Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Jie Li (University of Maryland, College Park) för värdefulla diskussioner om embryonal dissociation och FACS. Vi tackar Vi M. Quach och Camille Lombard-Banek för hjälp med provberedning och datainsamling i tidigare studier som exemplifierar de proteomiska tillämpningar som lyfts fram i detta protokoll. Delar av detta arbete stöddes av National Science Foundation under prisnummer IOS-1832968 KARRIÄR (till P.N.), National Institutes of Health under prisnummer R35GM124755 (till P.N.), University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (till PN) och COSMOS Club Foundation forskningspriser (till A.B.B. och L.R.P.).

Alla protokoll som säkerställer humant underhåll och hantering av Xenopus laevis vuxna grodor godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Maryland, College Park (godkännandenummer R-DEC-17-57 och R-FEB-21-07).
1. Förbered lösningarna
<ol><li>För embryologi<ol><li>Förbered 1x, 0,5x och 0,2x Steinbergs lösning (SS) och autoklavera dem sedan (120 °C i 20 minuter) till sterilitet enligt standardprotokoll12</sup...

Detta protokoll möjliggör karakterisering av proteinuttryck i identifierade cellinjer i embryon av Xenopus-arten. Metoden bygger på HRMS och kombinerar utsökt specificitet i molekylär identifiering, förmåga för multiproteindetektion utan molekylära sonder (vanligtvis hundratals till tusentals olika proteiner) och en förmåga till kvantifiering. Anpassningsförmåga till klassiska verktyg och arbetsflöden inom cell- och utvecklingsbiologi (neuro) utökar HRMS-proteomiken till spännande tillämpningar,...

Vår förståelse av celldifferentiering och uppkomsten av vävnader och organ är resultatet av årtionden av utarbetade riktade skärmar av gener och deras produkter. Att öka vår kunskap om alla biomolekyler och deras kvantiteter under viktiga cellulära händelser skulle hjälpa till att avslöja molekylära mekanismer som styr det rumsliga och tidsmässiga mönstret för ryggradsdjurens kroppsplan. Teknologier som möjliggör molekylär amplifiering och sekvensering kan nu rutinmässigt rapportera om ett stort antal gener och transkript, vilket stöder hypotesdrivna studier inom grundläggande biologisk och translationell forskning. För att förstå utvecklingssystem förespråkar ett komplext förhållande mellan transkription och translation direkt analys av flera proteiner och deras posttranslationella modifieringar. Global proteomik som använder in vitro biologiska system, såsom inducerade pluripotenta stamceller, började avgränsa mekanismer för vävnadsinduktion 1,2. I komplexa organismer, såsom ryggradsdjurens embryo, är utvecklingen beroende av morfogengradienter i samband med rum och tid3. Det följer att få kunskap om proteomiska förändringar när celler differentieras för att bilda specialiserade vävnader, såsom neurala vävnader, erbjuder en nyckel för att låsa upp molekylära program som styr normal och defekt utveckling och vägleda nästa generations terapi.
Den sydafrikanska klogrodan (Xenopus laevis) är en väletablerad modell inom cell- och utvecklings-, neuro- och regenerativ biologi. Sir John Gurdons Nobelpris i fysiologi eller medicin 2012 4,5 för upptäckten av pluripotens hos den somatiska kärnan belyste vikten av denna modell för upptäckter i grundläggande och translationella studier. Xenopus-embryon utvecklas externt till modern, vilket underlättar direkt manipulation av celler, cellkloner och genuttryck över olika utvecklingsstadier. Asymmetrisk pigmentering och stereotypa celldelningar möjliggjorde kartläggning av reproducerbara ödeskartor från 16-6 och 32-celliga 7,8-stegs embryo. För högupplöst masspektrometri (HRMS) baserad proteomik inkluderar ytterligare fördelar med modellen relativt stor storlek (~ 1 mm i diameter), vilket ger rikligt proteininnehåll för analys (~ 130 μg i embryon i tidigt klyvningsstadium, ~ 10 μg proteininnehåll i enskilda celler i 16-cellembryot)9,10.
För närvarande är HRMS den ledande tekniken för att detektera proteiner. Denna teknik möjliggör direkt, känslig och specifik detektion och kvantifiering av flera, vanligtvis hundratusentals olika proteiner11. Bottom-up-proteomik av HRMS innebär en serie sammankopplade steg. Efter extraktion från cell/vävnadsprovet spjälkas proteiner med ett proteolytiskt enzym, såsom trypsin (bottom-up proteomik). De resulterande peptiderna separeras baserat på deras olika fysikalisk-kemiska egenskaper, inklusive hydrofobicitet (vätskekromatografi med omvänd fas, LC), nettoladdning (jonbyteskromatografi), storlek (storleksuteslutningskromatografi) eller elektroforetisk rörlighet (kapillärelektrofores, CE). Peptider laddas sedan (joniseras), vanligtvis med användning av elektrosprayjonisering (ESI), och peptidjoner detekteras och sekvenseras via gasfasfragmentering genom tandem HRMS. De resulterande peptiddata mappas till proteomet hos organismen som studeras. Med proteinspecifik (proteotypisk) peptidjonsignalintensitet korrelerad med koncentration kan proteinkvantifiering utföras etikettfri eller etikettbaserad (multiplexeringskvantifiering). HRMS-proteomik ger en rik resurs av information om det molekylära tillståndet i systemet som studeras, vilket möjliggör generering av hypoteser och uppföljande funktionella studier.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Figur 1: Spatiotemporalt skalbar proteomik som möjliggör cellinjestyrd HRMS-proteomik i det utvecklande (grod) embryot. (A) Visualisering av provet (1) med hjälp av ett stereomikroskop (2) för injektion av en identifierad cell (infälld) med hjälp av en tillverkad mikropipett (3) under kontroll genom ett translationssteg (4). b) Subcellulär provtagning av den identifierade vänstra D11-cellen i ett 16-celligt embryo. c) Dissektion av en hel D11-cell från ett embryo med 16 celler. (D) Fluorescerande (grön) spårning av vänster och höger D111-avkomma från ett 32-celligt embryo för att styra dissektion av neural ektoderm (NE) i gastrula (steg 10) och isolering av den nedstigande vävnaden från grodyngel med hjälp av FACS. Skalstänger: 200 μm för embryon, 1,25 mm för injektionsflaskan. Siffrorna anpassades med tillstånd från referenserna 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Protokollet som presenteras här möjliggör HRMS-baserad kvantifiering av ett stort antal proteiner i identifierade celler/vävnader i utvecklande X. laevis embryon. Tillvägagångssättet bygger på noggrann cellidentifiering, reproducerbara cellödeskartor och etablerade metoder för att spåra cellinjer i denna biologiska modell 6,7,8. Som visas i figur 1 studerar vi proteom från enskilda celler genom att använda helcellsdissektion eller kapillär mikroprovtagning för att aspirera cellulärt innehåll. Övervakning av en cells härstamning gör det möjligt för oss att studera proteomets spatiotemporala utveckling när celler bildar vävnader under gastrulation. Cellavkomman markeras fluorescerande genom att injicera en fluorofor konjugerad till inert dextran eller mRNA för fluorescerande protein (t.ex. grönt fluorescerande protein eller GFP). Den märkta avkomman isoleras vid önskade utvecklingstidpunkter. Under gastrulation kan cellkloner som är tätt grupperade isoleras genom dissektion. Efter gastrulation kan cellkloner distribueras inom embryot på grund av migrationsrörelser och kan isoleras från dissocierade vävnader genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Proteiner i dessa celler och vävnader mäts via bottom-up-proteomik som använder HPLC eller CE för separation och ESI-tandem-HRMS för identifiering. Celllinjestyrd HRMS-proteomik är skalbar till olika cellstorlekar och linjer inom embryot och är specifik, känslig och kvantitativ. Genom utvalda exempel som visas här visar vi också att detta protokoll är skalbart och i stort sett anpassningsbart till olika typer av celler och cellinjer.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Figur 2: Det bioanalytiska arbetsflödet. Mikrodissektion och kapilläraspiration, eller FACS-underlättad provtagning av cellulärt och klonalt proteininnehåll. Utarmning av rikliga äggula proteiner och separation genom kapillärelektrofores (CE) eller nano-flöde vätskekromatografi (LC), förbättrad identifiering (ID) känslighet med hjälp av elektrospray jonisering (ESI) högupplöst masspektrometri (HRMS). Kvantifiering avslöjade dysregulering, vilket gav ny information för hypotesdrivna studier i kombination med information tillgänglig från genontologi (GO). Siffrorna har anpassats med tillstånd från referens15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

Karakterisering av molekylära händelser som celler ger upphov till vävnader och organ ökar en potential att bättre förstå normal utveckling och utforma effektiva botemedel mot sjukdomar. Teknik som möjliggör noggrann identifiering och kvantifiering av olika typer och ett stort antal proteiner skulle ge fortfarande saknad information om molekylära mekanismer som orkestrerar vävnads- och organismutveckling i rum och tid. Här presenterar vi ett masspektrometribaserat protokoll som möjliggör mätning av tusentals proteiner i identifierade cellinjer i Xenopus laevis (groda) embryon. Tillvägagångssättet bygger på reproducerbara cell-ödeskartor och etablerade metoder för att identifiera, fluorescerande etikett, spåra och provceller och deras avkomma (kloner) från denna modell av ryggradsdjurens utveckling. Efter insamling av cellulärt innehåll med hjälp av mikroprovtagning eller isolering av celler genom dissektion eller fluorescensaktiverad cellsortering extraheras proteiner och bearbetas för proteomisk analys nedifrån och upp. Vätskekromatografi och kapillärelektrofores används för att tillhandahålla skalbar separation för proteindetektion och kvantifiering med högupplösande masspektrometri (HRMS). Representativa exempel ges för proteomisk karakterisering av nervvävnadsfatade celler. Celllinjestyrd HRMS-proteomik kan anpassas till olika vävnader och organismer. Det är tillräckligt känsligt, specifikt och kvantitativt för att kika in i proteomets spatio-temporala dynamik under ryggradsdjurens utveckling.

Detta protokoll möjliggjorde studier av proteiner i enskilda celler och deras härstamningar när de etablerar vävnader i X. laevis embryon. Figur 1 illustrerar en sådan tillämpning av metoden att studera proteiner i neuralvävnadsödesdigra celler och den nyligen inducerade neurala ektodermen i embryot. Som visas i figur 1A integrerade det bioanalytiska arbetsflödet traditionella verktyg för cell- och utvecklingsbiologi för att identifiera, inji...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Här beskrivs en masspektrometribaserad proteomisk karakterisering av cellinjer med kända vävnadsöden i ryggradsdjurens Xenopus laevis embryo.

Cell-Lineage guidad masspektrometri proteomik i det utvecklande (groda) embryot

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Detta härstamningsstyrda tillvägagångssätt möjliggör proteomisk analys av viktiga utvecklingshändelser med rumslig och tidsmässig upplösning inom ryggradsdjurens embryo som ger information som inte skulle vara tillgänglig genom hela embryomätningar. Detta tillvägagångssätt kan lätt utvidgas till att studera proteiner, metaboliter och transkript från olika embryonala celler när de differentieras under utvecklingen. Denna metod kan öka vår förståelse av molekylära mekanismer som styr normal och sjukdomsutveckling, inklusive mekanismer för vävnadsinduktion och cellödesengagemang under tidig utveckling.Använd en hårslinga för att styra varje embryo i en brunn och placera dem försiktigt så att den riktade cellen av intresse är i rätt vinkel mot mikronålen. Följ xenopus laevis vävnadens ödeskartor för att identifiera föregångarcellen i släktlinjen av intresse. Använd två vässa pincett för att försiktigt ta bort vitellinmembranet som omger embryot.Isolera de enskilda cellerna från embryot genom manuell dissektion med pincett. Börja med att ställa in injektionsnålen som innehåller spårlösningen. Montera mikroinjektionsnålen i en mikropipetthållare som styrs av en fleraxlig mikromanipulator.Anslut mikropipetthållaren till en mikroinjektor och fyll nålen med härstamningsspåraren genom att applicera undertryck. Kalibrera nålen och justera nålspetsens storlek och injektionstiden för att leverera ungefär en nanoliter av härstamningslösningen mätt i mineralolja. Se till att droppstorleken som injiceras är korrekt och justera injektorinställningarna vid behov.Översvämma mikroinjektionsskålen med en 3% fCAL-lösning och överför cirka 10 embryon till lerskålen med en överföringspipett. Injicera cellerna av intresse med ungefär en nanoliter av det fluorescerande dextran eller 200 pikogram av GFP-mRNA. Använd ett stereomikroskop, bekräfta framgången med cellmärkning.Se till att endast den avsedda cellen injiceras. Kassera embryon som innehåller skadade eller felaktigt märkta celler i enlighet med institutionell politik. Överför de injicerade embryona till en petriskål innehållande 0,5x Steinberg-lösning.Odla dem mellan 14 och 25 grader Celsius tills de når önskat utvecklingsstadium. Överför tre till fem embryon till en agarskål innehållande 0,2x Steinberg-lösning för mikrodissektioner. Använd pincett för att dissekera den märkta klonen från embryot.Samla upp den dissekerade vävnaden med en 0,5 till 10 mikroliter pipett och deponera dem i en mikrocentrifugfil. Använd en pipett, aspirera mediet som omger den uppsamlade vävnaden för att begränsa salter i provet för att undvika störningar med HRMS-analys. Frys omedelbart de isolerade cellerna genom att placera provflaskan på torris eller flytande kväve.Förvara proverna vid minus 80 grader Celsius tills masspektrometrianalys. För bearbetning av enstaka cellprov med CE, denaturera proteinerna genom att värma provet till 60 grader Celsius i cirka 15 minuter. Balansera sedan provet till rumstemperatur i fem minuter och tillsätt trypsin till proverna för matsmältning.För analys av NanoLC, lysera upp till fem dissekerade vävnader i 50 mikroliter lysbuffert. Underlätta processen genom att pipettera provet upp och ner. För att bearbeta de dissekerade vävnaderna, inkubera lysatet vid fyra grader Celsius i 10 minuter.Därefter pellet cellskräp och äggula blodplättar vid fyra grader Celsius genom centrifiering vid 4 500 RCF. Överför supernatanten till en ren injektionsflaska med mikrocentrifug och tillsätt 10 % SDS för att erhålla en slutlig koncentration på 1 % SDS i lysatet. För vävnader, tillsätt 0,5 molar ditiotreitol till lysatet för att erhålla en slutlig koncentration av cirka 25 millimolar.Inkubera sedan lysatet i 30 minuter vid 60 grader Celsius för att kemiskt reducera disulfidbindningar i proteiner. Tillsätt 0,5 molar jodacetamid för att erhålla den slutliga koncentrationen av ca 75 millimolar i lysatet och inkubera blandningen i 15 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Tillsätt 0,5 molar ditiotreitol samma som den ursprungliga volymen för att släcka reaktanterna som återstår från alkyleringsreaktionen.Fäll ut proteiner i aceton över natten enligt beskrivningen i textprotokollet och rekonstituera i 0,5 molar ammoniumbikarbonat. Tillsätt trypsin för provsmältning och inkubera injektionsflaskorna vid 37 grader Celsius. För att separera peptiderna med CE, rekonstituera proteinet uppdelat i en till två mikroliter av provlösningen.Virvel det blandade provet och centrifusion vid 10 000 RCF i två minuter vid fyra grader Celsius till pelletscellskräp. Initiera CE-ESI-instrumentet genom att spola CE-kapillären med BGE. Placera en mikroliter prov i provflaskan och injicera en till 10 nanoliter av provet i CE-separationskapillären genom hydrodynamisk injektion.Överför inloppsänden på CE-separationskapillären till BGE. Starta elektroforetisk separation genom att gradvis rampa CE-separationsspänningen från jordjord. Potentialer på 20 till 28 kilovolt med en ström under 10 mikroampère säkerställer stabil och reproducerbar instrumentprestanda för analys.För att separera med Nano LC, suspendera peptidprovet igen i mobil fas A.Provets koncentration och injektionsvolym beror på tillgängligt LC-system och kolonn. Överför provet till en LC-injektionsflaska. Fyll cirka 200 nanogram till två mikrogram peptidprov i C18-analyskolonnen och separera peptiderna med en flödeshastighet av 300 nanoliter per minut med gradienteluering som beskrivs i textmanuskriptet.Använd en kamera, kontrollera vätskeflödet genom elektrospraysändaren och inspektera inställningen visuellt för eventuella läckor. Förvärva masspektrometrihändelser och sekvensera peptiderna som beskrivs i textmanuskriptet. Gentranslationella skillnader upptäcktes mellan D11-celler dissekerade från olika embryon med CE-ESI-HRMS.Härstamningsmärkta dissekerade cellkloner analyserades av LC-HRMS. Pathway analys av proteiner visade uppreglerad proteinöversättning och energimetabolism i Spemanns organisatör med neuroektodermen. Neuroektodermprodeum anrikades i proteiner associerade med kärntransport av proteinlast i cellen, vilket sannolikt indikerar nedströms händelser efter signalering.Anrikningsanalysen av molekylära funktioner indikerade uppreglering i translationsinitiering, RNA-bindning och bindning av proteasomkomplexet, vilket tyder på en roll för dynamisk proteinomsättning som utvecklar Spemanns organisatör. Välj endast stereotypa embryon för detta protokoll för att förbättra reproducerbarheten och resultattolkningen. Dissekerad vävnad ska överföras till en injektionsflaska och omedelbart frysas innehållande en så minimal mediebuffert som möjligt för att minimera kontaminering från buffertsalter.Detta tillvägagångssätt har gjort det möjligt för oss att studera proteindynamik i identifierade celler och cellinjer i levande embryon. Den nya informationen som vi har fått om den rumsliga temporala produktionen av viktiga proteiner i utvecklande vävnader har gjort det möjligt för oss att utforma riktade experiment för att bedöma deras biologiska funktion.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Storskalig Icke-riktad Metabolomic Profilering av serum med Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Oriktade Metabolomics från biologiska källor Använda Ultraperformance vätskekromatografi-högupplösande masspektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

En guidad Materials Screening strategi för utvecklingen av kvantitativa Sol-gel protein från Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysera Protein Dynamics Använda Hydrogen Exchange masspektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekvensering av växt Wall Heteroxylans Använda enzym, Chemical (metylering) och fysiska (masspektrometri, kärnmagnetisk resonans) Tekniker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering av Ambient masspektrometri med användning av schlierenfotografering

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntes och masspektrometri analys av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...