Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81972624) إلى D.L.

ملاحظة: تم توفير خلايا H1299 من قبل بنك الخلايا الجذعية ، الأكاديمية الصينية للعلوم وثبت أنها سلبية للتلوث الميكوبلازما.
1. ثقافة الخلية
<ol><li>بالنسبة للمزرعة الأولية ، ضع 1 × 106 خلايا من خط خلايا الورم الغدي الرئوي البشري ، H1299 في طبق بتري 10 سم مع 10-12 مل من وسط RPMI 1640...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions.">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li><li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling.">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li><li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

يلعب الوجود في كل مكان دورا مهما في جميع العمليات الخلوية الفسيولوجية والمرضية تقريبا2. في السنوات الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في فهم الدور الجزيئي لليوبيكويتين في مسارات الإشارات وكيف تؤدي التغييرات في نظام يوبيكويتين إلى أمراض بشرية مختلفة2. تساهم تنقية البرو...

Ubiquitin هو بروتين محفوظ تطوريا من 76 من الأحماض الأمينية1،2،3. يوبيكويتين يربط تساهميا بقايا ليسين على البروتينات المستهدفة من خلال الشلالات التي تنطوي على تنشيط (E1) ، واقتران (E2) ، وإنزيمات ligase (E3). يتم تنشيط Ubiquitin أولا بواسطة إنزيم E1 ثم يتم نقله إلى إنزيمات الاقتران E2. بعد ذلك ، تتفاعل أربطة يوبيكويتين E3 مع كل من إنزيمات E2 المحملة باليوبيكويتين وبروتينات الركيزة وتتوسط في تكوين رابطة إيزوببتيد بين الطرف C من يوبيكويتين وبقايا ليسين في الركيزة1،2،3،4،5. يتضمن الوجود في كل مكان ربط شقوق ubiquitin ببقايا اللايسين على بروتينات الركيزة أو على نفسها ، مما يؤدي إلى أحادي البروتين أو تعدد البيئات. تحدث عملية الانتشار هذه داخل الخلايا في حقيقيات النوى وتنظم مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية. يؤدي الوجود في كل مكان إلى تدهور بروتينات الركيزة عبر نظام يوبيكويتين بروتيازوم1،2،3،4،5. بالإضافة إلى ذلك ، يعدل الانتشار في كل مكان توطين البروتين تحت الخلوي ، وتكوين مركب البروتين ، والاتجار بالبروتين في الخلايا 3,5. يمكن إزالة شقوق Ubiquitin المرتبطة ببروتينات الركيزة عن طريق إنزيمات deubiquitinating (DUBs)6,7. والجدير بالذكر أن الطرق المختلفة التي يتم بها تجميع سلاسل ubiquitin توفر عددا لا يحصى من الوسائل لتنظيم العمليات البيولوجية المختلفة 1,5. لا تزال الأدوار الدقيقة للانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة بروتين الركيزة غير مفهومة بشكل كامل حتى الآن. يساهم تنقية البروتينات في كل مكان في توضيح آثار انتشار البروتين في كل مكان على مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية.
يعد بروتين p53 أحد أهم البروتينات المثبطة للورم ويظهر طفرات جينية أو تعطيلا في جميع أنواع السرطان البشرية تقريبا8،9،10،11. يتم تنظيم استقرار ونشاط P53 بدقة في الجسم الحي من خلال تعديلات ما بعد الترجمة ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، والفسفرة ، والأستيل ، والمثيلة12،13. يحتوي بروتين p53 على عمر نصف قصير يتراوح من 6 دقائق إلى 40 دقيقة في خلايا مختلفة ، والذي ينتج بشكل رئيسي عن تعدد الجزيئات والتحلل البروتيني اللاحق10,12. الماوس المزدوج الدقيقة 2 (Mdm2) هو E3 ubiquitin ligase من p53 الذي يرتبط بنهاية N من p53 لمنع نشاطه النسخي12،14،15. يعزز Mdm2 تعدد البائن والتدهور البروتيني ل p53 للتحكم في استقراره ويحث على تعدد p53 لتسهيل تصديره النووي12،14،15،16. هنا ، يتم استخدام انتشار p53 بوساطة Mdm2 كمثال لتقديم طريقة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات بالتفصيل. يمكن تحديد المنظمين الذين يؤثرون على حالة انتشار البروتينات المستهدفة في كل مكان باستخدام مقايسة الانتشار في الجسم الحي عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط أو هدمها / إخراجها في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام البروتينات في كل مكان كركائز لمقايسة deubiquitination في المختبر. يمكن إجراء فحص عالي الإنتاجية لتحديد DUBs محددة للبروتينات المستهدفة عن طريق احتضان ركائز موجودة في كل مكان مع DUBs الفردية. قد تعمل البروتينات الموجودة في كل مكان كسقالة لتجنيد بروتينات الإشارات في الخلايا. يمكن تنقية مركب البروتين المستهدف في كل مكان عن طريق الترسيب المناعي المتسلسل في ظل ظروف التنقية الأصلية وتحديده بواسطة قياس الطيف الكتلي. يمكن استخدام البروتوكول الحالي على نطاق واسع للتحقيق في البروتينات الخلوية التي ينظمها الوجود في كل مكان.
تم إنشاء عدة طرق لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان ، والتي تشمل استخدام يوبيكويتين الموسومة بالتقارب ، والأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، والمجالات المعزولة المرتبطة باليوبيكويتين (UBDs)17. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام يوبيكويتين الموسوم بالتقارب كوسيط لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات. يوفر استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة مزايا على الطرق الأخرى. يتم تنقية البروتينات في كل مكان في وجود مسخ قوي ، مما يقلل من الارتباط غير المحدد بالراتنج المشحون بالنيكل عن طريق خطي البروتينات الخلوية وتعطيل تفاعلات البروتين والبروتين. في المقابل ، فإن استخدام الأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، و UBDs المعزولة كوسطاء لا يمكن أن يستبعد بشكل فعال شركاء الربط من البروتين المستهدف لأن التنقية تحتاج إلى إجراء في ظل ظروف أقل صرامة. علاوة على ذلك ، قد تؤدي التنقية أيضا إلى زيادة ارتباط البروتينات غير ذات الصلة باستخدام هذه الوسطاء. بالإضافة إلى ذلك ، هناك ميل ملزم لأنواع ربط ubiquitin المختلفة بالإضافة إلى أحادي ومتعدد الوجود بواسطة بروتينات ملزمة لليوبيكويتين أو UBDsالمعزولة 17. يساهم استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة في سحب جميع البروتينات الخلوية في كل مكان. بدلا من ذلك ، فإن استخدام الأغاروز المقترن بالأجسام المضادة للعلم أو الأجسام المضادة لحمض الهيمونيك المتاح تجاريا يجعل من السهل ترسيب البروتينات المستهدفة واسعة النطاق التي تحمل علامة العلم أو HA في ظل ظروف غير مسخة. يمكن استخدام خطوة تنقية ثانية ، على سبيل المثال ، عن طريق راتنج مشحون بالنيكل يستهدف يوبيكويتين بولي هيس ، للحصول على بروتينات مستهدفة في كل مكان ذات نقاوة عالية للتجارب النهائية. والجدير بالذكر أنه يمكن تكييف استراتيجية تنقية علامات الخاتمة عندما لا يمكن الحصول على جسم مضاد معين لترسيب البروتينات المستهدفة بشكل فعال. أخيرا ، فإن تنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات ، مقارنة بالتنقية في المختبر ، تحتفظ بوضع ربط ubiquitin للبروتينات المستهدفة في ظل ظروف فسيولوجية أكثر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

Ubiquitination هو نوع من التعديل بعد الترجمة الذي ينظم ليس فقط الاستقرار ولكن أيضا توطين ووظيفة بروتين الركيزة. تحدث عملية الانتشار في كل مكان داخل الخلايا في حقيقيات النوى وتنظم جميع العمليات البيولوجية الخلوية الأساسية تقريبا. تساعد تنقية البروتينات في كل مكان على التحقيق في دور الوجود في كل مكان في التحكم في وظيفة بروتينات الركيزة. هنا ، يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات مع بروتين مثبط الورم p53 كمثال. تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان في ظل ظروف صارمة غير تغيير طبيعة وتغيير الطبيعة. تم تنقية إجمالي بروتين p53 الخلوي الموسوم بالعلم باستخدام الأغاروز المترافق بالأجسام المضادة للعلم في ظل ظروف غير طبيعية. بدلا من ذلك ، تم تنقية البروتين الخلوي الكلي الموسوم في كل مكان باستخدام راتنج مشحون بالنيكل في ظل ظروف تغيير الطبيعة. تم الكشف بنجاح عن بروتينات p53 في كل مكان في الشطف بأجسام مضادة محددة. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تنقية الأشكال المنتشرة في كل مكان من بروتين معين بكفاءة من خلايا الثدييات ، مما يسهل الدراسات حول أدوار الانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة البروتين.

يوضح الرسم التخطيطي بروتينات يوبيكويتين (HH-Ub) ذات العلامات المزدوجة (HH-Ub) (الشكل 1 أ). يلخص الشكل 1 ب الإجراءات المستخدمة لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان. يمكن ربط يوبيكويتين الموسومة بولي هيه لاستهداف البروتينات في خلايا الثدييات. يمكن تنقية البروتينا?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

يصف البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات باستخدام بروتين مثبط الورم p53 كمثال. تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان من الخلايا في ظل ظروف صارمة غير مسخ وتغيير طبيعة .

تنقية بروتينات p53 في كل مكان من خلايا الثدييات

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تنقية الأشكال المنتشرة في كل مكان من بروتين معين بكفاءة من خلايا الثدييات ، مما يسهل الدراسات حول أدوار الانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة البروتين. تنقية البروتينات في كل مكان في خلايا الثدييات بالمقارنة مع التنقية في المختبر يحتفظ بوضع ربط ubiquitin للبروتينات المستهدفة في ظل ظروف إشعاعية أكثر. ابدأ بإضافة 1.5 ملليلتر من وسط المصل المختزل في ثلاثة أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.أضف الحمض النووي البلازميد الجاهز للنقل إلى كل أنبوب وأضف 0.2 ميكروغرام من بلازميد بروتين الفلورسنت الأخضر لمراقبة كفاءة النقل. أضف 78 ميكرولترا من كاشف نقل الجسيمات الشحمية إلى 4.5 ملليلتر من وسط المصل المختزل في أنبوب طرد مركزي آخر لتخفيف الجسيمات الشحمية. امزج جيدا عن طريق تحريك الأنبوب ثم اتركه يقف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.أضف 1.5 ملليلتر من محلول الجسيمات الشحمية المخففة إلى كل أنبوب يحتوي على 1.5 ملليلتر من محلول الحمض النووي المخفف. امزج جيدا واربط البلازميدات بالليبوزومات لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. تخلصي من الوسط الأصلي من أطباق بتري وأضيفي تسعة ملليلتر من وسط المصل المختزل في كل طبق.أضف ثلاثة ملليلترات من خليط الحمض النووي الشحمي واخلط المحلول عن طريق هز اللوح برفق ذهابا وإيابا ثلاث مرات ثم اليسار واليمين ثلاث مرات لتوزيع الخليط بالتساوي على الطبق. قم بزراعة الخلايا في الحاضنة المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استبدل الوسط بعد أربع إلى ست ساعات واستمر في زراعة الخلايا لمدة 24 إلى 36 ساعة.بعد 24 إلى 36 ساعة ، عالج الخلايا ب MG132 بتركيز نهائي من 10 ميكرومولار لمدة أربع إلى ست ساعات. تخلص من الوسط واغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني بارد. أضف ملليلتر واحد من PBS إلى الطبق.قم بإزالة الخلايا عن طريق كشطها بمكشطة نظيفة ونقل تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. جهاز طرد مركزي عند 700 جم لمدة خمس دقائق لجمع كريات الخلية. أضف 800 ميكرولتر من محلول تحلل FLAG البارد المكملة بكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني إلى الخلايا الموجودة في كل أنبوب.امزج الخلايا باستخدام مذبذب دوامة أو مسدس ماصة ثم احتضن الخليط على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بالموجات فوق الصوتية الخليط على الجليد مع كل نبضة تدوم ثانية واحدة ، وتخضع الخليط لخمس إلى 10 نبضات قصيرة. احتضان الخليط على دوار عند 40 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.ثم الطرد المركزي العينات بالموجات فوق الصوتية في 8،000 G لمدة 20 إلى 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل الطافت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. القسمة 80 ميكرولتر من استخراج الخلية وتخلط مع 20 ميكرولتر من 5X SDS تحميل العازلة .غلي العينات عند 98 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تبرد على الثلج لمدة دقيقتين وتخزن في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. استخدم هذه العينات كمجموعة إدخال لمراقبة تعبير البروتين.بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من حبات الأجسام المضادة المضادة ل FLAG M2 إلى مستخلصات الخلايا المتبقية واحتضانها على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل أو طوال الليل. جهاز طرد مركزي عند 1،500 جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية لجمع الخرز. أضف ملليلتر واحد من محلول تحلل FLAG البارد إلى الخرز واخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.كرر هذه الخطوة من أربع إلى ست مرات ، ثم أضف 40 ميكرولتر من ببتيدات FLAG بتركيز نهائي يبلغ 200 نانوجرام لكل ميكرولتر إلى الخرزات. احتضان على الدوار لمدة ساعتين كما هو موضح سابقا ثم الطرد المركزي في نفس درجة الحرارة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 10 ميكرولتر من مخزن تحميل 5X SDS.يغلى المزيج على حرارة 98 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم يبرد على الثلج لمدة دقيقتين. أضف ملليلتر واحد من PBS البارد إلى كريات الخلية واخلطها بالتساوي. قسمة 100 ميكرولتر من معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي دقيق كعينة إدخال وأجهزة طرد مركزي عند 700 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لجمع كريات الخلية.أضف 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحلل FLAG إلى عينة الإدخال واخلط الخلايا باستخدام مذبذب دوامة كما هو موضح سابقا. قم بتحليل الخلايا على الجليد لمدة ساعة واحدة ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بتقسيم 80 ميكرولترا من المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وإضافة 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل 5X SDS إلى المادة الطافية.يغلى المزيج على حرارة 98 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق ثم يبرد على الثلج لمدة دقيقتين. جهاز طرد مركزي 900 ميكرولتر المتبقية من تعليق الخلية عند 700 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لجمع بيليه الخلية. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ubiquitin 1 إلى كريات الخلية واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات لتوزيع الخلايا بالتساوي.إخضاع الخلية للتحلل إلى 10 إلى 20 جولة من الموجات فوق الصوتية على الجليد حتى يصبح المحلول غير لزج ، ثم الطرد المركزي للمحلول. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 30 ميكرولترا من راتنج النيكل المشحون إلى المادة الطافية. احتضان على الدوار في 15 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة ثم الطرد المركزي لمدة دقيقتين.بعد الطرد المركزي ، اجمع الخرز وأضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ubiquitin 1 إليه. احتضان مع الدوران في شاكر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 1،500 غرام لمدة دقيقتين ، كما هو موضح سابقا. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ubiquitin 2 إلى الخرز وقم بإجراء الحضانة متبوعا بالطرد المركزي ، كما هو موضح سابقا ، لجمع الخرز.كرر هذه الخطوة مرة واحدة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من PBS إلى الخرز واتبع نفس الإجراء للحضانة والطرد المركزي لجمع الخرز. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.قم بتخفيف البروتينات المرتبطة عن طريق احتضان الخرز ب 40 ميكرولتر من الإيميدازول بتركيز نهائي قدره 0.5 مولار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، الطرد المركزي مرة أخرى في 1،500 غرام لمدة دقيقتين. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف وأضف 10 ميكرولتر من مخزن تحميل 5X SDS.اغلي المحلول عند 98 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم قم بتبريده على الثلج لمدة دقيقتين. حل العينات بواسطة SDS-PAGE ثم نقلها إلى غشاء النيتروسليلوز عن طريق النشاف الغربي للكشف عن البروتينات المستهدفة باستخدام الأجسام المضادة المقابلة. ابدأ تشغيل نظام التصوير الكيميائي للكشف عن الإشارات من النشاف الغربي.ضع غشاء النيتروسليلوز في الكاميرا الغامضة ووجهه لأعلى. ترميز محلول الركيزة بالتساوي على الغشاء باستخدام مسدس ماصة. أخيرا ، حدد إجراء التعرض التلقائي لالتقاط إشارات السطوع الكيميائي وضبط وقت التعرض يدويا حتى يتم الحصول على إشارة مثالية.تم ترسيب إجمالي بروتين p53 ، بما في ذلك p53 في كل مكان ، بخرز FLAG M2 من خلايا H1299 في ظل ظروف غير تغيير الطبيعة. تعرض الشطف للنشاف الغربي مع مضاد p53 ومضاد للهيماغلوتينين أو مع الأجسام المضادة ل p53 والأجسام المضادة وحيدة النسيلة. هنا ، تعرضت مستخلصات الخلايا الخام أو مدخلاتها للنشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل p53 و MDM2.زادت الإشارة من بروتين p53 في كل مكان والذي يظهر كشريط ملطخ من الوزن الجزيئي المنخفض إلى العالي بشكل ملحوظ عندما تم التعبير عن MDM2 خارج الرحم في هذه الخلايا. تشير هذه النتيجة إلى أن بروتين p53 في كل مكان قد تم تنقيته بشكل فعال من الخلايا. بعد ذلك ، تم تحليل الخلايا تحت ظروف تغيير الطبيعة.تم سحب إجمالي البروتينات الخلوية في كل مكان باستخدام راتنج النيكل المشحون ثم تم إخضاعها للنشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل p53 ومضادات الهيماجلوتينين. تم الكشف عن بروتين p53 في كل مكان باستخدام جسم مضاد مضاد p53 وجسم مضاد مضاد للهيماغلوتينين. هنا في مستخلصات الخلايا الخام أو المدخلات تعرضت للنشاف الغربي مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل p53 و MDM2.أظهرت النتائج أن مستوى البروتين الكلي في كل مكان لم يتغير ولكن مستوى بروتين p53 في كل مكان زاد بشكل كبير بعد الإفراط في التعبير عن MDM2 في هذه الخلايا. يشير هذا إلى أن إجمالي بروتينات ubiquitin التي تحتوي على p53 في كل مكان قد تم سحبها بشكل فعال من محللات الخلايا في ظل ظروف تغيير الطبيعة. عند محاولة هذا الإجراء ، تذكر أن تعالج الخلايا ب MG132 قبل جمع الخلايا والموجات فوق الصوتية للخلايا بشكل صحيح على الجليد لتنقية البروتينات في كل مكان.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من<em&gt; ريبيسفالوس ميكروبلوس</em&gt; الخلايا الظهارية الظهارية

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

التقييم السريع لجودة البروتين الغشائي بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد حجم الفلورسنت

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

استخراج الأنابيب الدقيقة المعدلة من خلايا الثدييات لدراسة معقدات بروتين الأنابيب الدقيقة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...