Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (81972624) aan D.L.

OPMERKING: H1299-cellen werden vriendelijk verstrekt door de Stamcelbank, Chinese Academie van Wetenschappen en bleken negatief te zijn voor mycoplasmabesmetting.
1. Celkweek
<ol><li>Plaats voor de initiële cultuur 1 x 106 cellen van menselijke longadenocarcinoomcellijn, H1299 in een petrischaaltje van 10 cm met 10-12 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% glutamineadditief, 1% natriumpyruvaat en antibiotica (100 U / ml penicilline en...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions.">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li><li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling.">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li><li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

Ubiquitinatie speelt een cruciale rol in bijna alle fysiologische en pathologische cellulaire processen2. In de afgelopen jaren is grote vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de moleculaire rol van ubiquitine in signaalroutes en hoe veranderingen in het ubiquitinesysteem leiden tot verschillende menselijke ziekten2. De zuivering van ubiquitinated eiwitten draagt bij aan het inzichtelijk maken van de exacte rollen van ubiquitinatie in deze processen. De mengsels van ubiq...

Ubiquitine is een evolutionair geconserveerd eiwit van 76 aminozuren 1,2,3. Ubiquitine bindt covalent lysineresiduen op doeleiwitten door middel van cascades met activerende (E1), conjugaterende (E2) en ligase (E3) enzymen. Ubiquitine wordt eerst geactiveerd door het E1-enzym en wordt vervolgens overgebracht naar de E2-conjugaterende enzymen. Vervolgens interageren E3-ubiquitine-ligases met zowel ubiquitine-geladen E2-enzymen als substraateiwitten en bemiddelen ze de vorming van een isopeptidebinding tussen de C-terminal van ubiquitine en een lysineresidu in het substraat 1,2,3,4,5. Ubiquitinatie omvat de aanhechting van ubiquitine moieties aan lysineresiduen op substraateiwitten of aan zichzelf, wat leidt tot eiwitmonoubiquitinatie of polyubiquitinatie. Dit ubiquitinatieproces vindt intracellulair plaats in eukaryoten en reguleert een grote verscheidenheid aan biologische processen. Ubiquitinatie resulteert in de afbraak van substraateiwitten via het ubiquitine-proteasoomsysteem 1,2,3,4,5. Bovendien moduleert ubiquitinatie eiwitsubcellulaire lokalisatie, eiwitcomplexvorming en eiwithandel in cellen 3,5. Ubiquitine moieties die aan substraateiwitten zijn toegevoegd, kunnen worden verwijderd door deubiquitinerende enzymen (DUB's)6,7. Met name de verschillende manieren waarop ubiquitineketens worden samengesteld, bieden een groot aantal middelen om verschillende biologische processen te reguleren 1,5. De exacte rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de substraateiwitfunctie blijft tot nu toe onvolledig begrepen. De zuivering van ubiquitinated eiwitten draagt bij aan de opheldering van de effecten van eiwitubiquitinatie op een verscheidenheid aan cellulaire processen.
Het p53-eiwit is een van de belangrijkste tumorsuppressorgeiwitten en vertoont genetische mutaties of inactivatie bij bijna alle menselijke kankers 8,9,10,11. p53 stabiliteit en activiteit worden in vivo subtiel gereguleerd door posttranslationele modificaties, waaronder ubiquitinatie, fosforylering, acetylering en methylatie12,13. Het p53-eiwit heeft een korte halfwaardetijd variërend van 6 min tot 40 minuten in verschillende cellen, wat voornamelijk het gevolg is van de polyubiquitinatie en daaropvolgende proteasomale afbraak10,12. Muis dubbele minuut 2 (Mdm2) is een E3 ubiquitine ligase van p53 dat bindt aan de N-terminus van p53 om zijn transcriptionele activiteit te remmen 12,14,15. Mdm2 bevordert de polyubiquitinatie en proteasomale afbraak van p53 om de stabiliteit ervan te beheersen en induceert monoubiquitinatie van p53 om de nucleaire export te vergemakkelijken 12,14,15,16. Hier wordt Mdm2-gemedieerde p53-ubiquitinatie als voorbeeld gebruikt om een methode voor de zuivering van ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen in detail te introduceren. De regulatoren die de ubiquitinatiestatus van doeleiwitten beïnvloeden, kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze in vivo ubiquitinatietest wanneer ze overexpressie hebben of worden neergeslagen / uitgeschakeld in zoogdiercellen. Bovendien kunnen ubiquitinated eiwitten worden gebruikt als substraten voor in vitro deubiquitinatietest. Een high-throughput screening kan worden uitgevoerd om specifieke DUB's voor doeleiwitten te identificeren door ubiquitinated substraten te incuberen met individuele DUB's. Ubiquitinated eiwitten kunnen fungeren als een steiger om downstream signaaleiwitten in cellen te rekruteren. Een alomtegenwoordig doeleiwitcomplex kan worden gezuiverd door sequentiële immunoprecipitatie onder inheemse zuiveringsomstandigheden en worden geïdentificeerd door massaspectrometrie. Het huidige protocol kan uitgebreid worden gebruikt om de cellulaire eiwitten te onderzoeken die worden gereguleerd door ubiquitinatie.
Er zijn verschillende methoden vastgesteld om ubiquitinated eiwitten te zuiveren, waaronder het gebruik van affiniteit-tagged ubiquitine, ubiquitine-antilichamen, ubiquitine-bindende eiwitten en geïsoleerde ubiquitine-bindende domeinen (UBD's)17. Hier bieden we een protocol met behulp van affiniteit-gelabeld ubiquitine als een mediator om ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen te zuiveren. Het gebruik van poly-His-tagged ubiquitine biedt voordelen ten opzichte van de andere methoden. Ubiquitinated eiwitten worden gezuiverd in de aanwezigheid van sterke denaturanten, die niet-specifieke binding aan nikkel-geladen hars verminderen door cellulaire eiwitten te lineariseren en eiwit-eiwitinteracties te verstoren. Daarentegen kan het gebruik van ubiquitine-antilichamen, ubiquitine-bindende eiwitten en geïsoleerde URD's als mediatoren bindende partners niet effectief uitsluiten van doeleiwit omdat zuivering onder minder strenge voorwaarden moet worden uitgevoerd. Bovendien kan zuivering ook leiden tot een verhoogde binding van niet-gerelateerde eiwitten met behulp van deze mediatoren. Bovendien is er een bindende neiging voor verschillende ubiquitine-koppelingstypen en mono- en poly-ubiquitinatie door ubiquitine-bindende eiwitten of geïsoleerde UBD's17. Het gebruik van poly-His-tagged ubiquitine draagt bij aan het naar beneden halen van alle cellulaire ubiquitinated eiwitten. Als alternatief maakt het gebruik van in de handel verkrijgbare anti-Flag of anti-HA antilichaam-geconjugeerde agarose het gemakkelijker om grootschalige Flag- of HA-gelabelde doeleiwitten onder niet-condenserende omstandigheden te immunopreciperen. Een tweede zuiveringsstap, bijvoorbeeld door nikkel-geladen hars gericht op poly-His-tagged ubiquitine, kan worden gebruikt om ubiquitinated doeleiwitten met een hoge zuiverheid te verkrijgen voor downstream experimenten. Met name een epitoop tagging zuiveringsstrategie kan worden aangepast wanneer een specifiek antilichaam niet kan worden verkregen om doeleiwitten effectief te immunoprecipitaat. Ten slotte behoudt de zuivering van ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen, in vergelijking met zuivering in vitro, de ubiquitine-koppelingsmodus van doeleiwitten onder meer fysiologische omstandigheden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

Ubiquitinatie is een soort posttranslationele modificatie die niet alleen de stabiliteit reguleert, maar ook de lokalisatie en functie van een substraateiwit. Het ubiquitinatieproces vindt intracellulair plaats in eukaryoten en reguleert bijna alle basale cellulaire biologische processen. Zuivering van ubiquitinated eiwitten helpt bij het onderzoek naar de rol van ubiquitinatie bij het beheersen van de functie van substraateiwitten. Hier wordt een stapsgewijze procedure beschreven om ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen te zuiveren met het p53 tumorsuppressorgeiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd onder strenge niet-denaturerende en denaturerende omstandigheden. Totaal cellulair Flag-tagged p53-eiwit werd gezuiverd met anti-Flag antilichaam-geconjugeerde agarose onder niet-denaturerende omstandigheden. Als alternatief werd het totale cellulaire His-tagged ubiquitinated eiwit gezuiverd met behulp van nikkel-geladen hars onder denatureringsomstandigheden. Ubiquitinated p53-eiwitten in de eluaten werden met succes gedetecteerd met specifieke antilichamen. Met behulp van deze procedure kunnen de alomtegenwoordige vormen van een bepaald eiwit efficiënt worden gezuiverd uit zoogdiercellen, waardoor studies naar de rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de eiwitfunctie worden vergemakkelijkt.

Het schematische diagram toont de Flag-tagged p53 (Flag-p53) en His/HA double-tagged ubiquitine (HH-Ub) eiwitten (Figuur 1A). De procedures die worden gebruikt om ubiquitinated eiwitten te zuiveren zijn samengevat in figuur 1B. Poly-His-tagged ubiquitine kan worden geligeerd om eiwitten in zoogdiercellen te targeten. Ubiquitinated proteins kunnen worden gezuiverd met Flag/M2-kralen onder niet-aturerende omstandigheden of door geïmmobiliseerde metaalionaffinitei...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen te zuiveren met behulp van het p53 tumor suppressor-eiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd uit cellen onder strenge niet-condenserende en denaturerende omstandigheden.

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Met behulp van dit protocol kunnen de alomtegenwoordige vormen van een bepaald eiwit efficiënt worden gezuiverd uit zoogdiercellen, waardoor studies naar de rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de eiwitfunctie worden vergemakkelijkt. Zuivering van alomtegenwoordige eiwitten in zoogdiercellen in vergelijking met de zuivering in vitro behoudt de ubiquitine-koppelingsmodus van doeleiwitten onder meer radiologische omstandigheden. Begin met het toevoegen van 1,5 milliliter gereduceerd serummedium in drie centrifugebuizen van 15 milliliter.Voeg plasmide-DNA toe dat klaar is voor transfectie aan elke buis en voeg 0,2 microgram groen fluorescerend eiwitplasmide toe om de transfectie-efficiëntie te controleren. Voeg 78 microliter liposoomtransfectiereagens toe aan 4,5 milliliter gereduceerd serummedium in een andere centrifugebuis om de liposomen te verdunnen. Meng grondig door met de buis te vegen en laat hem vervolgens vijf minuten op kamertemperatuur staan.Voeg 1,5 milliliter van de verdunde liposoomoplossing toe aan elke buis die 1,5 milliliter van de verdunde DNA-oplossing bevat. Meng grondig en kruis de plasmiden met de liposomen gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het originele medium uit de petrischalen weg en voeg negen milliliter van het gereduceerde serummedium toe aan elke schaal.Voeg drie milliliter van het liposoom DNA-mengsel toe en meng de oplossing door de plaat drie keer voorzichtig heen en weer te schudden en vervolgens drie keer links en rechts voor een gelijkmatige verdeling van het mengsel op de plaat. Kweek de cellen in de bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Vervang het medium na vier tot zes uur en blijf de cellen gedurende 24 tot 36 uur kweken.Behandel de cellen na 24 tot 36 uur met MG132 in een eindconcentratie van 10 micromolair gedurende vier tot zes uur. Gooi het medium weg en was de cellen twee keer met ijskoude PBS. Voeg een milliliter PBS toe aan het gerecht.Verwijder de cellen door ze te schrapen met een schone schraper en breng de celsuspensie over in microcentrifugebuizen. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 700 G om de celpellets te verzamelen. Voeg 800 microliter ijskoude FLAG-lysisbuffer aangevuld met proteaseremmercocktail toe aan de cellen in elke buis.Meng de cellen met behulp van een vortexoscillator of een pipetpistool en incubeer het mengsel vervolgens gedurende 30 minuten op een rotator bij vier graden Celsius. Ultrasoon het mengsel op het ijs met elke puls die een seconde duurt en onderwerp het mengsel aan vijf tot 10 korte pulsen. Incubeer het mengsel op een rotator bij 40 RPM gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.Centrifugeer vervolgens de ultrasone monsters op 8.000 G gedurende 20 tot 30 minuten bij vier graden Celsius. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis. Aliquot 80 microliter van de cel extract en meng met 20 microliter 5X SDS laadbuffer.Kook de monsters vijf minuten op 98 graden Celsius. Laat twee minuten afkoelen op ijs en bewaar bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Gebruik deze monsters als invoergroep om de eiwitexpressie te controleren.Voeg vervolgens 30 microliter van de anti-FLAG M2 antilichaam geconjugeerde kralen toe aan de resterende celextracten en incubeer op een rotator bij vier graden Celsius gedurende ten minste vier uur of een nacht. Centrifugeer op 1.500 G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius om de kralen te verzamelen. Voeg een milliliter van de ijskoude FLAG lysis buffer toe aan de kralen en meng door de buis meerdere keren om te keren.Herhaal deze stap vier tot zes keer en voeg vervolgens 40 microliter van de FLAG-peptiden met een uiteindelijke concentratie van 200 nanogram per microliter toe aan de kralen. Incubeer op een rotator gedurende twee uur zoals eerder getoond en centrifugeer vervolgens bij dezelfde temperatuur. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 10 microliter 5X SDS-laadbuffer toe.Kook het mengsel vijf minuten op 98 graden Celsius en laat het vervolgens twee minuten op ijs afkoelen. Voeg een milliliter van de ijskoude PBS toe aan de celkorrels en meng gelijkmatig. Aliquot 100 microliter van de celsuspensie in een microcentrifugebuis als invoermonster en centrifugeer bij 700 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om de celpellets te verzamelen.Voeg 80 microliter FLAG-lysisbuffer toe aan het invoermonster en meng de cellen met behulp van een vortexoscillator zoals eerder weergegeven. Laat de cellen een uur op ijs liggen en centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende 20 tot 30 minuten. Na centrifusie aliquot 80 microliter van het supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 20 microliter 5X SDS-laadbuffer toe aan het supernatant.Kook het mengsel vijf tot 10 minuten op 98 graden Celsius en laat het vervolgens twee minuten afkoelen op ijs. Centrifugeer de resterende 900 microliter van de celsuspensie bij 700 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om de celpellet te verzamelen. Voeg een milliliter ubiquitinebuffer 1 toe aan de celpellets en meng door meerdere keren op en neer te pipetteren om de cellen gelijkmatig te verdelen.Onderwerp de cellysaten aan 10 tot 20 rondes ultrasoon geluid op ijs totdat de oplossing niet langer stroperig is en centrifugeer vervolgens de oplossing. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 30 microliter nikkel geladen hars toe aan het supernatant. Incubeer op een rotator bij 15 RPM gedurende vier uur of 's nachts bij kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten.Verzamel na centrifusie de kralen en voeg er een milliliter ubiquitinebuffer 1 aan toe. Incubeer met rotatie in een shaker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens opnieuw op 1.500 G gedurende twee minuten, zoals eerder getoond. Voeg een milliliter ubiquitinebuffer 2 toe aan de kralen en voer incubatie uit, gevolgd door centrifugatie, zoals eerder getoond, om de kralen te verzamelen.Herhaal deze stap eenmaal. Voeg vervolgens een milliliter PBS toe aan de kralen en volg dezelfde procedure voor incubatie en centrifugatie om de kralen te verzamelen. Herhaal deze stap nogmaals.Elute gebonden eiwitten door de kralen te incuberen met 40 microliter imidazool in een eindconcentratie van 0,5 molair gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na incubatie opnieuw centrifugeren op 1.500 G gedurende twee minuten. Breng het supernatant over in een schone microcentrifugebuis en voeg 10 microliter 5X SDS-laadbuffer toe.Kook de oplossing vijf minuten op 98 graden Celsius en laat hem vervolgens twee minuten op ijs afkoelen. Los de monsters op door SDS-PAGE en breng ze vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan door western blotting om doeleiwitten te detecteren met behulp van de bijbehorende antilichamen. Start het chemiluminescentiebeeldvormingssysteem om signalen van western blotting te detecteren.Plaats het nitrocellulosemembraan in de camera obscura met de voorkant naar boven. Codeer de substraatoplossing gelijkmatig op het membraan met behulp van een pipetpistool. Selecteer ten slotte de automatische belichtingsprocedure om de chemiluminescente signalen op te vangen en pas de belichtingstijd handmatig aan totdat een ideaal signaal is verkregen.Totaal p53-eiwit, inclusief ubiquitinated p53, werd immunoprecipitated met FLAG M2-kralen uit H1299-cellen onder niet-denaturerende omstandigheden. Het eluaat werd onderworpen aan western blotting met anti p53 en anti hemagglutinine of met anti p53 en monoklonale antilichamen. Hier werden de ruwe celextracten of input onderworpen aan western blotting met anti p53 en anti MDM2 monoklonale antilichamen.Het signaal van het alomtegenwoordige p53-eiwit dat verschijnt als een uitgesmeerde band van laag naar hoog molecuulgewicht werd aanzienlijk verhoogd wanneer MDM2 ectopisch tot expressie kwam in deze cellen. Dit resultaat suggereert dat het ubiquitinated p53-eiwit effectief uit cellen is gezuiverd. Vervolgens werden de cellen gelyseerd onder denaturerende omstandigheden.De totale cellulaire ubiquitinated eiwitten werden naar beneden getrokken met nikkel geladen hars en werden vervolgens onderworpen aan western blotting met anti p53 en anti-hemagglutinine monoklonale antilichamen. Ubiquitinated p53-eiwit werd gedetecteerd met behulp van een anti p53-antilichaam en een anti-hemagglutinine-antilichaam. Hier bij de ruwe cel werden extracten of input onderworpen aan western blotting met anti p53 en anti MDM2 monoklonale antilichamen.De resultaten toonden aan dat het totale ubiquitinated eiwitniveau onveranderd was, maar het ubiquitinated p53-eiwitniveau was dramatisch verhoogd nadat MDM2 in deze cellen overexpressie had gehad. Dit geeft aan dat de totale ubiquitine-eiwitten die ubiquitinated p53 bevatten, effectief uit cellysaten werden gehaald onder denatureringsomstandigheden. Wanneer u deze procedure probeert, vergeet dan niet om de cellen te behandelen met MG132 vóór het verzamelen van cellen en de cellen goed op ijs te ultrasoon te maken voor de zuivering van alomtegenwoordige eiwitten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitheliale darmcellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Snelle beoordeling van de kwaliteit van membraaneiwitten door fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Het extraheren van gemodificeerde microtubuli uit zoogdiercellen om microtubuli-eiwitcomplexen te bestuderen door cryo-elektronenmicroscopie

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...