Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
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Agradecemos a Jie Li (Universidad de Maryland, College Park) por sus valiosos debates sobre la disociación embrionaria y el sistema de control de los bienes sobre el terreno. Agradecemos a Vi M. Quach y Camille Lombard-Banek por su ayuda con la preparación de muestras y la recopilación de datos en estudios previos que ejemplifican las aplicaciones proteómicas que se destacan en este protocolo. Partes de este trabajo fueron apoyadas por la National Science Foundation bajo el número de premio IOS-1832968 CAREER (a P.N.), los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R35GM124755 (a P.N.), el Programa de Asociación de la Universidad de Maryland-Instituto Nacional del Cáncer (a P.N.) y los premios de investigación de la Fundación COSMOS Club (a A.B.B. y L.R.P.).

Todos los protocolos que garantizan el mantenimiento y manejo humanitario de las ranas adultas de Xenopus laevis fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Maryland, College Park (números de aprobación R-DEC-17-57 y R-FEB-21-07).
1. Preparar las soluciones
<ol><li>Para embriología<ol><li>Preparar 1x, 0.5x y 0.2x solución de Steinberg (SS), luego autoclavelos (120 °C durante 20 min) para esterilidad siguiendo ...

Este protocolo permite la caracterización de la expresión de proteínas en linajes celulares identificados en embriones de la especie Xenopus. Derivada de HRMS, la metodología combina una especificidad exquisita en la identificación molecular, la capacidad de detección de múltiples proteínas sin sondas moleculares (generalmente cientos a miles de proteínas diferentes) y la capacidad de cuantificación. La adaptabilidad a las herramientas y flujos de trabajo clásicos en biología celular y del desarrollo...

Nuestra comprensión de la diferenciación celular y la génesis de tejidos y órganos es el resultado de décadas de elaboradas pantallas específicas de genes y sus productos. Aumentar nuestro conocimiento de todas las biomoléculas y sus cantidades durante eventos celulares importantes ayudaría a desentrañar los mecanismos moleculares que controlan el patrón espacial y temporal del plan corporal de los vertebrados. Las tecnologías que permiten la amplificación molecular y la secuenciación ahora pueden informar rutinariamente sobre un gran número de genes y transcripciones, apoyando estudios basados en hipótesis en investigación biológica básica y traslacional. Para comprender los sistemas en desarrollo, una relación compleja entre la transcripción y la traducción aboga por el análisis directo de múltiples proteínas y sus modificaciones postraduccionales. La proteómica global utilizando sistemas biológicos in vitro, como células madre pluripotentes inducidas, comenzó a delinear mecanismos de inducción tisular 1,2. En organismos complejos, como el embrión vertebrado, el desarrollo se basa en gradientes morfógenos en el contexto del espacio y el tiempo3. De ello se deduce que obtener conocimiento de los cambios proteómicos a medida que las células se diferencian para formar tejidos especializados, como los tejidos neurales, ofrece una clave para desbloquear programas moleculares que controlan el desarrollo normal y defectuoso y guiar la terapéutica de próxima generación.
La rana vertebrada sudafricana (Xenopus laevis) es un modelo bien establecido en biología celular y del desarrollo, neuro y regenerativa. El Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2012 de Sir John Gurdon por el descubrimiento de la pluripotencia del núcleo somático destacó la importancia de este modelo para los descubrimientos en estudios básicos y traslacionales. Los embriones de Xenopus se desarrollan externamente a la madre, facilitando así la manipulación directa de células, clones celulares y expresión génica en varias etapas de desarrollo. La pigmentación asimétrica y las divisiones celulares estereotipadas permitieron el trazado de mapas de destino reproducibles del embrión de 7,8 células de 16-6 y 32 células. Para la proteómica basada en espectrometría de masas de alta resolución (HRMS), las ventajas adicionales del modelo incluyen un tamaño relativamente grande (~ 1 mm de diámetro), que produce un contenido abundante de proteínas para el análisis (~ 130 μg en embriones en etapa de escisión temprana, ~ 10 μg de contenido de proteína en células individuales del embrión de 16 células)9,10.
En la actualidad, HRMS es la tecnología líder de elección para detectar proteínas. Esta tecnología permite la detección y cuantificación directa, sensible y específica de múltiples, generalmente cientos a miles de proteínas diferentes11. La proteómica ascendente de HRMS implica una serie de pasos interconectados. Después de la extracción de la muestra de célula/tejido, las proteínas se digieren con una enzima proteolítica, como la tripsina (proteómica ascendente). Los péptidos resultantes se separan en función de sus diferentes propiedades fisicoquímicas, incluida la hidrofobicidad (cromatografía líquida de fase inversa, LC), la carga neta (cromatografía de intercambio iónico), el tamaño (cromatografía de exclusión de tamaño) o la movilidad electroforética (electroforesis capilar, CE). Los péptidos se cargan (ionizan), típicamente usando ionización por electrospray (ESI), y los iones peptídicos se detectan y secuencian a través de la fragmentación en fase gaseosa por HRMS en tándem. Los datos peptídicos resultantes se asignan al proteoma del organismo que se está estudiando. Con la intensidad de la señal de iones peptídicos específicos de proteínas (proteotípicos) que se correlacionan con la concentración, la cuantificación de proteínas se puede realizar sin etiqueta o basada en etiquetas (cuantificación de multiplexación). La proteómica HRMS proporciona un rico recurso de información sobre el estado molecular del sistema en estudio, lo que permite la generación de hipótesis y estudios funcionales de seguimiento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Figura 1: Proteómica escalable espaciotemporalmente que permite la proteómica HRMS guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana). (A) Visualización de la muestra (1) utilizando un microscopio estereoscópico (2) para la inyección de una célula identificada (recuadro), utilizando una micropipeta fabricada (3) bajo control por una etapa de traslación (4). (B) Muestreo subcelular de la célula D11 izquierda identificada en un embrión de 16 células. (C) Disección de una célula D11 completa de un embrión de 16 células. (D) Trazado fluorescente (verde) de las progenies D111 izquierda y derecha de un embrión de 32 células para guiar la disección del ectodermo neural (NE) en la gástrula (etapa 10) y el aislamiento del tejido descendente del renacuajo utilizando FACS. Barras de escala: 200 μm para embriones, 1,25 mm para el vial. Las figuras fueron adaptadas con permiso de las referencias 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El protocolo presentado aquí permite la cuantificación basada en HRMS de un gran número de proteínas en células / tejidos identificados en embriones de X. laevis en desarrollo. El enfoque se basa en la identificación precisa de células, mapas de destino celular reproducibles y metodologías establecidas para rastrear linajes celulares en este modelo biológico 6,7,8. Como se muestra en la Figura 1, estudiamos proteomas de células individuales empleando disección de células enteras o micromuestreo capilar para aspirar el contenido celular. El monitoreo del linaje de una célula nos permite estudiar la evolución espacio-temporal del proteoma a medida que las células forman tejidos durante la gastrulación. La progenie celular se marca fluorescentemente inyectando un fluoróforo conjugado con dextrano inerte o ARNm para la proteína fluorescente (por ejemplo, proteína fluorescente verde o GFP). La progenie etiquetada se aísla en los puntos de tiempo de desarrollo deseados. Durante la gastrulación, los clones celulares que están estrechamente agrupados pueden aislarse por disección. Después de la gastrulación, los clones celulares pueden distribuirse dentro del embrión debido a movimientos migratorios y pueden aislarse de tejidos disociados mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las proteínas en estas células y tejidos se miden a través de la proteómica ascendente empleando HPLC o CE para la separación y ESI tándem HRMS para la identificación. La proteómica HRMS guiada por linaje celular es escalable a diferentes tamaños y linajes celulares dentro del embrión y es específica, sensible y cuantitativa. A través de ejemplos seleccionados que se muestran aquí, también demostramos que este protocolo es escalable y ampliamente adaptable a diferentes tipos de células y linajes celulares.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Figura 2: El flujo de trabajo bioanalítico. La microdisección y la aspiración capilar, o FACS, facilitaron el muestreo del contenido de proteínas celulares y clonales. Agotamiento de abundantes proteínas vitelinas y separación por electroforesis capilar (CE) o cromatografía líquida de nanoflujo (LC) mejora la sensibilidad de identificación (ID) utilizando espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) por ionización por electrospray (ESI). La cuantificación reveló desregulación, proporcionando nueva información para estudios basados en hipótesis junto con la información disponible de la ontología génica (GO). Las figuras fueron adaptadas con permiso de la referencia15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

La caracterización de eventos moleculares a medida que las células dan lugar a tejidos y órganos plantea un potencial para comprender mejor el desarrollo normal y diseñar remedios eficientes para las enfermedades. Las tecnologías que permiten la identificación y cuantificación precisas de diversos tipos y un gran número de proteínas proporcionarían información aún faltante sobre los mecanismos moleculares que orquestan el desarrollo de tejidos y organismos en el espacio y el tiempo. Aquí, presentamos un protocolo basado en espectrometría de masas que permite la medición de miles de proteínas en linajes celulares identificados en embriones de Xenopus laevis (rana). El enfoque se basa en mapas reproducibles de destino celular y métodos establecidos para identificar, etiquetar fluorescentemente, rastrear y muestrear células y su progenie (clones) a partir de este modelo de desarrollo de vertebrados. Después de recolectar el contenido celular utilizando micromuestreo o aislar células por disección o clasificación celular activada por fluorescencia, las proteínas se extraen y procesan para el análisis proteómico ascendente. La cromatografía líquida y la electroforesis capilar se utilizan para proporcionar una separación escalable para la detección y cuantificación de proteínas con espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). Se proporcionan ejemplos representativos para la caracterización proteómica de células destinadas al tejido neural. La proteómica HRMS guiada por linaje celular es adaptable a diferentes tejidos y organismos. Es lo suficientemente sensible, específico y cuantitativo para observar la dinámica espacio-temporal del proteoma durante el desarrollo de los vertebrados.

Este protocolo permitió el estudio de proteínas en células individuales y sus linajes a medida que establecen tejidos en embriones de X. laevis. La Figura 1 ilustra una de esas aplicaciones del enfoque para estudiar proteínas en células predestinadas al tejido neural y el ectodermo neural recién inducido en el embrión. Como se muestra en la Figura 1A, el flujo de trabajo bioanalítico integró herramientas tradicionales de biología celular y del...

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Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Aquí describimos una caracterización proteómica basada en espectrometría de masas de linajes celulares con destinos tisulares conocidos en el embrión vertebrado de Xenopus laevis .

Proteómica de espectrometría de masas guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Este enfoque guiado por linaje permite el análisis proteómico de eventos importantes del desarrollo con resolución espacial y temporal dentro del embrión vertebrado impartiendo información que no sería accesible a través de mediciones de embriones completos. Este enfoque se puede extender fácilmente para estudiar proteínas, metabolitos y transcripciones de diferentes células embrionarias a medida que se diferencian durante el desarrollo. Este método puede avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares que controlan el desarrollo normal y de la enfermedad, incluidos los mecanismos de inducción tisular y el compromiso del destino celular durante el desarrollo temprano.Use un lazo de cabello para guiar cada embrión hacia un pozo y colóquelos suavemente para que la célula de interés objetivo esté en el ángulo correcto con la microaguja. Siga los mapas de destino del tejido de xenopus laevis para identificar la célula precursora del linaje de interés. Use dos pinzas de afilado para extraer suavemente la membrana vitelina que rodea el embrión.Aislar las células individuales del embrión mediante disección manual con fórceps. Comience por colocar la aguja de inyección que contiene la solución trazadora de linaje. Monte la aguja de microinyección en un soporte de micropipeta controlado por un micromanipulador multieje.Conecte el soporte de micropipeta a un microinyector y llene la aguja con el trazador de linaje aplicando presión negativa. Calibre la aguja y ajuste el tamaño de la punta de la aguja y el tiempo de inyección para entregar aproximadamente un nanolitro de la solución trazadora de linaje medida en aceite mineral. Asegúrese de que el tamaño de la gota que se inyecta sea preciso y ajuste la configuración del inyector si es necesario.Inundar el plato de arcilla de microinyección con una solución de fCAL al 3% y transferir aproximadamente 10 embriones al plato de arcilla utilizando una pipeta de transferencia. Inyecte las células de interés con aproximadamente un nanolitro del dextrano fluorescente o 200 picogramos de ARNm de GFP. Usando un microscopio estereoscópico, confirme el éxito del etiquetado celular.Asegúrese de que solo se inyecta la celda deseada. Deseche los embriones que contengan células lesionadas o etiquetadas incorrectamente siguiendo las políticas institucionales. Transfiera los embriones inyectados a una placa de Petri que contenga 0,5 veces la solución de Steinberg.Cultivarlos entre 14 y 25 grados centígrados hasta que alcancen la etapa de desarrollo deseada. Transfiera de tres a cinco embriones a una placa de agar que contenga 0,2 veces la solución de Steinberg para microdiciones. Use fórceps para diseccionar el clon marcado del embrión.Recoger el tejido disecado con una pipeta de 0,5 a 10 microlitros y depositarlos en una microcentrífuga. Usando una pipeta, aspire los medios que rodean el tejido recolectado para limitar las sales en la muestra y evitar interferencias con el análisis HRMS. Congelar inmediatamente las células aisladas colocando el vial de muestra sobre hielo seco o nitrógeno líquido.Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta el análisis por espectrometría de masas. Para el procesamiento de muestras de una sola célula por CE, desnaturalice las proteínas calentando la muestra a 60 grados centígrados durante aproximadamente 15 minutos. Luego equilibre la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos y agregue tripsina a las muestras para la digestión.Para el análisis por NanoLC, lisar hasta cinco tejidos disecados en 50 microlitros de tampón de lisis. Facilitar el proceso pipeteando la muestra hacia arriba y hacia abajo. Para procesar los tejidos disecados, incubar el lisado a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Luego pellet los restos celulares y las plaquetas de la yema a cuatro grados centígrados por centrificación a 4, 500 RCF. Transfiera el sobrenadante a un vial de microcentrífuga limpio y agregue 10% SDS para obtener una concentración final de 1% SDS en el lisado. Para los tejidos, agregue 0,5 ditiothreitol molar al lisado para obtener una concentración final de aproximadamente 25 milimolares.Luego incubar el lisado durante 30 minutos a 60 grados centígrados para reducir químicamente los enlaces disulfuro en las proteínas. Añadir 0,5 molares de yodoacetamida para obtener la concentración final de aproximadamente 75 milimolares en el lisado e incubar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Agregue 0.5 ditiothreitol molar igual que el volumen inicial para apagar los reactivos restantes de la reacción de alquilación.Precipitar proteínas en acetona durante la noche como se describe en el protocolo de texto y reconstituir en bicarbonato de amonio 0,5 molares. Agregue tripsina para la digestión de la muestra e incube los viales a 37 grados centígrados. Para separar los péptidos utilizando CE, reconstituya la proteína digerida en uno o dos microlitros del disolvente de muestra.Vortex la muestra mezclada y la centrifusión a 10, 000 RCF durante dos minutos a cuatro grados Celsius a los restos de células de pellets. Inicialice el instrumento CE-ESI enjuagando el capilar CE con el BGE. Coloque un microlitro de muestra en el vial de muestra e inyecte de uno a 10 nanolitros de la muestra en el capilar de separación CE mediante inyección hidrodinámica.Transfiera el extremo de entrada del capilar de separación CE al BGE. Comience la separación electroforética aumentando gradualmente el voltaje de separación CE desde tierra a tierra. Los potenciales de 20 a 28 kilovoltios con una corriente inferior a 10 microamperios garantizan un rendimiento instrumental estable y reproducible para el análisis.Para separar utilizando Nano LC, vuelva a suspender la muestra de péptido en la fase móvil A. La concentración de la muestra y el volumen de inyección dependen del sistema y la columna de LC disponibles. Transfiera la muestra a un vial de LC. Cargue aproximadamente de 200 nanogramos a dos microgramos de muestra de péptido en la columna analítica C18 y separe los péptidos a una velocidad de flujo de 300 nanolitros por minuto utilizando la elución de gradiente como se describe en el texto manuscrito.Con una cámara, verifique el flujo de líquido a través del emisor de electropulverización e inspeccione visualmente la configuración para detectar posibles fugas. Adquirir eventos de espectrometría de masas y secuenciar los péptidos como se describe en el texto manuscrito. Se detectaron diferencias de traducción génica entre las células D11 disecadas de diferentes embriones utilizando CE-ESI-HRMS.Los clones de células disecadas marcadas con linaje fueron analizados por LC-HRMS. El análisis de la vía de las proteínas mostró una traducción de proteínas regulada al alza y el metabolismo energético en el organizador de Spemann con el neuroectodermo. El neuroectodermo prodeum se enriqueció en proteínas asociadas con el transporte nuclear de la carga de proteínas en la célula, lo que probablemente indica eventos aguas abajo después de la señalización.El análisis de enriquecimiento de las funciones moleculares indicó una regulación positiva en la iniciación de la traducción, la unión al ARN y la unión del complejo proteasoma, lo que sugiere un papel para el recambio dinámico de proteínas que desarrolla el organizador de Spemann. Seleccione solo embriones estereotipados para este protocolo para mejorar la reproducibilidad y la interpretación de los resultados. El tejido diseccionado debe transferirse a un vial y congelarse inmediatamente que contenga el mínimo de amortiguador de medios posible para minimizar la contaminación de las sales tampón.Este enfoque nos ha permitido estudiar la dinámica de proteínas en células identificadas y linajes celulares en embriones vivos. La nueva información que hemos obtenido sobre la producción temporal espacial de proteínas importantes en los tejidos en desarrollo nos ha permitido diseñar experimentos específicos para evaluar su función biológica.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Investigación

Química

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

A Materiales guiada criterio de selección para el desarrollo cuantitativas sol-gel microarrays de proteínas derivadas

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

La visualización del ambiente Espectrometría de Masas con el uso de la fotografía Schlieren

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosión por imágenes en la interfaz metal-Paint usando espectrometría de masas de iones secundarios de tiempo de vuelo

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...