Name: cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Jie Li'ye (Maryland Üniversitesi, College Park) embriyonik ayrışma ve FACS hakkındaki değerli tartışmalar için minnettarız. Vi M. Quach ve Camille Lombard-Banek'e, bu protokolde vurgulanan proteomik uygulamaları örnekleyen önceki çalışmalarda numune hazırlama ve veri toplama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışmanın bazı bölümleri IOS-1832968 KARİYER (P.N.'ye) ödül numarası altında Ulusal Bilim Vakfı, R35GM124755 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri (P.N.'ye), Maryland Üniversitesi-Ulusal Kanser Enstitüsü Ortaklık Programı (P.N.'ye) ve COSMOS Club Vakfı araştırma ödülleri (A.B.B. ve L.R.P.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Xenopus laevis yetişkin kurbağalarının insancıl bakımını ve kullanımını sağlayan tüm protokoller, Maryland Üniversitesi, College Park'taki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay numaraları R-DEC-17-57 ve R-FEB-21-07).
1. Çözümleri hazırlayın
<ol><li>Embriyoloji için<ol><li>1x, 0.5x ve 0.2x Steinberg çözeltisini (SS) hazırlayın, ardından standart protokoller12'yi izleyerek ...

Bu protokol, Xenopus türlerinin embriyolarında tanımlanmış hücre soylarında protein ekspresyonunun karakterizasyonunu sağlar. HRMS'den kaynaklanan metodoloji, moleküler tanımlamada mükemmel özgüllüğü, moleküler problar (genellikle yüzlerce ila binlerce farklı protein) olmadan çoklu protein tespiti yeteneğini ve niceleme yeteneğini birleştirir. Hücre ve gelişimsel (nöro) biyolojideki klasik araçlara ve iş akışlarına uyarlanabilirlik, HRMS proteomiklerini, omurgalı X. laevis </e...

Hücre farklılaşması ve doku ve organların oluşumu hakkındaki anlayışımız, genlerin ve ürünlerinin onlarca yıllık ayrıntılı hedeflenmiş ekranlarının sonucudur. Önemli hücresel olaylar sırasında tüm biyomoleküller ve miktarları hakkındaki bilgimizi arttırmak, omurgalı vücut planının mekansal ve zamansal modellemesini kontrol eden moleküler mekanizmaların çözülmesine yardımcı olacaktır. Moleküler amplifikasyon ve dizilemeyi mümkün kılan teknolojiler artık çok sayıda gen ve transkript hakkında rutin olarak rapor verebilmekte ve temel biyolojik ve translasyonel araştırmalarda hipotez odaklı çalışmaları desteklemektedir. Gelişmekte olan sistemleri anlamak için, transkripsiyon ve çeviri arasındaki karmaşık bir ilişki, çoklu proteinlerin ve bunların çeviri sonrası modifikasyonlarının doğrudan analizini savunur. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler gibi in vitro biyolojik sistemleri kullanan küresel proteomikler, doku indüksiyon mekanizmalarını tanımlamaya başladı 1,2. Omurgalı embriyosu gibi karmaşık organizmalarda gelişim, uzay ve zaman bağlamında morfojen gradyanlarına dayanır3. Hücreler sinir dokuları gibi özel dokular oluşturmak için farklılaştıkça proteomik değişiklikler hakkında bilgi edinmenin, normal ve kusurlu gelişimi kontrol eden moleküler programların kilidini açmak ve yeni nesil terapötiklere rehberlik etmek için bir anahtar sunduğu anlaşılmaktadır.
Omurgalı Güney Afrika pençeli kurbağası (Xenopus laevis), hücre ve gelişimsel, nöro ve rejeneratif biyolojide köklü bir modeldir. Sir John Gurdon'un somatik çekirdeğin pluripotensinin keşfi için 2012 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü 4,5, bu modelin temel ve translasyonel çalışmalardaki keşifler için önemini vurguladı. Xenopus embriyoları anneye dışarıdan gelişir, böylece hücrelerin, hücre klonlarının ve gen ekspresyonunun gelişimin çeşitli aşamalarında doğrudan manipülasyonunu kolaylaştırır. Asimetrik pigmentasyon ve basmakalıp hücre bölünmeleri, 16-6 ve 32 hücreli 7,8 aşamalı embriyodan tekrarlanabilir kader haritalarının çizilmesini sağladı. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) tabanlı proteomikler için, modelin ek avantajları, analiz için bol miktarda protein içeriği sağlayan nispeten büyük boyutu (~ 1 mm çapında) içerir (erken bölünme aşamasındaki embriyolarda ~ 130 μg, 16 hücreli embriyonun tek hücrelerinde ~ 10 μg protein içeriği)9,10.
Şu anda, HRMS, proteinleri tespit etmek için tercih edilen önde gelen teknolojidir. Bu teknoloji, çoklu, genellikle yüzlerce-binlerce farklı proteinin doğrudan, hassas ve spesifik olarak algılanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar11. HRMS tarafından aşağıdan yukarıya proteomik, birbirine bağlı bir dizi adımı içerir. Hücre / doku örneğinden ekstraksiyonu takiben, proteinler tripsin (aşağıdan yukarıya proteomik) gibi proteolitik bir enzimle sindirilir. Elde edilen peptitler, hidrofobiklik (ters fazlı sıvı kromatografisi, LC), net yük (iyon değişim kromatografisi), boyut (boyut dışlama kromatografisi) veya elektroforetik hareketlilik (kılcal elektroforez, CE) dahil olmak üzere farklı fizikokimyasal özelliklerine göre ayrılır. Peptitler daha sonra tipik olarak elektrosprey iyonizasyonu (ESI) kullanılarak yüklenir (iyonize edilir) ve peptid iyonları tandem HRMS ile gaz fazı parçalanması yoluyla tespit edilir ve sıralanır. Elde edilen peptit verileri, incelenen organizmanın proteomu ile eşleştirilir. Proteine özgü (proteotik) peptid iyon sinyal yoğunluğu konsantrasyon ile korelasyon gösterdiğinde, protein nicelleştirmesi etiketsiz veya etiket bazlı (çoklama kantitasyonu) gerçekleştirilebilir. HRMS proteomikleri, incelenen sistemin moleküler durumu hakkında zengin bir bilgi kaynağı sunarak, hipotezlerin üretilmesine ve fonksiyonel çalışmaların izlenmesine olanak tanır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Şekil 1: Gelişmekte olan (kurbağa) embriyoda hücre-soy rehberliğinde HRMS proteomiklerini sağlayan mekansal olarak ölçeklenebilir proteomikler. (A) Numunenin (1) tanımlanmış bir hücrenin (iç kısım) enjeksiyonu için stereomikroskop (2) kullanılarak, bir çeviri aşaması (4) tarafından kontrol altında tutulan fabrikasyon bir mikropipet (3) kullanılarak görselleştirilmesi. (B) 16 hücreli bir embriyoda tanımlanan sol D11 hücresinin hücre altı örneklemesi. (C) 16 hücreli bir embriyodan bütün bir D11 hücresinin diseksiyonu. (D) Gastruladaki nöral ektodermin (NE) diseksiyonuna rehberlik etmek için 32 hücreli bir embriyodan sol ve sağ D111 döllerinin floresan (yeşil) izlenmesi (evre 10) ve FACS kullanılarak kurbağa yavrusundan inen dokunun izolasyonu. Ölçek çubukları: embriyolar için 200 μm, şişe için 1.25 mm. Rakamlar 15,19,21,59 referanslarından izin alınarak uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Burada sunulan protokol, gelişmekte olan X. laevis embriyolarında tanımlanmış hücrelerde / dokularda çok sayıda proteinin HRMS tabanlı nicelleştirilmesini sağlar. Yaklaşım, doğru hücre tanımlama, tekrarlanabilir hücre kader haritaları ve bu biyolojik model 6,7,8'deki hücre soylarını izlemek için yerleşik metodolojiler üzerine kuruludur. Şekil 1'de gösterildiği gibi, hücresel içeriği aspire etmek için tüm hücre diseksiyonu veya kılcal mikro örnekleme kullanarak tek hücrelerden proteomları inceliyoruz. Bir hücrenin soyunu izlemek, hücreler gastrulasyon sırasında dokular oluştururken proteomun uzaysal zamansal evrimini incelememize izin verir. Hücre soyunun, floresan protein (örneğin, yeşil floresan proteini veya GFP) için inert dekstran veya mRNA'ya konjuge edilmiş bir florofor enjekte edilmesiyle floresan olarak işaretlenir. Etiketli döl, istenen gelişimsel zaman noktalarında izole edilir. Gastrulasyon sırasında, sıkıca kümelenmiş hücre klonları diseksiyon ile izole edilebilir. Gastrulasyondan sonra, hücre klonları göç hareketleri nedeniyle embriyo içinde dağıtılabilir ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile ayrışmış dokulardan izole edilebilir. Bu hücre ve dokulardaki proteinler, ayırma için HPLC veya CE ve tanımlama için ESI tandem HRMS kullanılarak aşağıdan yukarıya proteomiklerle ölçülür. Hücre soyu rehberliğinde HRMS proteomikleri, embriyo içindeki farklı hücre boyutlarına ve soylarına ölçeklenebilir ve spesifik, hassas ve kantitatiftir. Burada gösterilen seçkin örnekler aracılığıyla, bu protokolün ölçeklenebilir olduğunu ve farklı hücre türlerine ve hücre soylarına geniş ölçüde uyarlanabileceğini de gösteriyoruz.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Şekil 2: Biyoanalitik iş akışı. Mikro-diseksiyon ve kılcal aspirasyon veya FACS, hücresel ve klonal protein içeriğinin örneklenmesini kolaylaştırdı. Bol miktarda yumurta sarısı proteininin tükenmesi ve kılcal elektroforez (CE) veya nano-akış sıvı kromatografisi (LC) ile ayrılması, elektrosprey iyonizasyon (ESI) yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) kullanılarak gelişmiş tanımlama (ID) hassasiyeti. Niceliklendirme, gen ontolojisinden (GO) elde edilen bilgilerle bağlantılı olarak hipotez odaklı çalışmalar için yeni bilgiler sağlayan düzensizliği ortaya çıkardı. Şekillerreferans 15'ten izin alınarak uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XSE105DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic peptide fractionation platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 spin columns (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera ro monitor electrospray</td>
			<td>Edmund Optics Inc.</td>
			<td>EO-2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combretastatin A4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CESI system</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>CESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diothiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ62786AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence light source</td>
			<td>Lumencore</td>
			<td>AURA III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&#160; tubes: protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSX40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1088150596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Block</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure liquid Chromatography System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4013-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC122275000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary puller</td>
			<td>Suttor Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, commercial</td>
			<td>ProteomeDiscoverer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data analysis software, opensource</td>
			<td>MaxQuant</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-idet 40 substitute</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 10 &#181;L bed Zip-tips (for desalting)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind vials</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108434 
			, 0030108442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR505755R/3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium isethionate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>220078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221368-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (objective 10x)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1270, SZX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500&#8211;1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ22638AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10 &#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-Built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in the developing (frog) embryo

Moleküler olayların hücreler doku ve organlara yol açtıkça karakterizasyonu, normal gelişimi daha iyi anlama ve hastalıklar için etkili ilaçlar tasarlama potansiyelini artırmaktadır. Çeşitli tiplerin ve çok sayıda proteinin doğru bir şekilde tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan teknolojiler, uzay ve zamanda doku ve organizma gelişimini düzenleyen moleküler mekanizmalar hakkında hala eksik bilgi sağlayacaktır. Burada, Xenopus laevis (kurbağa) embriyolarında tanımlanmış hücre soylarındaki binlerce proteinin ölçülmesini sağlayan kütle spektrometrisine dayalı bir protokol sunuyoruz. Yaklaşım, tekrarlanabilir hücre-kader haritalarına ve bu omurgalı gelişim modelinden hücreleri ve soylarını (klonlarını) tanımlamak, floresan olarak etiketlemek, izlemek ve örneklemek için yöntemler üzerine kuruludur. Diseksiyon veya floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile mikro örnekleme veya izole hücreler kullanılarak hücresel içerik toplandıktan sonra, proteinler aşağıdan yukarıya proteomik analiz için ekstrakte edilir ve işlenir. Sıvı kromatografisi ve kılcal elektroforez, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) ile protein tespiti ve nicelleştirilmesi için ölçeklenebilir ayırma sağlamak için kullanılır. Nöral-doku kaderi olan hücrelerin proteomik karakterizasyonu için temsili örnekler verilmiştir. Hücre soy rehberliğinde HRMS proteomik, farklı doku ve organizmalara uyarlanabilir. Omurgalı gelişimi sırasında proteomun uzaysal-zamansal dinamiklerine bakmak için yeterince hassas, spesifik ve nicelikseldir.

Bu protokol, X. laevis embriyolarında doku oluştururken tek hücrelerdeki proteinlerin ve soylarının incelenmesini sağlamıştır. Şekil 1, nöral-doku-kader hücrelerindeki proteinleri ve embriyodaki yeni indüklenen nöral ektodermi incelemek için yaklaşımın böyle bir uygulamasını göstermektedir. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, biyoanalitik iş akışı, hücreleri tanımlamak, enjekte etmek / aspire etmek ve örnekleri toplamak için ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo at JoVE.com

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Burada, omurgalı Xenopus laevis embriyosunda bilinen doku kaderlerine sahip hücre soylarının kütle spektrometrisine dayalı proteomik karakterizasyonu açıklanmaktadır.

Gelişmekte Olan (Kurbağa) Embriyoda Hücre-Soy Kılavuzlu Kütle Spektrometrisi Proteomikleri

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Bu soy rehberliğindeki yaklaşım, omurgalı embriyo içindeki uzamsal ve zamansal çözünürlükle önemli gelişimsel olayların proteomik analizini sağlar ve tüm embriyo ölçümleriyle erişilemeyecek bilgileri verir. Bu yaklaşım, gelişim sırasında farklılaştıkça farklı embriyonik hücrelerden proteinleri, metabolitleri ve transkriptleri incelemek için kolayca genişletilebilir. Bu yöntem, erken gelişim sırasında doku indüksiyonu ve hücre kaderi taahhüdü mekanizmaları da dahil olmak üzere normal ve hastalık gelişimini kontrol eden moleküler mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.Her embriyoyu bir kuyuya yönlendirmek için bir saç halkası kullanın ve hedeflenen ilgili hücrenin mikroiğneye doğru açıda olması için yavaşça konumlandırın. İlgilenilen soyun öncü hücresini tanımlamak için xenopus laevis doku kader haritalarını izleyin. Embriyoyu çevreleyen vitelin zarını nazikçe çıkarmak için iki keskinleştirilmiş forseps kullanın.Forseps kullanarak manuel diseksiyon ile tek hücreleri embriyodan izole edin. Soy izleyici çözeltisini içeren enjeksiyon iğnesini ayarlayarak başlayın. Mikroenjeksiyon iğnesini, çok eksenli bir mikro manipülatör tarafından kontrol edilen bir mikro pipet tutucuya monte edin.Mikro pipet tutucuyu bir mikro enjektöre bağlayın ve negatif basınç uygulayarak iğneyi soy izleyici ile doldurun. İğneyi kalibre edin ve mineral yağda ölçülen soy izleyici çözeltisinin yaklaşık bir nanolitresini vermek için iğne ucunun boyutunu ve enjeksiyon süresini ayarlayın. Enjekte edilen damlacık boyutunun doğru olduğundan emin olun ve gerekirse enjektör ayarlarını yapın.Mikroenjeksiyon kil kabını %3'lük bir fCAL çözeltisi ile doldurun ve bir transfer pipeti kullanarak yaklaşık 10 embriyoyu kil kabına aktarın. İlgili hücrelere yaklaşık bir nanolitre floresan dekstran veya 200 pikogram GFP mRNA enjekte edin. Bir stereo mikroskop kullanarak, hücre etiketlemenin başarısını onaylayın.Yalnızca amaçlanan hücrenin enjekte edildiğinden emin olun. Kurumsal politikalara uyarak yaralı veya yanlış etiketlenmiş hücreler içeren embriyoları atın. Enjekte edilen embriyoları 0.5x Steinberg çözeltisi içeren bir petri kabına aktarın.İstenilen gelişim aşamasına ulaşana kadar onları 14 ila 25 santigrat derece arasında kültürleyin. Üç ila beş embriyoyu, mikro diseksiyonlar için 0.2x Steinberg çözeltisi içeren bir agar kabına aktarın. Etiketli klonu embriyodan diseke etmek için forseps kullanın.Disseke edilmiş dokuyu 0,5 ila 10 mikrolitrelik bir pipetle toplayın ve bir mikro santrifüj dosyasına koyun. Bir pipet kullanarak, HRMS analizine müdahale edilmesini önlemek için numunedeki tuzları sınırlamak üzere toplanan dokuyu çevreleyen ortamı aspire edin. Numune şişesini kuru buz veya sıvı azot üzerine yerleştirerek izole edilmiş hücreleri derhal dondurun.Kütle spektrometresi analizine kadar numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. CE ile tek hücreli numune işleme için, numuneyi yaklaşık 15 dakika boyunca 60 santigrat dereceye ısıtarak proteinleri denatüre edin. Daha sonra numuneyi beş dakika boyunca oda sıcaklığına dengeleyin ve sindirim için numunelere tripsin ekleyin.NanoLC ile analiz için, 50 mikrolitre lizis tamponunda beş adede kadar disseke dokuyu lize edin. Numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek işlemi kolaylaştırın. Disseke edilmiş dokuları işlemek için, lizatı 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Daha sonra hücre kalıntılarını ve yumurta sarısı trombositlerini 4.500 RCF'de merkezleştirme yoluyla dört santigrat derecede peletleyin. Süpernatantı temiz bir mikro santrifüj şişesine aktarın ve lizatta% 1'lik SDS'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için% 10 SDS ekleyin. Dokular için, yaklaşık 25 milimolar'lık nihai bir konsantrasyon elde etmek için lizata 0.5 molar ditiyotreitol ekleyin.Daha sonra, proteinlerdeki disülfit bağlarını kimyasal olarak azaltmak için lizatı 60 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Lizatta yaklaşık 75 milimolar'ın nihai konsantrasyonunu elde etmek için 0.5 molar iyodoasetamid ekleyin ve karışımı karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Alkilasyon reaksiyonundan kalan reaktanları söndürmek için başlangıç hacmiyle aynı 0.5 molar ditiyotreitol ekleyin.Metin protokolünde açıklandığı gibi gece boyunca asetondaki proteinleri çökeltin ve 0.5 molar amonyum bikarbonatta yeniden oluşturun. Numune sindirimi için tripsin ekleyin ve şişeleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Peptitleri CE kullanarak ayırmak için, numune çözücüsünün bir ila iki mikrolitresinde sindirilen proteini yeniden oluşturun.Karışık numuneyi ve merkezcilleştirmeyi 10.000 RCF'de dört santigrat derecede iki dakika boyunca pelet hücresi kalıntılarına vorteks. CE kılcal damarını BGE ile yıkayarak CE-ESI cihazını başlatın. Numune şişesine bir mikrolitre numune yerleştirin ve numunenin bir ila 10 nanolitresini hidrodinamik enjeksiyonla CE ayırma kılcal damarına enjekte edin.CE ayırma kılcal damarının giriş ucunu BGE'ye aktarın. CE ayırma voltajını toprak topraklamasından kademeli olarak artırarak elektroforetik ayırmaya başlayın. 10 mikro amperin altında bir akımla 20 ila 28 kilovoltluk potansiyeller, analiz için istikrarlı ve tekrarlanabilir enstrümantal performans sağlar.Nano LC kullanarak ayırmak için, peptid numunesini mobil faz A'da yeniden askıya alın.Numunenin konsantrasyonu ve enjeksiyon hacmi, mevcut LC sistemine ve kolonuna bağlıdır. Numuneyi bir LC şişesine aktarın. C18 analitik sütununa yaklaşık 200 nanogram ila iki mikrogram peptit örneği yükleyin ve peptitleri, metin makalesinde açıklandığı gibi gradyan elüsyonunu kullanarak dakikada 300 nanolitrelik bir akış hızında ayırın.Bir kamera kullanarak, elektro sprey yayıcıdan sıvı akışını kontrol edin ve kurulumu olası sızıntılara karşı görsel olarak inceleyin. Kütle spektrometresi olaylarını elde edin ve peptitleri metin makalesinde açıklandığı gibi sıralayın. CE-ESI-HRMS kullanılarak farklı embriyolardan diseke edilen D11 hücreleri arasında gen translasyonel farklılıklar tespit edildi.Soy etiketli disseke hücre klonları LC-HRMS ile analiz edildi. Proteinlerin yol analizi, Spemann'ın organizatöründe nöroektoderm ile birlikte düzenlenmiş protein translasyonunu ve enerji metabolizmasını gösterdi. Nöroektoderm prodeumu, hücredeki protein yükünün nükleer taşınması ile ilişkili proteinlerle zenginleştirildi ve muhtemelen sinyallemeyi takiben aşağı akış olaylarını gösterdi.Moleküler fonksiyonların zenginleştirme analizi, translasyon başlatma, RNA bağlanma ve proteazom kompleksinin bağlanmasında yukarı regülasyonu gösterdi ve Spemann'ın organizatörünü geliştiren dinamik protein döngüsü için bir rol düşündürdü. Tekrarlanabilirliği ve sonuç yorumlamasını iyileştirmek için bu protokol için sadece basmakalıp embriyoları seçin. Diseke edilmiş doku bir şişeye aktarılmalı ve tampon tuzlarından kaynaklanan kontaminasyonu en aza indirmek için mümkün olduğunca az ortam tamponu içeren derhal dondurulmalıdır.Bu yaklaşım, tanımlanmış hücrelerdeki protein dinamiklerini ve canlı embriyolardaki hücre soylarını incelememizi sağlamıştır. Gelişmekte olan dokulardaki önemli proteinlerin mekansal zamansal üretimi hakkında elde ettiğimiz yeni bilgiler, biyolojik işlevlerini değerlendirmek için hedefli deneyler tasarlamamızı sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Kantitatif Sol-jel Türetilmiş Protein Mikroarray&#39;ler geliştirilmesi için Rehberli Malzeme Tarama Yaklaşım

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Schlieren Fotoğraf Kullanımına Ortam kütle spektrometresi görselleştirme

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Sentez ve kütle spektrometresi analizleri Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...