Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81972624) til D.L.

BEMÆRK: H1299-celler blev venligst leveret af Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences og viste sig at være negative for mycoplasma-forurening.
1. Cellekultur
<ol><li>Til den indledende kultur placeres 1 x 106 celler af human lungeadenocarcinomcellelinje, H1299 i en 10 cm petriskål med 10-12 ml RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutaminadditiv, 1% natriumpyruvat og antibiotika (100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomyci...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions.">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li><li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling.">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li><li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

Ubiquitination spiller en kritisk rolle i næsten alle fysiologiske og patologiske cellulære processer2. I de senere år er der gjort store fremskridt med at forstå ubiquitins molekylære rolle i signalveje, og hvordan ændringer i ubiquitinsystemet fører til forskellige menneskelige sygdomme2. Oprensningen af allestedsnærværende proteiner bidrager til at give indsigt i de nøjagtige roller af ubiquitination i disse processer. Blandingerne af ubiquitinkonjugerede prote...

Ubiquitin er et evolutionært konserveret protein af 76 aminosyrer 1,2,3. Ubiquitin binder kovalent lysinrester på målproteiner gennem kaskader, der involverer aktiverende (E1), konjugerende (E2) og ligase (E3) enzymer. Ubiquitin aktiveres først af E1-enzymet og overføres derefter til E2-konjugerende enzymer. Derefter interagerer E3 ubiquitin-ligaser med både ubiquitinbelastede E2-enzymer og substratproteiner og medierer dannelsen af en isopeptidbinding mellem C-terminalen af ubiquitin og en lysinrest i substratet 1,2,3,4,5. Ubiquitination involverer fastgørelse af ubiquitindele til lysinrester på substratproteiner eller til sig selv, hvilket fører til proteinmonoubiquitination eller polyubiquitination. Denne ubiquitinationsproces forekommer intracellulært i eukaryoter og regulerer en lang række biologiske processer. Ubiquitination resulterer i nedbrydning af substratproteiner via ubiquitin-proteasomsystemet 1,2,3,4,5. Derudover modulerer ubiquitination protein subcellulær lokalisering, proteinkompleksdannelse og proteinhandel i celler 3,5. Ubiquitindele, der er ligeret med substratproteiner, kan fjernes ved hjælp af deubiquitinerende enzymer (DUB'er)6,7. Især giver de forskellige måder, hvorpå ubiquitinkæder samles, et utal af midler til at regulere forskellige biologiske processer 1,5. De nøjagtige roller af ubiquitination i regulering af substratproteinfunktion forbliver ufuldstændigt forstået indtil nu. Oprensningen af ubiquitinerede proteiner bidrager til belysningen af virkningerne af protein ubiquitination på en række cellulære processer.
P53-proteinet er et af de vigtigste tumorundertrykkende proteiner og udviser genetiske mutationer eller inaktivering i næsten alle humane kræftformer 8,9,10,11. P53 stabilitet og aktivitet reguleres delikat in vivo ved posttranslationelle modifikationer, herunder ubiquitination, phosphorylering, acetylering og methylering12,13. P53-proteinet har en kort halveringstid på mellem 6 min og 40 min i forskellige celler, hvilket hovedsageligt skyldes dets polyubiquitination og efterfølgende proteasomal nedbrydning10,12. Mus dobbelt minut 2 (Mdm2) er en E3 ubiquitin ligase af p53, der binder til N-terminalen af p53 for at hæmme dens transkriptionelle aktivitet12,14,15. Mdm2 fremmer polyubiquitination og proteasomal nedbrydning af p53 for at kontrollere dens stabilitet og inducerer monoubiquitination af p53 for at lette sin nukleare eksport12,14,15,16. Her bruges Mdm2-medieret p53 ubiquitination som et eksempel til at introducere en metode til oprensning af allestedsnærværende proteiner fra pattedyrceller i detaljer. De regulatorer, der påvirker ubiquitinationsstatus for målproteiner, kan identificeres ved hjælp af dette in vivo ubiquitination assay, når de overudtrykkes eller slås ned / slås ud i pattedyrceller. Derudover kan ubiquitinerede proteiner anvendes som substrater til in vitro deubiquitination assay. En screening med høj kapacitet kan udføres for at identificere specifikke DUB'er for målproteiner ved at inkubere allestedsnærværende substrater med individuelle DUB'er. Ubiquitinerede proteiner kan fungere som et stillads for at rekruttere nedstrøms signalproteiner i celler. Et allestedsnærværende målproteinkompleks kan oprenses ved sekventiel immunoprecipitation under native oprensningsbetingelser og identificeres ved massespektrometri. Den nuværende protokol kan i vid udstrækning bruges til at undersøge de cellulære proteiner reguleret af ubiquitination.
Flere metoder er blevet etableret til at rense ubiquitinerede proteiner, som omfatter brugen af affinitetsmærkede ubiquitin, ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerede ubiquitinbindende domæner (UBD'er)17. Her leverer vi en protokol, der bruger affinitetsmærket ubiquitin som mediator til at rense allestedsnærværende proteiner i pattedyrceller. Brugen af poly-his-tagged ubiquitin giver fordele i forhold til de andre metoder. Ubiquitinerede proteiner oprenses i nærvær af stærke denatureringsmidler, hvilket reducerer ikke-specifik binding til nikkelladet harpiks ved linearisering af cellulære proteiner og forstyrrende protein-proteininteraktioner. I modsætning hertil kan brugen af ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerede UBD'er som mediatorer ikke effektivt udelukke bindende partnere fra målprotein, fordi oprensning skal udføres under mindre strenge betingelser. Desuden kan oprensning også føre til øget binding af ikke-relaterede proteiner ved anvendelse af disse mediatorer. Derudover er der en bindingstilbøjelighed til forskellige ubiquitinbindingstyper samt mono- og poly-ubiquitination ved ubiquitinbindende proteiner eller isolerede UBD'er17. Brugen af poly-his-tagged ubiquitin bidrager til at trække ned alle cellubiquitinerede proteiner. Alternativt gør brugen af kommercielt tilgængelig anti-Flag eller anti-HA antistofkonjugeret agarose det lettere at immunprecipitate store flag- eller HA-mærkede målproteiner under ikke-denaturerende forhold. Et andet oprensningstrin, for eksempel ved nikkelladet harpiks rettet mod poly-his-mærket ubiquitin, kan bruges til at erhverve ubiquitinerede målproteiner med en høj renhed til downstream-eksperimenter. Især kan en epitopmærkningsrensningsstrategi tilpasses, når et specifikt antistof ikke kan erhverves effektivt til immunoprecipitate målproteiner. Endelig bevarer oprensning af allestedsnærværende proteiner i pattedyrceller sammenlignet med oprensning in vitro ubiquitinbindingstilstanden for målproteiner under mere fysiologiske forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

Ubiquitination er en type posttranslationel modifikation, der ikke kun regulerer stabiliteten, men også lokaliseringen og funktionen af et substratprotein. Ubiquitinationsprocessen forekommer intracellulært i eukaryoter og regulerer næsten alle grundlæggende cellulære biologiske processer. Oprensning af allestedsnærværende proteiner hjælper undersøgelsen af ubiquitinationens rolle i at kontrollere funktionen af substratproteiner. Her beskrives en trinvis procedure til oprensning af allestedsnærværende proteiner i pattedyrceller med p53 tumorundertrykkende protein som et eksempel. Ubiquitinerede p53-proteiner blev oprenset under strenge ikke-denaturerende og denaturerende betingelser. Total cellulær Flag-mærket p53-protein blev oprenset med anti-Flag antistofkonjugeret agarose under ikke-denaturerende forhold. Alternativt blev det samlede cellulære his-mærkede ubiquitinerede protein oprenset ved anvendelse af nikkelladet harpiks under denatureringsbetingelser. Ubiquitinerede p53-proteiner i eluaterne blev med succes påvist med specifikke antistoffer. Ved hjælp af denne procedure kan de allestedsnærværende former for et givet protein effektivt oprenses fra pattedyrceller, hvilket letter undersøgelser af ubiquitinationens roller i reguleringen af proteinfunktionen.

Det skematiske diagram viser de flagmærkede p53 (Flag-p53) og his/HA dobbeltmærkede ubiquitin (HH-Ub) proteiner (figur 1A). De procedurer, der anvendes til at rense allestedsnærværende proteiner, er opsummeret i figur 1B. Poly-His-tagged ubiquitin kan ligeres til at målrette proteiner i pattedyrceller. Ubiquitinerede proteiner kan renses med Flag/M2 perler under ikke-denaturerende forhold eller ved immobiliseret metalionaffinitetskromatografi (IMAC) under d...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Protokollen beskriver en trinvis metode til at rense allestedsnærværende proteiner fra pattedyrceller ved hjælp af p53 tumorundertrykkende protein som et eksempel. Ubiquitinerede p53-proteiner blev oprenset fra celler under strenge ikke-denaturerende og denaturerende betingelser.

Oprensning af allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Ved hjælp af denne protokol kan de allestedsnærværende former for et givet protein effektivt renses fra pattedyrceller, hvilket letter undersøgelser af ubiquitinationens roller i reguleringen af proteinfunktionen. Oprensning af ubiquitinerede proteiner i pattedyrceller i sammenligning med oprensningen in vitro bevarer ubiquitinbindingstilstanden for målproteiner under mere radiologisk tilstand. Begynd med at tilføje 1,5 ml reduceret serummedium i tre 15 ml centrifugerør.Tilsæt plasmid-DNA klar til transfektion til hvert rør, og tilsæt 0,2 mikrogram grønt fluorescerende proteinplasmid for at overvåge transfektionseffektiviteten. Tilsæt 78 mikroliter liposomtransfektionsreagens til 4,5 ml reduceret serummedium i et andet centrifugerør for at fortynde liposomerne. Bland grundigt ved at svirpe røret og lad det derefter stå i fem minutter ved stuetemperatur.Der tilsættes 1,5 ml af den fortyndede liposomopløsning i hvert rør indeholdende 1,5 ml af den fortyndede DNA-opløsning. Bland grundigt og krydsforbind plasmider med liposomerne i mindst 20 minutter ved stuetemperatur. Kassér det originale medium fra petriskålene og tilsæt ni milliliter af det reducerede serummedium i hver skål.Tilsæt tre milliliter liposom-DNA-blandingen og bland opløsningen ved forsigtigt at ryste pladen frem og tilbage tre gange og derefter til venstre og højre tre gange for jævn fordeling af blandingen på pladen. Kultur cellerne i den befugtede inkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Udskift mediet efter fire til seks timer og fortsæt med at dyrke cellerne i 24 til 36 timer.Efter 24 til 36 timer behandles cellerne med MG132 i en endelig koncentration på 10 mikromolære i fire til seks timer. Kassér mediet og vask cellerne to gange med iskold PBS. Tilsæt en milliliter PBS til skålen.Fjern cellerne ved at skrabe dem med en ren skraber og overfør cellesuspensionen til mikrocentrifugerør. Centrifuge ved 700 G i fem minutter for at opsamle cellepillerne. Tilsæt 800 mikroliter af den iskolde FLAG-lysisbuffer suppleret med proteasehæmmercocktail til cellerne i hvert rør.Bland cellerne ved hjælp af en hvirveloscillator eller en pipettepistol, og inkuber derefter blandingen på en rotator ved fire grader Celsius i 30 minutter. Ultralyd blandingen på isen med hver puls, der varer et sekund, og udsæt blandingen for fem til 10 korte impulser. Inkuber blandingen på en rotator ved 40 o / min i 30 minutter ved fire grader Celsius.Derefter centrifugeres de ultralydede prøver ved 8.000 G i 20 til 30 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør. Aliquot 80 mikroliter af celleekstraktet og bland med 20 mikroliter 5X SDS-indlæsningsbuffer.Kog prøverne ved 98 grader Celsius i fem minutter. Afkøles på is i to minutter og opbevares ved minus 20 grader Celsius indtil brug. Brug disse prøver som inputgruppe til at overvåge proteinekspression.Derefter tilsættes 30 mikroliter af anti-FLAG M2-antistofkonjugerede perler til de resterende celleekstrakter og inkuberes på en rotator ved fire grader Celsius i mindst fire timer eller natten over. Centrifuge ved 1.500 G i to minutter ved fire grader Celsius for at samle perlerne. Tilsæt en milliliter af den iskolde FLAG-lysisbuffer til perlerne og bland ved at vende røret flere gange.Gentag dette trin fire til seks gange, og tilsæt derefter 40 mikroliter FLAG-peptider i en endelig koncentration på 200 nanogram pr. mikroliter til perlerne. Inkuberes på en rotator i to timer som vist tidligere og centrifugeres derefter ved samme temperatur. Overfør supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør og tilsæt 10 mikroliter 5X SDS-påfyldningsbuffer.Kog blandingen ved 98 grader Celsius i fem minutter og afkøl den derefter på is i to minutter. Tilsæt en milliliter af den iskolde PBS til cellepillerne og bland jævnt. Aliquot 100 mikroliter af cellesuspensionen i et mikrocentrifugerør som inputprøve og centrifuge ved 700 G i fem minutter ved fire grader Celsius for at opsamle cellepillerne.Tilsæt 80 mikroliter FLAG-lysisbuffer til inputprøven og bland cellerne ved hjælp af en hvirveloscillator som vist tidligere. Lys cellerne på is i en time og centrifuger derefter igen i 20 til 30 minutter. Efter centrifusion aliquot tilsættes 80 mikroliter supernatant i et nyt mikrocentrifugerør, og der tilsættes 20 mikroliter 5X SDS-påfyldningsbuffer til supernatanten.Kog blandingen ved 98 grader Celsius i fem til 10 minutter og afkøles derefter på is i to minutter. Centrifuge de resterende 900 mikroliter af cellesuspensionen ved 700 G i fem minutter ved fire grader Celsius for at opsamle cellepellet. Tilsæt en milliliter ubiquitinbuffer 1 til cellepillerne og bland ved at pipettere op og ned flere gange for at fordele cellerne jævnt.Udsæt cellelysaterne for 10 til 20 runder ultralydbehandling på is, indtil opløsningen ikke længere er viskøs, og centrifuger derefter opløsningen. Overfør supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør og tilsæt 30 mikroliter nikkelladet harpiks til supernatanten. Inkuberes på en rotator ved 15 o / min i fire timer eller natten over ved stuetemperatur og centrifugeres derefter i to minutter.Efter centrifusion samles perlerne og tilsættes en milliliter ubiquitinbuffer 1 til den. Inkuberes med rotation i en ryster i 10 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres derefter igen ved 1.500 G i to minutter, som vist tidligere. Tilsæt en milliliter ubiquitinbuffer 2 til perlerne og udfør inkubation efterfulgt af centrifugering, som vist tidligere, for at samle perlerne.Gentag dette trin én gang. Derefter tilsættes en milliliter PBS til perlerne og følger den samme procedure for inkubation og centrifugering for at indsamle perlerne. Gentag dette trin igen.Elute bundne proteiner ved at inkubere perlerne med 40 mikroliter imidazol i en endelig koncentration på 0,5 molar i en time ved stuetemperatur. Efter inkubation centrifugeres igen ved 1.500 G i to minutter. Overfør supernatanten til et rent mikrocentrifugerør og tilsæt 10 mikroliter 5X SDS-påfyldningsbuffer.Kog opløsningen ved 98 grader Celsius i fem minutter, og afkøl den derefter på is i to minutter. Løs prøverne med SDS-PAGE, og overfør dem derefter til en nitrocellulosemembran ved western blotting for at detektere målproteiner ved hjælp af de tilsvarende antistoffer. Start kemiluminescensbilleddannelsessystemet for at detektere signaler fra western blotting.Placer nitrocellulosemembranen i camera obscura med forsiden opad. Kod substratopløsningen jævnt på membranen ved hjælp af en pipettepistol. Endelig skal du vælge den automatiske eksponeringsprocedure for at fange de kemiluminescerende signaler og manuelt justere eksponeringstiden, indtil der opnås et ideelt signal.Det samlede p53-protein, herunder ubiquitineret p53, blev immunpræciperet med FLAG M2-perler fra H1299-celler under ikke-denaturerende forhold. Eluatet blev udsat for western blotting med anti p53 og anti hæmagglutinin eller med anti p53 og monoklonale antistoffer. Her blev råcelleekstrakterne eller input udsat for western blotting med anti p53 og anti MDM2 monoklonale antistoffer.Signalet fra det allestedsnærværende p53-protein, der fremstår som et udtværet bånd fra lav til høj molekylvægt, blev markant forøget, da MDM2 blev ekskopisk udtrykt i disse celler. Dette resultat tyder på, at det allestedsnærværende p53-protein er blevet effektivt oprenset fra celler. Dernæst blev cellerne lyset under denatureringsforhold.De samlede cellubiquitinerede proteiner blev trukket ned med nikkelladet harpiks og blev derefter udsat for western blotting med anti p53 og anti hæmagglutinin monoklonale antistoffer. Ubiquitineret p53-protein blev påvist ved anvendelse af et anti-p53-antistof og et antihæmagglutinin-antistof. Her ved råcelleekstrakterne eller input blev udsat for western blotting med anti p53 og anti MDM2 monoklonale antistoffer.Resultaterne viste, at det samlede ubiquitinerede proteinniveau var uændret, men det allestedsnærværende p53-proteinniveau blev dramatisk øget, efter at MDM2 blev overudtrykt i disse celler. Dette indikerer, at de samlede ubiquitinproteiner indeholdende ubiquitineret p53 effektivt blev trukket ned fra cellelysater under denatureringsbetingelser. Når du forsøger denne procedure, skal du huske at behandle cellerne med MG132 før celleopsamling og ultralydbehandle cellerne korrekt på is til oprensning af allestedsnærværende proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Oprensning af biotinylerede celleoverfladeproteiner fra<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rensning af hepatocytter og sinusformet endotelceller fra mus lever Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Proteinekspression og -oprensning af pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversættelse af Ribosome affinitets rensning (TRAP) for RNA-isolation fra endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Hurtig vurdering af membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelseseksklusionskromatografi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstraktion af modificerede mikrotubuli fra pattedyrceller til undersøgelse af mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...