Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

배아 해리 및 FACS에 대한 귀중한 토론을 해주신 Jie Li (University of Maryland, College Park)에게 감사드립니다. 이 프로토콜에서 강조된 단백질체학 응용 분야를 예시하는 이전 연구에서 샘플 준비 및 데이터 수집에 도움을 준 Vi M. Quach와 Camille Lombard-Banek에게 감사드립니다. 이 연구의 일부는 수상 번호 IOS-1832968 CAREER(PN으로), 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 수상 번호 R35GM124755(PN), 메릴랜드 대학교-국립 암 연구소 파트너십 프로그램(PN) 및 COSMOS Club Foundation 연구 상(ABB 및 LRP)의 지원을 받았습니다.

Xenopus laevis 성체 개구리의 인도적 유지 및 취급을 보장하는 모든 프로토콜은 메릴랜드 대학교 칼리지 파크의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 R-DEC-17-57 및 R-FEB-21-07).
1. 솔루션 준비
<ol><li>발생학의 경우<ol><li>1x, 0.5x 및 0.2x Steinberg's solution(SS)을 준비한 다음 표준 프로토콜 12에 따라 멸균(120분 동안120°C)하여 ?...

이 프로토콜은 Xenopus 종의 배아에서 확인된 세포 계통에서 단백질 발현의 특성화를 가능하게 합니다. HRMS에서 비롯된 이 방법론은 분자 식별의 정교한 특이성, 분자 프로브 없이 다중 단백질 검출 기능(일반적으로 수백에서 수천 개의 서로 다른 단백질) 및 정량 기능을 결합합니다. 세포 및 발달 (신경) 생물학의 고전적인 도구 및 워크플로우에 대한 적응성은 척추동물 X. laevis 배아에?...

세포 분화와 조직 및 기관의 기원에 대한 우리의 이해는 수십 년 동안 유전자와 그 산물에 대한 정교한 표적 스크리닝의 결과입니다. 중요한 세포 사건 동안 모든 생체 분자와 그 양에 대한 지식을 늘리면 척추 동물 신체 계획의 공간적 및 시간적 패턴을 제어하는 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 분자 증폭 및 시퀀싱을 가능하게 하는 기술은 이제 많은 수의 유전자와 전사체에 대해 일상적으로 보고할 수 있어 기초 생물학 및 중개 연구에서 가설 기반 연구를 지원합니다. 개발 중인 시스템을 이해하기 위해 전사와 번역 간의 복잡한 관계는 여러 단백질의 직접 분석과 번역 후 변형을 지지합니다. 유도만능줄기세포와 같은 시험관 내 생물학적 시스템을 사용하는 글로벌 단백질체학은 조직 유도 1,2의 메커니즘을 설명하기 시작했습니다. 척추동물 배아와 같은 복잡한 유기체에서 발달은 공간과 시간의 맥락에서 모르포겐 구배에 의존한다3. 따라서 세포가 분화하여 신경 조직과 같은 특수 조직을 형성함에 따라 단백질체학적 변화에 대한 지식을 얻는 것은 정상 및 결함 발달을 제어하는 분자 프로그램을 잠금 해제하고 차세대 치료법을 안내하는 열쇠를 제공합니다.
척추동물 남아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)는 세포 및 발달, 신경 및 재생 생물학에서 잘 확립된 모델입니다. 체세포의 다능성 발견에 대한 John Gurdon 경의 2012년 노벨 생리의학상 4,5는 기초 및 중개 연구의 발견에 대한 이 모델의 중요성을 강조했습니다. Xenopus 배아는 모체 외부에서 발달하여 다양한 발달 단계에서 세포, 세포 클론 및 유전자 발현의 직접적인 조작을 용이하게 합니다. 비대칭 색소 침착과 고정 관념의 세포 분열은 16-6 및 32 세포 7,8 단계 배아에서 재현 가능한 운명지도의 차트를 가능하게했습니다. 고분해능 질량분석법(HRMS) 기반 단백질체학의 경우, 이 모델의 추가적인 장점은 분석을 위한 풍부한 단백질 함량을 산출하는 비교적 큰 크기(직경 ~1mm)를 포함합니다(초기 절단 단계 배아에서 ~130μg, 16세포 배아의 단일 세포에서 ~10μg의 단백질 함량)9,10.
현재 HRMS는 단백질 검출을 위한 선도적인 기술입니다. 이 기술은 일반적으로 수백에서 수천 개의 서로 다른 단백질을 직접적이고 민감하며 특이적으로 검출하고 정량화할 수 있게 한다11. HRMS에 의한 상향식 단백질체학은 일련의 상호 연결된 단계를 포함합니다. 세포/조직 샘플에서 추출한 후 단백질은 트립신(상향식 단백질체학)과 같은 단백질 분해 효소로 분해됩니다. 생성된 펩타이드는 소수성(reversed-phase liquid chromatography, LC), 순 전하(ion-exchange chromatography), 크기(size exclusion chromatography) 또는 전기영동 이동도(capillary electrophoresis, CE)를 포함한 다양한 물리화학적 특성에 따라 분리됩니다. 그런 다음 펩타이드는 일반적으로 전기분무 이온화(ESI)를 사용하여 충전(이온화)되며, 탠덤 HRMS에 의한 기체상 단편화를 통해 펩타이드 이온이 검출 및 시퀀싱됩니다. 결과 펩타이드 데이터는 연구 중인 유기체의 프로테옴에 매핑됩니다. 농도와 상관관계가 있는 단백질 특이적(proteotypic) 펩타이드 이온 신호 강도를 이용하여, 단백질 정량화는 비표지 또는 표지 기반(multiplexing quantitation)으로 수행될 수 있다. HRMS 단백질체학은 연구 중인 시스템의 분자 상태에 대한 풍부한 정보 리소스를 제공하여 가설 생성 및 후속 기능 연구를 가능하게 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> 그림 1: 발달 중인 (개구리) 배아에서 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학을 가능하게 하는 시공간적으로 확장 가능한 단백질체학. (A) 평행 전단 (4)에 의해 제어되는 제작된 마이크로피펫 (3)을 사용하여 확인된 세포(삽입물)의 주입을 위한 실체현미경(2)을 이용한 표본 (1)의 가시화. (B) 16-세포 배아에서 확인된 왼쪽D11 세포의 세포하 샘플링. (C) 16-세포 배아로부터 전체D11 세포의 해부. (D) 32세포 배아에서 왼쪽 및 오른쪽 D111 자손의 형광(녹색) 추적으로 위스트룰라에서 신경 외배엽(NE)의 해부(10단계) 및 FACS를 사용하여 올챙이에서 자손 조직 분리를 안내합니다. 스케일 바: 배아의 경우 200μm, 바이알의 경우 1.25mm. 수치는 참고 문헌 15,19,21,59의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
여기에 제시된 프로토콜은 발달 중인 X. laevis 배아에서 확인된 세포/조직에서 많은 수의 단백질에 대한 HRMS 기반 정량화를 가능하게 합니다. 이 접근법은 정확한 세포 식별, 재현 가능한 세포 운명 지도 및 이 생물학적 모델 6,7,8에서 세포 계통을 추적하기 위한 확립된 방법론을 기반으로 합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 우리는 세포 내용물을 흡인하기 위해 전체 세포 해부 또는 모세관 마이크로 샘플링을 사용하여 단일 세포에서 프로테옴을 연구합니다. 세포의 혈통을 모니터링하면 세포가 위장 중에 조직을 형성함에 따라 프로테옴의 시공간 진화를 연구할 수 있습니다. 세포 자손은 형광 단백질(예: 녹색 형광 단백질 또는 GFP)에 대해 불활성 덱스트란 또는 mRNA에 접합된 형광단을 주입하여 형광을 표시합니다. 표지된 자손은 원하는 발달 시점에서 분리됩니다. gastrulation 동안, 단단히 클러스터링된 세포 클론은 해부에 의해 분리될 수 있습니다. 위축 후, 세포 클론은 이동 운동으로 인해 배아 내에 분포할 수 있으며 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 해리된 조직에서 분리될 수 있습니다. 이러한 세포 및 조직의 단백질은 분리를 위해 HPLC 또는 CE를 사용하고 식별을 위해 ESI 탠덤 HRMS를 사용하는 상향식 단백질체학을 통해 측정됩니다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 배아 내에서 다양한 세포 크기와 계통으로 확장 가능하며 특이적이고 민감하며 정량적입니다. 여기에 표시된 선별된 예를 통해 이 프로토콜이 다양한 유형의 세포 및 세포 계통에 확장 가능하고 광범위하게 적응할 수 있음을 보여줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> 그림 2: 바이오분석 워크플로우. 미세 해부 및 모세관 흡인 또는 FACS는 세포 및 클론 단백질 함량의 샘플링을 용이하게 했습니다. 풍부한 난황 단백질의 고갈 및 모세관 전기영동(CE) 또는 나노 유동 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 분리는 전기분무 이온화(ESI) 고분해능 질량분석법(HRMS)을 사용하여 식별(ID) 감도를 향상시킵니다. 정량화는 유전자 온톨로지(GO)에서 사용할 수 있는 정보와 함께 가설 기반 연구를 위한 새로운 정보를 제공하는 조절 장애를 드러냈습니다. 수치는 참고 문헌15의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

세포가 조직과 기관을 생성함에 따라 분자 사건의 특성화는 정상적인 발달을 더 잘 이해하고 질병에 대한 효율적인 치료법을 설계할 수 있는 잠재력을 높입니다. 다양한 유형과 많은 수의 단백질을 정확하게 식별하고 정량화할 수 있는 기술은 공간과 시간에서 조직과 유기체 발달을 조율하는 분자 메커니즘에 대한 정보를 여전히 제공하지 못할 것입니다. 여기에서 우리는 Xenopus laevis (개구리) 배아에서 확인된 세포 계통에서 수천 개의 단백질을 측정할 수 있는 질량 분석 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 재현 가능한 세포-운명 지도와 이 척추동물 발달 모델에서 세포와 그 자손(클론)을 식별, 형광 표지, 추적 및 샘플링하는 확립된 방법을 기반으로 합니다. 마이크로 샘플링을 사용하여 세포 내용물을 수집하거나 해부 또는 형광 활성화 세포 분류를 통해 세포를 분리한 후 단백질을 추출하고 처리하여 상향식 단백질체학 분석을 수행합니다. 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기영동은 고분해능 질량분석법(HRMS)을 통해 단백질 검출 및 정량화를 위한 확장 가능한 분리를 제공하는 데 사용됩니다. 대표적인 예가 신경-조직 운명 세포의 프로테오믹 특성화에 대해 제공된다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 다양한 조직과 유기체에 적용할 수 있습니다. 척추동물 발달 동안 프로테옴의 시공간적 역학을 들여다보기에 충분히 민감하고 구체적이며 정량적입니다.

이 프로토콜은 단일 세포에서 단백질과 X. laevis 배아에서 조직을 확립할 때 그 계통에 대한 연구를 가능하게 했습니다. 그림 1은 신경-조직 운명 세포와 배아에서 새로 유도된 신경 외배엽에서 단백질을 연구하기 위한 접근 방식의 이러한 적용 중 하나를 보여줍니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이 생물 분석 워크플로는 세포를 식별, 주입/흡인하고 표...

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Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

여기에서 우리는 척추동물 Xenopus laevis 배아에서 알려진 조직 운명을 가진 세포 계통의 질량 분석 기반 단백질체 특성 분석을 설명합니다.

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

이 계통 유도 접근 방식은 척추동물 배아 내의 공간적 및 시간적 분해능을 통해 중요한 발달 사건의 단백질체 분석을 가능하게 하여 전체 배아 측정을 통해 접근할 수 없는 정보를 전달합니다. 이 접근법은 발달 중에 분화되는 다양한 배아 세포의 단백질, 대사 산물 및 전사체를 연구하기 위해 쉽게 확장될 수 있습니다. 이 방법은 초기 발달 동안 조직 유도 및 세포 운명 헌신 메커니즘을 포함하여 정상 및 질병 발달을 제어하는 분자 메커니즘에 대한 이해를 높일 수 있습니다.헤어 루프를 사용하여 각 배아를 우물로 안내하고 관심 대상 세포가 마이크로니들과 직각이 되도록 부드럽게 배치합니다. xenopus laevis 조직 운명 지도를 따라 관심 계통의 전구체 세포를 식별합니다. 두 개의 날카로운 집게를 사용하여 배아를 둘러싼 vitelline 막을 부드럽게 제거합니다.집게를 사용하여 수동 해부로 배아에서 단일 세포를 분리합니다. 먼저 계보 추적 용액이 들어 있는 주사 바늘을 설정합니다. 미세 주입 바늘을 다축 마이크로 매니퓰레이터로 제어되는 마이크로 피펫 홀더에 장착합니다.마이크로 피펫 홀더를 마이크로 인젝터에 연결하고 부압을 가하여 리니지 트레이서로 바늘을 채웁니다. 바늘을 보정하고 바늘 끝의 크기와 주입 시간을 조정하여 미네랄 오일에서 측정된 약 1나노리터의 계보 추적 용액을 전달합니다. 주입되는 액적 크기가 정확한지 확인하고 필요한 경우 인젝터 설정을 조정합니다.미세주입 점토 접시에 3%fCAL 용액을 채우고 이식 피펫을 사용하여 약 10개의 배아를 점토 접시에 옮깁니다. 관심 세포에 약 1나노리터의 형광 덱스트란 또는 200피코그램의 GFP mRNA를 주입합니다. 실체 현미경을 사용하여 세포 라벨링의 성공 여부를 확인합니다.의도한 세포만 주입되었는지 확인합니다. 손상되었거나 잘못 라벨링된 세포가 포함된 배아는 제도적 정책에 따라 폐기합니다. 주입된 배아를 0.5x Steinberg 용액이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.원하는 발달 단계에 도달할 때까지 섭씨 14도에서 25도 사이에서 배양하십시오. 3-5개의 배아를 미세 해부를 위해 0.2x Steinberg 용액이 들어 있는 한천 접시에 옮깁니다. 집게를 사용하여 배아에서 표지된 클론을 해부합니다.0.5-10 마이크로 리터 피펫으로 해부 된 조직을 수집하여 마이크로 원심 분리기 파일에 넣습니다. 피펫을 사용하여 수집된 조직을 둘러싼 배지를 흡인하여 HRMS 분석에 방해가 되지 않도록 시료의 염분을 제한합니다. 샘플 바이알을 드라이아이스 또는 액체 질소에 올려 놓아 분리된 세포를 즉시 동결합니다.질량 분석 분석이 있을 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. CE에 의한 단일 세포 샘플 처리의 경우 샘플을 약 15분 동안 섭씨 60도로 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 5분 동안 평형화하고 소화를 위해 샘플에 트립신을 첨가합니다.NanoLC에 의한 분석을 위해 50마이크로리터의 용해 완충액에서 최대 5개의 해부된 조직을 용해합니다. 시료를 위아래로 피펫팅하여 공정을 용이하게 합니다. 해부된 조직을 처리하기 위해 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.그런 다음 세포 파편과 노른자 혈소판을 섭씨 4도에서 4, 500 RCF에서 중심화하여 펠릿화합니다. 상청액을 깨끗한 마이크로 원심분리기 바이알에 옮기고 10% SDS를 첨가하여 용해물에서 1% SDS의 최종 농도를 얻습니다. 조직의 경우 용해물에 0.5몰 디티오트레이톨을 첨가하여 약 25밀리몰의 최종 농도를 얻습니다.그런 다음 용해물을 섭씨 60도에서 30분 동안 배양하여 단백질의 이황화 결합을 화학적으로 감소시킵니다. 0.5몰 요오도아세트아미드를 첨가하여 용해물에 약 75밀리몰의 최종 농도를 얻고 혼합물을 실온에서 암실에서 15분 동안 인큐베이션합니다. 초기 부피와 동일한 0.5 몰의 디티오트레이톨을 첨가하여 알킬화 반응에서 남은 반응물을 소멸시킵니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하룻밤 동안 아세톤에 단백질을 침전시키고 0.5몰 중탄산암모늄으로 재구성합니다. 시료 분해를 위해 트립신을 첨가하고 바이알을 섭씨 37도에서 배양합니다. CE를 사용하여 펩타이드를 분리하기 위해, 1 내지 2 마이크로리터의 샘플 용매에서 분해된 단백질을 재구성한다.혼합된 샘플을 섭씨 4도에서 2분 동안 10, 000 RCF에서 원심 융합하여 세포 파편을 펠렛화합니다. CE 모세관을 BGE로 세척하여 CE-ESI 기기를 초기화합니다. 1 마이크로 리터의 샘플을 샘플 바이알에 넣고 유체 역학 주입에 의해 1-10 나노 리터의 샘플을 CE 분리 모세관에 주입합니다.CE 분리 모세관의 입구 끝을 BGE로 옮깁니다. 접지에서 CE 분리 전압을 점진적으로 램핑하여 전기 영동 분리를 시작합니다. 10 마이크로 암페어 미만의 전류에서 20 - 28 킬로볼트의 전위는 분석을 위한 안정적이고 재현 가능한 기기 성능을 보장합니다.Nano LC를 사용하여 분리하려면 이동상 A.The 샘플의 농도와 주입 부피가 사용 가능한 LC 시스템 및 컬럼에 따라 달라지므로 펩타이드 샘플을 다시 중단합니다. 샘플을 LC 바이알에 옮깁니다. 약 200 나노그램에서 2 마이크로 그램의 펩타이드 샘플을 C18 분석 컬럼에로드하고 텍스트 원고에 설명 된대로 그래디언트 용출을 사용하여 분당 300 나노 리터의 유속으로 펩타이드를 분리합니다.카메라를 사용하여 전기 스프레이 방출기를 통한 액체 흐름을 확인하고 누출 가능성이 있는지 설정을 육안으로 검사합니다. 질량 분석 이벤트를 획득하고 텍스트 원고에 설명된 대로 펩타이드를 시퀀싱합니다. CE-ESI-HRMS를 사용하여 상이한 배아에서 해부된 D11 세포 간에 유전자 번역 차이가 검출되었습니다.계통-표지된 해부된 세포 클론을 LC-HRMS에 의해 분석하였다. 단백질의 경로 분석은 신경외배엽이 있는 Spemann의 조직자에서 상향 조절된 단백질 번역 및 에너지 대사를 보여주었습니다. 신경 외배엽 prodeum은 세포 내 단백질 화물의 핵 수송과 관련된 단백질이 풍부했으며, 이는 신호 전달 후 다운스트림 사건을 나타낼 가능성이 있습니다.분자 기능의 농축 분석은 번역 개시, RNA 결합 및 프로테아좀 복합체의 결합에서 상향 조절을 나타내었으며, 이는 Spemann의 조직자를 개발하는 동적 단백질 회전율에 대한 역할을 시사합니다. 이 프로토콜에 대해 고정형 배아만 선택하여 재현성과 결과 해석을 개선합니다. 해부된 조직은 바이알에 옮겨 완충액염으로 인한 오염을 최소화하기 위해 가능한 한 최소한의 배지 완충액을 함유한 즉시 냉동해야 합니다.이 접근법을 통해 우리는 확인된 세포의 단백질 역학과 살아있는 배아의 세포 계통을 연구할 수 있었습니다. 발달 중인 조직에서 중요한 단백질의 공간적 시간 생산에 대해 얻은 새로운 정보를 통해 생물학적 기능을 평가하기 위한 표적 실험을 설계할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

연구

화학

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

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양 졸 - 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이 개발을위한 안내 자료 심사 방식

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Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

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