックス定量)で行うことができます。HRMSプロテオミクスは、研究中のシステムの分子状態に関する豊富な情報リソースを生成し、仮説の生成とフォローアップ機能研究を可能にします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> 図1:発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイドHRMSプロテオミクスを可能にする時空間的にスケーラブルなプロテオミクス。 (a)標本の可視化(1)を実体顕微鏡を用いて(2)同定した細胞(挿入図)を注入し、作製したマイクロピペット(3)を翻訳段階(4)により制御する。(b)16細胞胚における同定された左D11細胞の細胞内サンプリング。(C)16細胞胚からのD11細胞全体の解剖。(D)原腸内の神経外胚葉(NE)の解剖(ステージ10)をガイドするための、32細胞胚からの左右のD111子孫の蛍光(緑色)追跡、およびFACSを使用したオタマジャクシから子孫組織の分離。スケールバー:胚の場合は200 μm、バイアルの場合は1.25 mm。図は参考文献15,19,21,59の許可を得て翻案した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここで紹介するプロトコルは、発生中のX. laevis胚で同定された細胞/組織中の多数のタンパク質のHRMSベースの定量を可能にします。このアプローチは、正確な細胞同定、再現性のある細胞運命マップ、およびこの生物学的モデルで細胞系譜を追跡するための確立された方法論に基づいています6,7,8。図1に示すように、全細胞解剖またはキャピラリーマイクロサンプリングを使用して細胞含有量を吸引することにより、単一細胞からのプロテオームを研究します。細胞の系統を監視することで、原腸形成中に細胞が組織を形成する際のプロテオームの時空間進化を研究することができます。細胞子孫は、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質、またはGFP)のために不活性デキストランまたはmRNAに結合した蛍光色素を注入することによって蛍光的にマークされる。標識された子孫は、所望の発生時点で単離される。原腸形成中に、密集した細胞クローンは解剖によって単離され得る。原腸形成後、細胞クローンは移動運動のために胚内に分布し、蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって解離組織から単離することができます。これらの細胞および組織中のタンパク質は、分離にHPLCまたはCEを使用し、同定にESIタンデムHRMSを使用するボトムアッププロテオミクスを介して測定されます。細胞系譜ガイド下HRMSプロテオミクスは、胚内のさまざまな細胞サイズと系統に拡張可能であり、特異的、高感度、定量的です。ここに示すいくつかの例を通じて、このプロトコルがスケーラブルであり、さまざまな種類の細胞や細胞系譜に広く適応できることも示しています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> 図2:バイオ分析ワークフロー。 微小解剖および毛細血管吸引、またはFACSは、細胞およびクローンタンパク質含有量のサンプリングを容易にしました。豊富な卵黄タンパク質の枯渇とキャピラリー電気泳動(CE)またはナノフロー液体クロマトグラフィー(LC)による分離により、エレクトロスプレーイオン化(ESI)高分解能質量分析(HRMS)を使用した同定(ID)感度が向上しました。定量化により、制御不全が明らかになり、遺伝子オントロジー(GO)から入手可能な情報と組み合わせて、仮説主導の研究に新しい情報を提供しました。図は参考文献15の許可を得て翻案した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

細胞が組織や臓器を生じさせるときの分子事象の特性評価は、正常な発達をよりよく理解し、病気の効率的な治療法を設計する可能性を高めます。多様な種類と多数のタンパク質の正確な同定と定量を可能にする技術は、空間と時間における組織と生物の発達を調整する分子メカニズムに関するまだ不足している情報を提供します。ここでは、 アフリカツメガ エル(カエル)胚の同定された細胞系譜における数千のタンパク質の測定を可能にする質量分析ベースのプロトコルを紹介します。このアプローチは、再現性のある細胞運命マップと確立された方法に基づいて構築されており、脊椎動物の発生のこのモデルから細胞とその子孫(クローン)を識別、蛍光標識、追跡、およびサンプリングします。マイクロサンプリングまたは解剖または蛍光活性化細胞ソーティングによる細胞単離を使用して細胞内容物を収集した後、タンパク質を抽出し、ボトムアッププロテオミクス解析のために処理します。液体クロマトグラフィーとキャピラリー電気泳動は、高分解能質量分析(HRMS)によるタンパク質の検出と定量のためのスケーラブルな分離を提供するために使用されます。神経組織運命細胞のプロテオミクス特性評価のための代表的な例が提供されています。細胞系譜ガイド下HRMSプロテオミクスは、さまざまな組織や生物に適応できます。脊椎動物の発生中のプロテオームの時空間ダイナミクスを覗き込むのに十分な感度、特異性、定量性を備えています。

このプロトコルにより、X. laevis胚の組織を確立する際の単一細胞とその系統のタンパク質の研究が可能になりました。図1は、神経組織運命細胞および胚の新たに誘導された神経外胚葉におけるタンパク質を研究するためのアプローチのそのような応用の1つを示しています。図1Aに示すように、バイオアナリシスワークフローは、細胞および...

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Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

ここでは、脊椎動物 アフリカツメガエル 胚における既知の組織運命を有する細胞系譜の質量分析ベースのプロテオミクス特性評価について述べる。

発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイド質量分析プロテオミクス

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

この系統誘導アプローチにより、脊椎動物の胚内の空間的および時間的分解能で重要な発生イベントのプロテオミクス解析が可能になり、全胚測定ではアクセスできない情報が得られます。このアプローチは、発生中に分化するさまざまな胚細胞からのタンパク質、代謝物、転写産物を研究するために容易に拡張できます。この方法は、発生初期における組織誘導や細胞運命関与のメカニズムなど、正常および疾患の発生を制御する分子メカニズムの理解を深めることができます。ヘアループを使用して各胚をウェルに導き、目的のターゲット細胞がマイクロニードルに対して直角になるようにゆっくりと配置します。アフリカツメガエルの組織運命マップに従って、目的の系統の前駆細胞を特定します。2つの鋭利な鉗子を使用して、胚を囲む卵子膜をそっと取り除きます。鉗子を用いた手動解剖によって胚から単一細胞を単離する。系統トレーサー溶液を含む注射針をセットアップすることから始めます。マイクロインジェクションニードルを多軸マイクロマニピュレータで制御されるマイクロピペットホルダーに取り付けます。マイクロピペットホルダーをマイクロインジェクターに接続し、負圧を加えて針に系統トレーサーを充填します。針を校正し、針先のサイズと注入時間を調整して、鉱油で測定された約1ナノリットルの系統トレーサー溶液を供給します。注入する液滴サイズが正確であることを確認し、必要に応じてインジェクターの設定を調整します。マイクロインジェクション粘土皿に3%fCAL溶液を浸し、トランスファーピペットを使用して約10個の胚を粘土皿に移します。目的の細胞に約1ナノリットルの蛍光デキストランまたは200ピコグラムのGFP mRNAを注入します。実体顕微鏡を用いて、細胞標識の成功を確認します。目的のセルのみが注入されていることを確認してください。損傷した細胞や誤ってラベル付けされた細胞を含む胚は、施設の方針に従って廃棄してください。注入した胚を0.5倍のスタインバーグ溶液を含むシャーレに移します。希望の発達段階に達するまで、摂氏14度から25度の間で培養します。3〜5個の胚を、微小解剖用の0.2倍のスタインバーグ溶液を含む寒天ディッシュに移します。鉗子を使用して、標識されたクローンを胚から解剖します。解剖した組織を0.5〜10マイクロリットルのピペットで収集し、マイクロ遠心分離機ファイルに堆積させます。ピペットを使用して、採取した組織を取り囲む媒体を吸引し、サンプル中の塩分を制限し、HRMS分析への干渉を回避します。サンプルバイアルをドライアイスまたは液体窒素の上に置いて、単離した細胞を直ちに凍結します。質量分析までマイナス80°Cでサンプルを保管してください。CEによるシングルセルサンプル処理では、サンプルを摂氏60度に約15分間加熱してタンパク質を変性させます。次に、サンプルを室温に5分間平衡化し、消化のためにサンプルにトリプシンを加えます。NanoLCによる分析のために、50マイクロリットルの溶解バッファーで最大5つの解剖組織を溶解します。サンプルを上下にピペッティングすることで、プロセスを容易にします。解剖した組織を処理するには、ライセートを摂氏4度で10分間インキュベートします。次に、4, 500 RCFで濃縮することにより、摂氏4度で細胞破片と卵黄血小板をペレット化します。上清を清潔なマイクロ遠心バイアルに移し、10%SDSを加えて、ライセート中の最終濃度1%SDSを取得します。組織の場合、0.5モルのジチオスレイトールをライセートに加えて、約25ミリモルの最終濃度を取得します。次に、ライセートを摂氏60度で30分間インキュベートして、タンパク質のジスルフィド結合を化学的に還元します。0.5モルのヨードアセトアミドを加えて、ライセート中の最終濃度約75ミリモルを取得し、暗所で室温で15分間インキュベートします。初期容量と同じ0.5モルのジチオスレイトールを加えて、アルキル化反応から残っている反応物をクエンチします。テキストプロトコルに記載されているように、アセトン中で一晩タンパク質を沈殿させ、0.5モルの重炭酸アンモニウムで再構成します。サンプル消化のためにトリプシンを加え、バイアルを摂氏37度でインキュベートします。CEを使用してペプチドを分離するには、1〜2マイクロリットルのサンプル溶媒で消化したタンパク質を再構成します。混合サンプルをボルテックスし、摂氏4度で2分間10, 000 RCFで遠心分離して、細胞破片をペレット化します。CEキャピラリーをBGEでフラッシュして、CE-ESI機器を初期化します。1マイクロリットルのサンプルをサンプルバイアルに入れ、1〜10ナノリットルのサンプルを流体力学的注入によってCE分離キャピラリーに注入します。CE分離キャピラリーの入口端をBGEに移します。アースグランドからCE分離電圧を徐々に上昇させて電気泳動分離を開始します。20〜28キロボルトの電位と10マイクロアンペア未満の電流は、分析のための安定した再現性のある機器性能を保証します。Nano LCを使用して分離するには、ペプチドサンプルを移動相に再懸濁します A.サンプルの濃度と注入量は、利用可能なLCシステムとカラムによって異なります。サンプルをLCバイアルに移します。約200ナノグラムから2マイクログラムのペプチドサンプルをC18分析カラムにロードし、テキスト原稿に記載されているようにグラジエント溶出を使用して毎分300ナノリットルの流速でペプチドを分離します。カメラを使用して、エレクトロスプレーエミッターを通る液体の流れを確認し、漏れの可能性がないかセットアップを視覚的に検査します。質量分析イベントを取得し、テキスト原稿に記載されているようにペプチドを配列決定します。遺伝子翻訳の違いは、CE-ESI-HRMSを使用して異なる胚から解剖されたD11細胞間で検出されました。系統標識された解剖細胞クローンをLC-HRMSにより解析した。タンパク質の経路解析は、神経外胚葉を用いたSpemannのオーガナイザーにおけるアップレギュレーションされたタンパク質翻訳およびエネルギー代謝を示した。神経外胚葉プロデウムは、細胞内のタンパク質貨物の核輸送に関連するタンパク質に富んでおり、シグナル伝達後の下流イベントを示している可能性があります。分子機能の濃縮解析は、翻訳開始、RNA結合、およびプロテアソーム複合体の結合におけるアップレギュレーションを示し、Spemannのオーガナイザーを発達させる動的タンパク質代謝回転の役割を示唆しています。このプロトコルでは、再現性と結果の解釈を改善するために、ステレオタイプの胚のみを選択してください。解剖した組織はバイアルに移し、緩衝塩による汚染を最小限に抑えるために、できるだけ最小限の培地バッファーを含む直ちに凍結する必要があります。このアプローチにより、同定された細胞におけるタンパク質動態と生きた胚の細胞系譜を研究することができました。発生組織における重要なタンパク質の空間的時間的生産に関する新しい情報により、それらの生物学的機能を評価するための標的実験を設計することができました。

Research

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Chemistry

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Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

シュリーレン写真の使用とアンビエント質量分析の可視化

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...