Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81972624) à D.L.

REMARQUE: Les cellules H1299 ont été aimablement fournies par la Banque de cellules souches de l’Académie chinoise des sciences et se sont révélées négatives pour la contamination par les mycoplasmes.
1. Culture cellulaire
<ol><li>Pour la culture initiale, placer 1 x 106 cellules de lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire humain, H1299 dans une boîte de Petri de 10 cm avec 10-12 mL de milieu RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal (...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

L’ubiquitination joue un rôle essentiel dans presque tous les processus cellulaires physiologiques et pathologiques2. Ces dernières années, de grands progrès ont été réalisés dans la compréhension du rôle moléculaire de l’ubiquitine dans les voies de signalisation et de la façon dont les changements dans le système ubiquitine conduisent à différentes maladies humaines2. La purification des protéines ubiquitinées contribue à fournir un aperçu des rôle...

L’ubiquitine est une protéine conservée au cours de l’évolution de 76 acides aminés 1,2,3. L’ubiquitine se lie de manière covalente aux résidus de lysine sur les protéines cibles par des cascades impliquant des enzymes activatrices (E1), conjuguées (E2) et ligases (E3). L’ubiquitine est d’abord activée par l’enzyme E1, puis transférée aux enzymes conjuguées E2. Par la suite, E3 ubiquitin ligases interagit à la fois avec les enzymes E2 chargées d’ubiquitine et les protéines de substrat et médie la formation d’une liaison isopeptidique entre le C-terminal de l’ubiquitine et un résidu de lysine dans le substrat 1,2,3,4,5. L’ubiquitination implique la fixation de fractions ubiquitine à des résidus de lysine sur des protéines substrats ou à elle-même, conduisant à une monoubiquitination ou une polyubiquitination des protéines. Ce processus d’ubiquitination se produit intracellulaire chez les eucaryotes et régule une grande variété de processus biologiques. L’ubiquitination entraîne la dégradation des protéines du substrat via le système ubiquitine-protéasome 1,2,3,4,5. De plus, l’ubiquitination module la localisation subcellulaire des protéines, la formation de complexes protéiques et le trafic de protéines dans les cellules 3,5. Les fractions ubiquitine ligaturées sur les protéines substrat peuvent être éliminées par des enzymes déubiquitinantes (DUB)6,7. Notamment, les différentes façons dont les chaînes ubiquitines sont assemblées fournissent une myriade de moyens pour réguler divers processus biologiques 1,5. Les rôles exacts de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction des protéines du substrat restent incomplètement compris jusqu’à présent. La purification des protéines ubiquitinées contribue à l’élucidation des effets de l’ubiquitination des protéines sur une variété de processus cellulaires.
La protéine p53 est l’une des protéines suppressrices de tumeurs les plus importantes et présente des mutations génétiques ou une inactivation dans presque tous les cancers humains 8,9,10,11. La stabilité et l’activité de P53 sont délicatement régulées in vivo par des modifications post-traductionnelles, y compris l’ubiquitination, la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation12,13. La protéine p53 a une demi-vie courte allant de 6 min à 40 min dans diverses cellules, ce qui résulte principalement de sa polyubiquitination et de sa dégradation protéasomale ultérieure10,12. La souris double minute 2 (Mdm2) est une ubiquitine ligase E3 de p53 qui se lie à l’extrémité N de p53 pour inhiber son activité transcriptionnelle12,14,15. Mdm2 favorise la polyubiquitination et la dégradation protéasomale de p53 pour contrôler sa stabilité et induit une monoubiquitination de p53 pour faciliter son exportation nucléaire12,14,15,16. Ici, l’ubiquitination p53 médiée par Mdm2 est utilisée comme exemple pour introduire une méthode de purification des protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en détail. Les régulateurs qui influencent le statut d’ubiquitination des protéines cibles peuvent être identifiés à l’aide de ce test d’ubiquitination in vivo lorsqu’ils sont surexprimés ou renversés / assommés dans des cellules de mammifères. En outre, les protéines ubiquitinées peuvent être utilisées comme substrats pour le test de déubiquitination in vitro. Un criblage à haut débit peut être effectué pour identifier des DUB spécifiques pour les protéines cibles en incubant des substrats ubiquitinés avec des DUB individuels. Les protéines ubiquitinées peuvent agir comme un échafaudage pour recruter des protéines de signalisation en aval dans les cellules. Un complexe protéique cible ubiquitiné peut être purifié par immunoprécipitation séquentielle dans des conditions de purification natives et identifié par spectrométrie de masse. Le protocole actuel peut être largement utilisé pour étudier les protéines cellulaires régulées par ubiquitination.
Plusieurs méthodes ont été établies pour purifier les protéines ubiquitinées, notamment l’utilisation d’ubiquitine marquée par affinité, d’anticorps ubiquitine, de protéines de liaison à l’ubiquitine et de domaines isolés de liaison à l’ubiquitine (UBD)17. Ici, nous fournissons un protocole utilisant l’ubiquitine marquée par affinité comme médiateur pour purifier les protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères. L’utilisation de l’ubiquitine poly-marquée offre des avantages par rapport aux autres méthodes. Les protéines ubiquitinées sont purifiées en présence de dénaturants puissants, ce qui réduit la liaison non spécifique à la résine chargée de nickel en linéarisant les protéines cellulaires et en perturbant les interactions protéine-protéine. En revanche, l’utilisation d’anticorps ubiquitine, de protéines de liaison à l’ubiquitine et d’UBD isolés comme médiateurs ne peut pas exclure efficacement les partenaires de liaison de la protéine cible, car la purification doit être effectuée dans des conditions moins strictes. De plus, la purification peut également conduire à une liaison accrue de protéines non apparentées à l’aide de ces médiateurs. De plus, il existe une propension à se lier à divers types de liaison ubiquitine ainsi qu’à la mono- et poly-ubiquitination par des protéines de liaison à l’ubiquitine ou des UBD isolés17. L’utilisation de l’ubiquitine poly-marquée contribue à abattre toutes les protéines cellulaires ubiquitinées. Alternativement, l’utilisation d’agarose conjuguée anti-Flag ou anti-HA disponible dans le commerce facilite l’immunoprécipitation de protéines cibles marquées Flag ou HA à grande échelle dans des conditions non dénaturantes. Une deuxième étape de purification, par exemple, par résine chargée de nickel ciblant l’ubiquitine marquée poly-His, peut être utilisée pour acquérir des protéines cibles ubiquitinées d’une grande pureté pour des expériences en aval. Notamment, une stratégie de purification du marquage des épitopes peut être adaptée lorsqu’un anticorps spécifique ne peut pas être acquis pour immunoprécipiter efficacement les protéines cibles. Enfin, la purification des protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères, en comparaison avec la purification in vitro, conserve le mode de liaison ubiquitine des protéines cibles dans des conditions plus physiologiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

L’ubiquitination est un type de modification post-traductionnelle qui régule non seulement la stabilité, mais aussi la localisation et la fonction d’une protéine substrat. Le processus d’ubiquitination se produit intracellulaire chez les eucaryotes et régule presque tous les processus biologiques cellulaires de base. La purification des protéines ubiquitinées aide à étudier le rôle de l’ubiquitination dans le contrôle de la fonction des protéines substrat. Ici, une procédure étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères est décrite avec la protéine suppresseur de tumeur p53 à titre d’exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation. La protéine p53 totale marquée au drapeau cellulaire a été purifiée avec de l’agarose conjuguée à l’anticorps anti-drapeau dans des conditions non dénaturantes. Alternativement, la protéine ubiquitinée totale marquée His cellulaire a été purifiée à l’aide de résine chargée de nickel dans des conditions de dénaturation. Les protéines p53 ubiquitinées dans les éluats ont été détectées avec succès avec des anticorps spécifiques. En utilisant cette procédure, les formes ubiquitinées d’une protéine donnée peuvent être efficacement purifiées à partir de cellules de mammifères, facilitant ainsi les études sur les rôles de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique.

Le diagramme schématique montre les protéines p53 (Flag-p53) et His/HA ubiquitin double-marqué (HH-Ub) (Figure 1A). Les procédures utilisées pour purifier les protéines ubiquitinées sont résumées à la figure 1B. L’ubiquitine marquée par Poly-His peut être ligaturée pour cibler les protéines dans les cellules de mammifères. Les protéines ubiquitinées peuvent être purifiées avec des billes Flag/M2 dans des conditions non dénaturantes ou par c...

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Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Le protocole décrit une méthode étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en utilisant la protéine suppresseur de tumeur p53 comme exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées à partir de cellules dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation.

Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

En utilisant ce protocole, les formes ubiquitinées d’une protéine donnée peuvent être efficacement purifiées à partir de cellules de mammifères, facilitant ainsi les études sur les rôles de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique. La purification des protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères par rapport à la purification in vitro conserve le mode de liaison ubiquitine des protéines cibles dans des conditions plus radiologiques. Commencez par ajouter 1,5 millilitre de milieu sérique réduit dans trois tubes centrifugés de 15 millilitres.Ajouter de l’ADN plasmidique prêt pour la transfection dans chaque tube et ajouter 0,2 microgramme de plasmide de protéine fluorescente verte pour surveiller l’efficacité de la transfection. Ajouter 78 microlitres de réactif de transfection des liposomes à 4,5 millilitres de milieu sérique réduit dans un autre tube de centrifugation pour diluer les liposomes. Bien mélanger en agitant le tube, puis laisser reposer pendant cinq minutes à température ambiante.Ajouter 1,5 millilitre de la solution de liposomes diluée dans chaque tube contenant 1,5 millilitre de la solution d’ADN diluée. Bien mélanger et réticuler les plasmides avec les liposomes pendant au moins 20 minutes à température ambiante. Jetez le milieu d’origine des boîtes de Petri et ajoutez neuf millilitres du milieu sérum réduit dans chaque boîte.Ajouter trois millilitres du mélange d’ADN liposomique et mélanger la solution en secouant doucement la plaque d’avant en arrière trois fois, puis à gauche et à droite trois fois pour une répartition uniforme du mélange sur la plaque. Culture des cellules dans l’incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Remplacez le milieu après quatre à six heures et continuez à cultiver les cellules pendant 24 à 36 heures.Après 24 à 36 heures, traiter les cellules avec MG132 à une concentration finale de 10 micromolaires pendant quatre à six heures. Jetez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS glacé. Ajouter un millilitre de PBS au plat.Retirez les cellules en les grattant avec un racleur propre et transférez la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation. Centrifuger à 700 G pendant cinq minutes pour recueillir les pastilles de cellule. Ajouter 800 microlitres du tampon de lyse FLAG glacé complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase aux cellules de chaque tube.Mélangez les cellules à l’aide d’un oscillateur vortex ou d’un pistolet à pipette, puis incuber le mélange sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ultrasons le mélange sur la glace avec chaque impulsion d’une seconde et soumettez le mélange à cinq à 10 impulsions brèves. Incuber le mélange sur un rotateur à 40 RPM pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, centrifuger les échantillons ultrasoniques à 8 000 G pendant 20 à 30 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifugeux. Aliquote 80 microlitres de la cellule extraire et mélanger avec 20 microlitres de tampon de chargement 5X SDS.Faites bouillir les échantillons à 98 degrés Celsius pendant cinq minutes. Laisser refroidir sur la glace pendant deux minutes et conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Utilisez ces échantillons comme groupe d’entrée pour surveiller l’expression des protéines.Ensuite, ajoutez 30 microlitres de billes conjuguées d’anticorps anti-FLAG M2 aux extraits cellulaires restants et incuber sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures ou toute la nuit. Centrifuger à 1 500 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir les perles. Ajouter un millilitre du tampon de lyse FLAG glacé aux billes et mélanger en retournant le tube plusieurs fois.Répétez cette étape quatre à six fois, puis ajoutez 40 microlitres des peptides FLAG à une concentration finale de 200 nanogrammes par microlitre aux billes. Incuber sur un rotateur pendant deux heures comme indiqué précédemment, puis centrifuger à la même température. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et ajouter 10 microlitres de tampon de chargement FDS 5X.Faites bouillir le mélange à 98 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez-le sur de la glace pendant deux minutes. Ajouter un millilitre de PBS glacé aux granulés de la cellule et mélanger uniformément. Aliquote 100 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge comme échantillon d’entrée et centrifugation à 700 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir les pastilles de cellule.Ajoutez 80 microlitres de tampon de lyse FLAG à l’échantillon d’entrée et mélangez les cellules à l’aide d’un oscillateur vortex comme indiqué précédemment. Lyser les cellules sur de la glace pendant une heure, puis centrifuger à nouveau pendant 20 à 30 minutes. Après centrifusion, aliquote 80 microlitres du surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge et ajouter 20 microlitres de tampon de chargement 5X SDS au surnageant.Faire bouillir le mélange à 98 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes, puis refroidir sur de la glace pendant deux minutes. Centrifuger les 900 microlitres restants de la suspension cellulaire à 700 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir la pastille de cellule. Ajouter un millilitre de tampon d’ubiquitine 1 aux granulés de cellules et mélanger en pipetant de haut en bas plusieurs fois pour répartir les cellules uniformément.Soumettre les lysats cellulaires à 10 à 20 cycles d’ultrasons sur glace jusqu’à ce que la solution ne soit plus visqueuse, puis centrifuger la solution. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation et ajouter 30 microlitres de résine chargée de nickel au surnageant. Incuber sur un rotateur à 15 tr/min pendant quatre heures ou toute la nuit à température ambiante, puis centrifuger pendant deux minutes.Après centrifusion, recueillir les billes et y ajouter un millilitre de tampon ubiquitine 1. Incuber en rotation dans un agitateur pendant 10 minutes à température ambiante, puis centrifuger à nouveau à 1 500 G pendant deux minutes, comme indiqué précédemment. Ajouter un millilitre de tampon ubiquitine 2 aux billes et effectuer l’incubation suivie d’une centrifugation, comme indiqué précédemment, pour recueillir les billes.Répétez cette étape une fois. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS aux billes et suivez la même procédure d’incubation et de centrifugation pour recueillir les perles. Répétez cette étape une fois de plus.Éluer les protéines liées en incubant les billes avec 40 microlitres d’imidazole à une concentration finale de 0,5 molaire pendant une heure à température ambiante. Après incubation, centrifuger à nouveau à 1 500 G pendant deux minutes. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre et ajouter 10 microlitres de tampon de chargement FDS 5X.Faites bouillir la solution à 98 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez-la sur de la glace pendant deux minutes. Résoudre les échantillons par SDS-PAGE, puis les transférer sur une membrane de nitrocellulose par Western blot pour détecter les protéines cibles à l’aide des anticorps correspondants. Démarrez le système d’imagerie par chimiluminescence pour détecter les signaux du transfert Western.Placez la membrane de nitrocellulose dans la camera obscura face vers le haut. Coder la solution de substrat uniformément sur la membrane à l’aide d’un pistolet à pipette. Enfin, sélectionnez la procédure d’exposition automatique pour capturer les signaux chimioluminescents et ajustez manuellement le temps d’exposition jusqu’à ce qu’un signal idéal soit acquis.La protéine p53 totale, y compris la protéine p53 ubiquitinée, a été immunoprécipitée avec des billes FLAG M2 provenant de cellules H1299 dans des conditions non dénaturantes. L’éluat a été soumis à un Western blot avec des anticorps anti p53 et anti hémagglutinine ou avec des anticorps anti p53 et monoclonaux. Ici, les extraits ou les intrants de cellules brutes ont été soumis à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti p53 et anti MDM2.Le signal de la protéine p53 ubiquitinée, qui apparaît sous la forme d’une bande étalée de faible à haut poids moléculaire, a été nettement augmenté lorsque MDM2 a été exprimé de manière ectopique dans ces cellules. Ce résultat suggère que la protéine p53 ubiquitinée a été efficacement purifiée à partir de cellules. Ensuite, les cellules ont été lysées dans des conditions de dénaturation.Les protéines cellulaires ubiquitinées totales ont été tirées vers le bas avec de la résine chargée de nickel et ont ensuite été soumises à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti p53 et anti-hémagglutinine. La protéine p53 ubiquitinée a été détectée à l’aide d’un anticorps anti p53 et d’un anticorps anti-hémagglutinine. Ici, à la cellule brute, les extraits ou les intrants ont été soumis à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti p53 et anti MDM2.Les résultats ont montré que le niveau total de protéines ubiquitinées était inchangé, mais que le niveau de protéine p53 ubiquitinée était considérablement augmenté après que MDM2 ait été surexprimé dans ces cellules. Cela indique que les protéines totales d’ubiquitine contenant p53 ubiquitinées ont été efficacement retirées des lysats cellulaires dans des conditions de dénaturation. Lorsque vous tentez cette procédure, n’oubliez pas de traiter les cellules avec MG132 avant la collecte cellulaire et d’ultrasons les cellules correctement sur la glace pour la purification des protéines ubiquitinées.

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