Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Мы благодарны Цзе Ли (Университет Мэриленда, Колледж-Парк) за ценные дискуссии об эмбриональной диссоциации и FACS. Мы благодарим Ви М. Куача и Камиллу Ломбард-Банек за помощь в подготовке образцов и сборе данных в предыдущих исследованиях, иллюстрирующих протеомные приложения, выделенные в этом протоколе. Часть этой работы была поддержана Национальным научным фондом под номером награды IOS-1832968 CAREER (для P.N.), Национальными институтами здравоохранения под номером R35GM124755 (для P.N.), Партнерской программой Университета Мэриленда и Национального института рака (для P.N.) и исследовательскими наградами Фонда клуба COSMOS (для ABB и L.R.P.).

Все протоколы, обеспечивающие гуманное содержание и обращение со взрослыми лягушками Xenopus laevis , были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Мэриленда, Колледж-Парк (номера одобрения R-DEC-17-57 и R-FEB-21-07).
1. Подгото?...

Этот протокол позволяет охарактеризовать экспрессию белка в идентифицированных клеточных линиях эмбрионов вида Xenopus . Методология, основанная на HRMS, сочетает в себе исключительную специфичность в молекулярной идентификации, способность к обнаружению нескольких белков без молек...

Наше понимание дифференцировки клеток и генезиса тканей и органов является результатом десятилетий сложных целевых скринингов генов и их продуктов. Расширение наших знаний обо всех биомолекулах и их количествах во время важных клеточных событий поможет разгадать молекулярные механизмы, которые контролируют пространственную и временную структуру плана тела позвоночных. Технологии, обеспечивающие молекулярную амплификацию и секвенирование, теперь могут регулярно сообщать о большом количестве генов и транскриптов, поддерживая исследования, основанные на гипотезах, в фундаментальных биологических и трансляционных исследованиях. Чтобы понять развивающиеся системы, сложная взаимосвязь между транскрипцией и трансляцией требует прямого анализа нескольких белков и их посттрансляционных модификаций. Глобальная протеомика с использованием биологических систем in vitro, таких как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, начала очерчивать механизмы тканевой индукции 1,2. У сложных организмов, таких как эмбрион позвоночных, развитие зависит от градиентов морфогена в контексте пространства и времени3. Из этого следует, что получение знаний о протеомных изменениях по мере того, как клетки дифференцируются с образованием специализированных тканей, таких как нервные ткани, дает ключ к разблокированию молекулярных программ, контролирующих нормальное и дефектное развитие, и направляет терапию следующего поколения.
Позвоночная южноафриканская когтистая лягушка (Xenopus laevis) является хорошо зарекомендовавшей себя моделью в клеточной и развивающейся, нейро- и регенеративной биологии. Нобелевская премия сэра Джона Гердона по физиологии и медицине 2012 года 4,5 за открытие плюрипотентности соматического ядра подчеркнула важность этой модели для открытий в фундаментальных и трансляционных исследованиях. Эмбрионы Xenopus развиваются внешне по отношению к матери, тем самым облегчая прямое манипулирование клетками, клеточными клонами и экспрессией генов на различных стадиях развития. Асимметричная пигментация и стереотипное деление клеток позволили составить карту воспроизводимых карт судьбы 16-6 и 32-клеточногоэмбриона на 7,8 стадии. Для протеомики на основе масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS) дополнительные преимущества модели включают относительно большой размер (~1 мм в диаметре), что дает обильное содержание белка для анализа (~130 мкг у эмбрионов на ранней стадии расщепления, ~10 мкг белка в одиночных клетках 16-клеточного эмбриона)9,10.
В настоящее время HRMS является ведущей технологией выбора для обнаружения белков. Эта технология позволяет прямо, чувствительно и специфически обнаруживать и количественно определять множественные, обычно от сотен до тысяч различныхбелков11. Восходящая протеомика HRMS включает в себя ряд взаимосвязанных этапов. После экстракции из образца клетки / ткани белки перевариваются протеолитическим ферментом, таким как трипсин (восходящая протеомика). Полученные пептиды разделяют на основе их различных физико-химических свойств, включая гидрофобность (обращенно-фазовая жидкостная хроматография, LC), суммарный заряд (ионообменная хроматография), размер (эксклюзионная хроматография) или электрофоретическую подвижность (капиллярный электрофорез, CE). Затем пептиды заряжаются (ионизируются), как правило, с помощью электрораспыления ионизации (ESI), а пептидные ионы обнаруживаются и секвенируются посредством газофазной фрагментации с помощью тандемной HRMS. Полученные пептидные данные сопоставляются с протеомом исследуемого организма. При том, что интенсивность сигнала пептид-ионов специфического белка (протеотипа) коррелирует с концентрацией, количественное определение белка может быть выполнено без меток или на основе меток (мультиплексирующее количественное определение). Протеомика HRMS дает богатый источник информации о молекулярном состоянии исследуемой системы, что позволяет генерировать гипотезы и проводить последующие функциональные исследования.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Рисунок 1: Пространственно-временная масштабируемая протеомика, обеспечивающая протеомику HRMS, управляемую клеточной линией, в развивающемся эмбрионе (лягушке). (A) Визуализация образца (1) с использованием стереомикроскопа (2) для инъекции идентифицированной клетки (врезка) с использованием изготовленной микропипетки (3) под контролем трансляционной стадии (4). (B) Субклеточный отбор идентифицированных левых клеток D11 в 16-клеточном эмбрионе. (C) Рассечение целой клетки D11 из 16-клеточного эмбриона. (D) Флуоресцентное (зеленое) отслеживание левого и правого потомства D111 от 32-клеточного эмбриона для направления рассечения невральной эктодермы (NE) в гаструле (стадия 10) и выделения ткани-потомка от головастика с использованием FACS. Масштабные линейки: 200 мкм для эмбрионов, 1,25 мм для флакона. Рисунки были адаптированы с разрешения ссылок 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Представленный здесь протокол позволяет количественно оценить большое количество белков в идентифицированных клетках/тканях развивающихся эмбрионов X. laevis на основе HRMS. Подход основан на точной идентификации клеток, воспроизводимых картах клеточной судьбы и установленных методологиях отслеживания клеточных линий в этой биологической модели 6,7,8. Как показано на рисунке 1, мы изучаем протеомы из отдельных клеток, используя диссекцию целых клеток или капиллярный микропробоотбор для аспирации клеточного содержимого. Наблюдение за происхождением клетки позволяет нам изучать пространственно-временную эволюцию протеома по мере того, как клетки образуют ткани во время гаструляции. Клеточное потомство флуоресцентно маркируют путем введения флуорофора, конъюгированного с инертным декстраном или мРНК для флуоресцентного белка (например, зеленого флуоресцентного белка или GFP). Меченое потомство изолируют в желаемые моменты развития. Во время гаструляции клоны клеток, которые плотно сгруппированы, могут быть выделены путем рассечения. После гаструляции клеточные клоны могут быть распределены внутри эмбриона за счет миграционных движений и могут быть выделены из диссоциированных тканей с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Белки в этих клетках и тканях измеряются с помощью восходящей протеомики с использованием ВЭЖХ или КЭ для разделения и тандемной HRMS ESI для идентификации. Протеомика HRMS, управляемая клеточными линиями, масштабируется для различных размеров клеток и линий внутри эмбриона и является специфической, чувствительной и количественной. На отдельных примерах, показанных здесь, мы также демонстрируем, что этот протокол является масштабируемым и широко адаптируемым к различным типам клеток и клеточных линий.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Рисунок 2: Биоаналитический рабочий процесс. Микродиссекция и капиллярная аспирация, или FACS, облегчают отбор проб клеточного и клонального белка. Истощение обильных белков желтка и разделение с помощью капиллярного электрофореза (CE) или нанопоточной жидкостной хроматографии (LC) с повышенной чувствительностью идентификации (ID) с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS) с помощью ионизации электрораспылением (ESI). Количественная оценка выявила дисрегуляцию, предоставив новую информацию для исследований, основанных на гипотезах, в сочетании с информацией, доступной из онтологии генов (GO). Рисунки были адаптированы с разрешения ссылки15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

Характеристика молекулярных событий, когда клетки дают начало тканям и органам, повышает потенциал для лучшего понимания нормального развития и разработки эффективных средств от болезней. Технологии, обеспечивающие точную идентификацию и количественную оценку различных типов и большого количества белков, предоставят до сих пор недостающую информацию о молекулярных механизмах, организующих развитие тканей и организмов в пространстве и времени. Здесь мы представляем протокол на основе масс-спектрометрии, который позволяет измерять тысячи белков в идентифицированных клеточных линиях эмбрионов Xenopus laevis (лягушек). Этот подход основан на воспроизводимых картах клеточной судьбы и установленных методах идентификации, флуоресцентной маркировки, отслеживания и отбора образцов клеток и их потомства (клонов) из этой модели развития позвоночных. После сбора клеточного содержимого с помощью микровыборки или выделения клеток путем диссекции или сортировки клеток, активированной флуоресценцией, белки извлекаются и обрабатываются для восходящего протеомного анализа. Жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез используются для обеспечения масштабируемого разделения для обнаружения и количественного определения белка с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS). Приведены репрезентативные примеры протеомной характеристики клеток нервной ткани. Протеомика HRMS, управляемая клеточными линиями, адаптируется к различным тканям и организмам. Он достаточно чувствителен, специфичен и количественный, чтобы заглянуть в пространственно-временную динамику протеома во время развития позвоночных.

Этот протокол позволил изучить белки в отдельных клетках и их линии, поскольку они создают ткани в эмбрионах X. laevis. Рисунок 1 иллюстрирует одно из таких применений подхода к изучению белков в клетках нервной ткани и недавно индуцированной нервной эктодермы у эмбрио...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Здесь мы описываем основанную на масс-спектрометрии протеомную характеристику клеточных линий с известными тканевыми судьбами эмбриона позвоночных Xenopus laevis .

Протеомика масс-спектрометрии под контролем клеточных линий у развивающегося эмбриона (лягушки)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Этот подход, основанный на происхождении, позволяет проводить протеомный анализ важных событий развития с пространственным и временным разрешением в эмбрионе позвоночных, передавая информацию, которая была бы недоступна при измерениях всего эмбриона. Этот подход может быть легко распространен на изучение белков, метаболитов и транскриптов из различных эмбриональных клеток, поскольку они дифференцируются во время развития. Этот метод может продвинуть наше понимание молекулярных механизмов, которые контролируют нормальное развитие и развитие заболевания, включая механизмы индукции тканей и определения судьбы клеток во время раннего развития.Используйте волосяную петлю, чтобы направить каждый эмбрион в лунку, и аккуратно расположите их так, чтобы интересующая клетка находилась под прямым углом к микроигле. Следуйте картам судьбы тканей Xenopus laevis, чтобы идентифицировать клетку-предшественник интересующей линии. Используйте два заостренных щипца, чтобы аккуратно удалить вителлиновую мембрану, окружающую эмбрион.Изолируют отдельные клетки от эмбриона путем ручного вскрытия с помощью щипцов. Начните с установки инъекционной иглы, содержащей раствор индикатора происхождения. Установите иглу для микроинъекций в держатель микропипетки, управляемый многоосевым микроманипулятором.Подсоедините держатель микропипетки к микроинжектору и заполните иглу индикатором происхождения, приложив отрицательное давление. Откалибруйте иглу и отрегулируйте размер наконечника иглы и время впрыска, чтобы доставить примерно один нанолитр раствора индикатора происхождения, измеренного в минеральном масле. Убедитесь, что размер вводимой капли точный, и при необходимости отрегулируйте настройки инжектора.Залейте глиняную чашку для микроинъекций раствором 3%fCAL и перенесите примерно 10 эмбрионов в глиняную форму с помощью пипетки для переноса. Вводите в интересующие клетки примерно один нанолитр флуоресцентного декстрана или 200 пикограмм мРНК GFP. С помощью стереомикроскопа подтвердите успешность маркировки клеток.Убедитесь, что вводится только предполагаемая клетка. Откажитесь от эмбрионов, содержащих поврежденные или неправильно помеченные клетки, в соответствии с институциональной политикой. Перенесите инъецированные эмбрионы в чашку Петри, содержащую 0,5-кратный раствор Штейнберга.Культивируйте их при температуре от 14 до 25 градусов по Цельсию, пока они не достигнут желаемой стадии развития. Перенесите от трех до пяти эмбрионов в чашку с агаром, содержащую 0,2x раствор Штейнберга для микровскрытия. Используйте щипцы, чтобы отделить меченый клон от эмбриона.Соберите рассеченную ткань с помощью пипетки объемом от 0,5 до 10 микролитров и поместите ее в файл для микроцентрифуги. Используя пипетку, аспирируйте среду, окружающую собранную ткань, чтобы ограничить содержание солей в образце, чтобы избежать помех анализу HRMS. Немедленно заморозьте изолированные клетки, поместив флакон с образцом на сухой лед или жидкий азот.Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до масс-спектрометрического анализа. Для обработки образца одной клетки с помощью CE денатурируют белки, нагревая образец до 60 градусов Цельсия в течение примерно 15 минут. Затем уравновесьте образец до комнатной температуры в течение пяти минут и добавьте трипсин в образцы для разложения.Для анализа с помощью NanoLC лизируют до пяти рассеченных тканей в 50 микролитрах лизисного буфера. Облегчите процесс, пипетируя образец вверх и вниз. Чтобы обработать рассеченные ткани, инкубируйте лизат при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.Затем гранулируйте клеточный мусор и желтковые тромбоциты при четырех градусах Цельсия путем центрирования при 4 500 RCF. Перенесите надосадочную жидкость в чистый флакон микроцентрифуги и добавьте 10% SDS, чтобы получить окончательную концентрацию 1% SDS в лизате. Для тканей добавьте 0,5 молярного дитиотреитола к лизату, чтобы получить конечную концентрацию примерно 25 миллимоляров.Затем инкубируйте лизат в течение 30 минут при 60 градусах Цельсия, чтобы химически восстановить дисульфидные связи в белках. Добавьте 0,5 моляра йодоацетамида для получения конечной концентрации примерно 75 миллимоляр в лизате и инкубируйте смесь в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Добавьте 0,5 моляра дитиотреитола так же, как и исходный объем, чтобы погасить реагенты, оставшиеся от реакции алкилирования.Осаждают белки в ацетоне в течение ночи, как описано в текстовом протоколе, и восстанавливают в 0,5 молярного бикарбоната аммония. Добавьте трипсин для разложения образца и инкубируйте флаконы при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы разделить пептиды с помощью КЭ, восстановите белок, расщепленный в одном-двух микролитрах растворителя образца.Встряхните смешанный образец и центрифузию при 10 000 RCF в течение двух минут при четырех градусах Цельсия для гранулирования остатков клеток. Инициализируйте прибор CE-ESI, промыв капилляр CE с помощью BGE. Поместите один микролитр образца во флакон с образцом и введите от одного до 10 нанолитров образца в капилляр разделения CE с помощью гидродинамической инъекции.Перенесите входной конец разделительного капилляра CE в BGE. Начните электрофоретическую сепарацию, постепенно увеличивая напряжение разделения CE от заземления. Потенциалы от 20 до 28 киловольт при токе ниже 10 микроампер обеспечивают стабильную и воспроизводимую инструментальную производительность для анализа.Чтобы разделить с помощью Nano LC, повторно суспендируйте образец пептида в подвижной фазе A. Концентрация образца и объем впрыска зависят от доступной системы LC и колонки. Переложите образец во флакон LC. Загрузите приблизительно 200 нанограммов в два микрограмма пептидного образца в аналитическую колонку C18 и разделите пептиды со скоростью потока 300 нанолитров в минуту с использованием градиентного элюирования, как описано в текстовой рукописи.С помощью камеры проверьте поток жидкости через электрораспылитель и визуально осмотрите установку на предмет возможных утечек. Получите события масс-спектрометрии и секвенируйте пептиды, как описано в текстовой рукописи. Были обнаружены трансляционные различия генов между клетками D11, рассеченными из разных эмбрионов с помощью CE-ESI-HRMS.Меченные линией рассеченные клеточные клоны были проанализированы с помощью LC-HRMS. Анализ путей белков показал повышенную трансляцию белка и энергетический обмен в органайзере Шпемана с нейроэктодермой. Продеум нейроэктодермы был обогащен белками, связанными с ядерным транспортом белкового груза в клетке, что, вероятно, указывает на последующие события после передачи сигналов.Анализ обогащения молекулярных функций показал усиление регуляции инициации трансляции, связывания РНК и связывания протеасомного комплекса, что указывает на роль динамического обновления белка, развивающего организатора Шпемана. Отбирайте только стереотипные эмбрионы для этого протокола, чтобы улучшить воспроизводимость и интерпретацию результатов. Рассеченную ткань следует переложить во флакон и немедленно заморозить, содержа как можно меньше буфера среды, чтобы свести к минимуму загрязнение буферными солями.Этот подход позволил нам изучить динамику белка в идентифицированных клетках и клеточных линиях живых эмбрионов. Новая информация, которую мы получили о пространственно-временной продукции важных белков в развивающихся тканях, позволила нам разработать целевые эксперименты для оценки их биологической функции.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Крупномасштабная Нецелевые Metabolomic профилирование сыворотки Ultra Performance жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Нецелевые Метаболомики из биологических источников Использование UltraPerformance жидкостной хроматографии высокого разрешения масс-спектрометрии (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Guided Скрининг Материалы подхода к разработке количественных полученных золь-гель Microarrays Белки

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Анализируя Динамика белков с использованием водорода валютный масс-спектрометрии

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Секвенирование растений стены Heteroxylans Использование ферментативной, химической (метилирование) и физический (масс-спектрометрия, ядерный магнитный резонанс) Методики

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Визуализация Ambient масс-спектрометрии с использования шлирен Фото

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Рентгенофлуоресцентного капиллярного электрофореза масс-спектрометрии для метаболомики одноклеточных в жить лягушки (Xenopus laevis) эмбрионов