Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (81972624) an D.L.

HINWEIS: H1299-Zellen wurden freundlicherweise von der Stammzellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften zur Verfügung gestellt und erwiesen sich als negativ für Mykoplasmenkontamination.
1. Zellkultur
<ol><li>Für die Erstkultur 1 x 106 Zellen der menschlichen Lungenadenokarzinom-Zelllinie, H1299, in eine 10 cm Petrischale mit 10-12 ml RPMI 1640 Medium geben, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Glutaminzusatz, 1% Natriumpyruvat und Antibioti...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. 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J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

Die Ubiquitinierung spielt bei fast allen physiologischen und pathologischen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle2. In den letzten Jahren wurden große Fortschritte beim Verständnis der molekularen Rolle von Ubiquitin in Signalwegen gemacht und wie Veränderungen im Ubiquitin-System zu verschiedenen menschlichen Krankheiten führen2. Die Aufreinigung ubiquitinierter Proteine trägt dazu bei, Einblicke in die genaue Rolle der Ubiquitinierung in diesen Prozessen zu...

Ubiquitin ist ein evolutionär konserviertes Protein aus 76 Aminosäuren 1,2,3. Ubiquitin bindet kovalent Lysinreste an Zielproteine durch Kaskaden mit aktivierenden (E1), konjugierenden (E2) und Ligase (E3) Enzymen. Ubiquitin wird zunächst durch das Enzym E1 aktiviert und dann auf die E2-konjugierenden Enzyme übertragen. Anschließend interagieren E3-Ubiquitin-Ligasen sowohl mit Ubiquitin-beladenen E2-Enzymen als auch mit Substratproteinen und vermitteln die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem C-Terminal von Ubiquitin und einem Lysinrest im Substrat 1,2,3,4,5. Ubiquitinierung beinhaltet die Anlagerung von Ubiquitin-Einheiten an Lysinreste auf Substratproteinen oder an sich selbst, was zu Proteinmonoubiquitinierung oder Polyubiquitinierung führt. Dieser Ubiquitinierungsprozess findet intrazellulär in Eukaryoten statt und reguliert eine Vielzahl biologischer Prozesse. Die Ubiquitinierung führt zum Abbau von Substratproteinen über das Ubiquitin-Proteasom-System 1,2,3,4,5. Darüber hinaus moduliert die Ubiquitinierung die subzelluläre Proteinlokalisation, die Proteinkomplexbildung und den Proteintransport in Zellen 3,5. Ubiquitin-Einheiten, die an Substratproteine gebunden sind, können durch deubiquitinierende Enzyme (DUBs) entfernt werden6,7. Insbesondere bieten die verschiedenen Arten, in denen Ubiquitinketten zusammengesetzt sind, eine Vielzahl von Möglichkeiten, verschiedene biologische Prozesse zu regulieren 1,5. Die genaue Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Substratproteinfunktion ist bisher unvollständig verstanden. Die Aufreinigung ubiquitinierter Proteine trägt zur Aufklärung der Auswirkungen der Proteinubiquitinierung auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse bei.
Das p53-Protein ist eines der wichtigsten Tumorsuppressorproteine und weist bei fast allen menschlichen Krebserkrankungen genetische Mutationen oder Inaktivierungen auf 8,9,10,11. P53-Stabilität und -Aktivität werden in vivo durch posttranslationale Modifikationen, einschließlich Ubiquitinierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung12,13, empfindlich reguliert. Das p53-Protein hat eine kurze Halbwertszeit von 6 min bis 40 min in verschiedenen Zellen, die hauptsächlich aus seiner Polyubiquitinierung und dem anschließenden proteasomalen Abbau resultiert10,12. Maus double minute 2 (Mdm2) ist eine E3-Ubiquitin-Ligase von p53, die an den N-Terminus von p53 bindet, um ihre Transkriptionsaktivität12,14,15 zu hemmen. Mdm2 fördert die Polyubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von p53, um seine Stabilität zu kontrollieren, und induziert die Monoubiquitinierung von p53, um seinen nuklearen Export zu erleichtern12,14,15,16. Hier wird am Beispiel der Mdm2-vermittelten p53-Ubiquitinierung eine Methode zur Aufreinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen im Detail vorgestellt. Die Regulatoren, die den Ubiquitinierungsstatus von Zielproteinen beeinflussen, können mit diesem In-vivo-Ubiquitinierungsassay identifiziert werden, wenn sie in Säugetierzellen überexprimiert oder niedergeschlagen/ausgeschaltet werden. Darüber hinaus können ubiquitinierte Proteine als Substrate für In-vitro-Deubiquitinierungstests verwendet werden. Ein Hochdurchsatz-Screening kann durchgeführt werden, um spezifische DUBs für Zielproteine zu identifizieren, indem ubiquitinierte Substrate mit einzelnen DUBs inkubiert werden. Ubiquitinierte Proteine können als Gerüst fungieren, um nachgeschaltete Signalproteine in Zellen zu rekrutieren. Ein ubiquitinierter Zielproteinkomplex kann durch sequentielle Immunpräzipitation unter nativen Reinigungsbedingungen gereinigt und massenspektrometrisch identifiziert werden. Das aktuelle Protokoll kann umfassend verwendet werden, um die zellulären Proteine zu untersuchen, die durch Ubiquitinierung reguliert werden.
Es wurden mehrere Methoden zur Reinigung ubiquitinierter Proteine etabliert, darunter die Verwendung von affinitätsmarkiertem Ubiquitin, Ubiquitin-Antikörpern, Ubiquitin-bindenden Proteinen und isolierten Ubiquitin-bindenden Domänen (UBDs)17. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das affinitätsmarkiertes Ubiquitin als Mediator verwendet, um ubiquitinierte Proteine in Säugetierzellen zu reinigen. Die Verwendung von poly-His-getaggtem Ubiquitin bietet Vorteile gegenüber den anderen Methoden. Ubiquitinierte Proteine werden in Gegenwart starker Denaturierungsmittel gereinigt, was die unspezifische Bindung an nickelgeladenes Harz reduziert, indem zelluläre Proteine linearisiert und Protein-Protein-Interaktionen gestört werden. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung von Ubiquitin-Antikörpern, Ubiquitin-bindenden Proteinen und isolierten UBDs als Mediatoren Bindungspartner nicht effektiv vom Zielprotein ausschließen, da die Reinigung unter weniger strengen Bedingungen durchgeführt werden muss. Darüber hinaus kann die Reinigung auch zu einer erhöhten Bindung von nicht verwandten Proteinen mit diesen Mediatoren führen. Darüber hinaus besteht eine Bindungsneigung für verschiedene Ubiquitin-Verknüpfungstypen sowie Mono- und Polyubiquitinierung durch Ubiquitin-bindende Proteine oder isolierte UBDs17. Die Verwendung von Poly-His-markiertem Ubiquitin trägt dazu bei, alle zellulären ubiquitinierten Proteine herunterzuziehen. Alternativ erleichtert die Verwendung kommerziell erhältlicher Anti-Flag- oder Anti-HA-Antikörper-konjugierter Agarose die Immunpräzipitation großflächiger Flag- oder HA-markierter Zielproteine unter nicht-denaturierenden Bedingungen. Ein zweiter Reinigungsschritt, beispielsweise durch nickelgeladenes Harz, das auf poly-His-markiertes Ubiquitin abzielt, kann verwendet werden, um ubiquitinierte Zielproteine mit hoher Reinheit für nachgeschaltete Experimente zu gewinnen. Insbesondere kann eine Epitop-Tagging-Reinigungsstrategie angepasst werden, wenn ein spezifischer Antikörper nicht erworben werden kann, um Zielproteine effektiv zu immunpräzipitieren. Schließlich behält die Reinigung ubiquitinierter Proteine in Säugetierzellen im Vergleich zur Reinigung in vitro den Ubiquitin-Bindungsmodus von Zielproteinen unter physiologischeren Bedingungen bei.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

Ubiquitination ist eine Art posttranslationale Modifikation, die nicht nur die Stabilität, sondern auch die Lokalisation und Funktion eines Substratproteins reguliert. Der Ubiquitinierungsprozess findet intrazellulär in Eukaryoten statt und reguliert fast alle grundlegenden zellbiologischen Prozesse. Die Reinigung ubiquitinierter Proteine hilft bei der Untersuchung der Rolle der Ubiquitinierung bei der Steuerung der Funktion von Substratproteinen. Hier wird ein schrittweises Verfahren zur Reinigung ubiquitinierter Proteine in Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53 beschrieben. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen gereinigt. Das gesamte zelluläre Flag-markierte p53-Protein wurde mit Anti-Flag-Antikörper-konjugierter Agarose unter nicht denaturierenden Bedingungen gereinigt. Alternativ wurde das gesamte zelluläre His-markierte ubiquitinierte Protein unter Verwendung von nickelgeladenem Harz unter Denaturierungsbedingungen gereinigt. Ubiquitinierte p53-Proteine in den Eluaten wurden erfolgreich mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Mit diesem Verfahren können die ubiquitinierten Formen eines bestimmten Proteins effizient von Säugetierzellen gereinigt werden, was Studien über die Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Proteinfunktion erleichtert.

Das schematische Diagramm zeigt die Flag-tagged p53 (Flag-p53) und His/HA double-tagged ubiquitin (HH-Ub) Proteine (Abbildung 1A). Die Verfahren zur Reinigung ubiquitinierter Proteine sind in Abbildung 1B zusammengefasst. Poly-His-markiertes Ubiquitin kann zu Zielproteinen in Säugetierzellen ligiert werden. Ubiquitinierte Proteine können mit Flag/M2-Beads unter nichtdenaturierenden Bedingungen oder durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IM...

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Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Reinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen aus Zellen gereinigt.

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Mit diesem Protokoll können die ubiquitinierten Formen eines bestimmten Proteins effizient von Säugetierzellen gereinigt werden, was Studien über die Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Proteinfunktion erleichtert. Die Reinigung von ubiquitinierten Proteinen in Säugetierzellen im Vergleich zur Reinigung in vitro behält den Ubiquitin-Bindungsmodus von Zielproteinen unter stärker radiologischen Bedingungen bei. Beginnen Sie mit der Zugabe von 1,5 Milliliter reduziertem Serummedium in drei 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Fügen Sie jeder Röhre transfektionsbereite Plasmid-DNA hinzu und fügen Sie 0,2 Mikrogramm grün fluoreszierendes Proteinplasmid hinzu, um die Transfektionseffizienz zu überwachen. Fügen Sie 78 Mikroliter Liposomentransfektionsreagenz zu 4,5 Milliliter reduziertem Serummedium in einem anderen Zentrifugenröhrchen hinzu, um die Liposomen zu verdünnen. Mischen Sie gründlich, indem Sie die Tube schnippen und lassen Sie sie dann fünf Minuten bei Raumtemperatur stehen.Geben Sie 1,5 Milliliter der verdünnten Liposomenlösung in jedes Röhrchen, das 1,5 Milliliter der verdünnten DNA-Lösung enthält. Die Plasmide gründlich mischen und mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur mit den Liposomen vernetzen. Verwerfen Sie das Originalmedium aus den Petrischalen und geben Sie neun Milliliter des reduzierten Serummediums in jede Schale.Fügen Sie drei Milliliter der Liposomen-DNA-Mischung hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie die Platte dreimal vorsichtig hin und her und dann dreimal links und rechts schütteln, um eine gleichmäßige Verteilung der Mischung auf der Platte zu gewährleisten. Kulturieren Sie die Zellen im befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Medium nach vier bis sechs Stunden und kultivieren Sie die Zellen für 24 bis 36 Stunden.Nach 24 bis 36 Stunden behandeln Sie die Zellen mit MG132 in einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren für vier bis sechs Stunden. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS. Geben Sie einen Milliliter PBS in die Schale.Entfernen Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem sauberen Schaber abkratzen und die Zellsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen geben. Zentrifugieren Sie bei 700 G für fünf Minuten, um die Zellpellets zu sammeln. Fügen Sie 800 Mikroliter des eiskalten FLAG-Lysepuffers, ergänzt mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail, in die Zellen in jedem Röhrchen hinzu.Mischen Sie die Zellen mit einem Wirbeloszillator oder einer Pipettenpistole und inkubieren Sie die Mischung dann 30 Minuten lang auf einem Rotator bei vier Grad Celsius. Ultraschall die Mischung auf dem Eis mit jedem Puls von einer Sekunde Dauer und setzen Sie die Mischung fünf bis 10 kurzen Impulsen aus. Inkubieren Sie die Mischung auf einem Rotator bei 40 U/min für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.Dann zentrifugieren Sie die Ultraschallproben bei 8.000 g für 20 bis 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Aliquot 80 Mikroliter des Zellextrakts und mischen Sie mit 20 Mikrolitern 5X SDS Ladepuffer.Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 98 Grad Celsius. Zwei Minuten auf Eis abkühlen lassen und bis zum Gebrauch bei minus 20 Grad Celsius lagern. Verwenden Sie diese Proben als Eingabegruppe, um die Proteinexpression zu überwachen.Als nächstes fügen Sie 30 Mikroliter des Anti-FLAG M2-Antikörpers konjugierte Perlen zu den verbleibenden Zellextrakten hinzu und inkubieren auf einem Rotator bei vier Grad Celsius für mindestens vier Stunden oder über Nacht. Zentrifugieren Sie bei 1.500 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius, um die Perlen zu sammeln. Fügen Sie einen Milliliter des eiskalten FLAG-Lysepuffers zu den Perlen hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen.Wiederholen Sie diesen Schritt vier- bis sechsmal und fügen Sie dann 40 Mikroliter der FLAG-Peptide in einer Endkonzentration von 200 Nanogramm pro Mikroliter zu den Perlen hinzu. Wie zuvor gezeigt, auf einem Rotator inkubieren und dann bei gleicher Temperatur zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 10 Mikroliter 5X SDS-Ladepuffer hinzu.Kochen Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 98 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann zwei Minuten auf Eis. Geben Sie einen Milliliter des eiskalten PBS zu den Zellpellets und mischen Sie gleichmäßig. Aliquot 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen als Eingangsprobe geben und bei 700 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um die Zellpellets zu sammeln.Fügen Sie der Eingangsprobe 80 Mikroliter FLAG-Lysepuffer hinzu und mischen Sie die Zellen mit einem Wirbeloszillator, wie zuvor gezeigt. Die Zellen eine Stunde lang auf Eis lysieren und dann erneut für 20 bis 30 Minuten zentrifugieren. Nach der Zentrifusion aliquot 80 Mikroliter des Überstands in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen geben und 20 Mikroliter 5X SDS-Ladepuffer zum Überstand geben.Kochen Sie die Mischung bei 98 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten und kühlen Sie dann zwei Minuten auf Eis ab. Zentrifugieren Sie die restlichen 900 Mikroliter der Zellsuspension bei 700 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um das Zellpellet zu sammeln. Fügen Sie einen Milliliter Ubiquitinpuffer 1 zu den Zellpellets hinzu und mischen Sie, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.Die Zelllysate 10 bis 20 Runden Ultraschall auf Eis unterziehen, bis die Lösung nicht mehr viskos ist, und dann die Lösung zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dem Überstand 30 Mikroliter nickelgeladenes Harz hinzu. Inkubieren Sie auf einem Rotator bei 15 U/min für vier Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann für zwei Minuten.Nach der Zentrifusion die Perlen sammeln und einen Milliliter Ubiquitinpuffer 1 hinzufügen. Inkubieren Sie mit Rotation in einem Shaker für 10 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann erneut bei 1.500 G für zwei Minuten, wie zuvor gezeigt. Fügen Sie einen Milliliter Ubiquitinpuffer 2 zu den Perlen hinzu und führen Sie eine Inkubation gefolgt von einer Zentrifugation durch, wie zuvor gezeigt, um die Perlen zu sammeln.Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Als nächstes fügen Sie den Perlen einen Milliliter PBS hinzu und befolgen Sie das gleiche Verfahren für Inkubation und Zentrifugation, um die Perlen zu sammeln. Wiederholen Sie diesen Schritt erneut.Eluierte Proteine durch Inkubation der Beads mit 40 Mikrolitern Imidazol in einer Endkonzentration von 0,5 Molar für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation erneut bei 1.500 G für zwei Minuten zentrifugieren. Den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen geben und 10 Mikroliter 5X SDS-Ladepuffer hinzufügen.Kochen Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 98 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann zwei Minuten auf Eis ab. Die Proben werden mittels SDS-PAGE aufgelöst und dann durch Western Blotting auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, um Zielproteine mit den entsprechenden Antikörpern nachzuweisen. Starten Sie das Chemilumineszenz-Bildgebungssystem, um Signale von Western Blotting zu erkennen.Legen Sie die Nitrozellulosemembran mit der Vorderseite nach oben in die Camera Obscura. Kodieren Sie die Substratlösung gleichmäßig auf der Membran mit einer Pipettenpistole. Wählen Sie schließlich das automatische Belichtungsverfahren, um die Chemilumineszenzsignale zu erfassen, und passen Sie die Belichtungszeit manuell an, bis ein ideales Signal erfasst wird.Das gesamte p53-Protein, einschließlich ubiquitiniertem p53, wurde mit FLAG M2-Perlen aus H1299-Zellen unter nicht denaturierenden Bedingungen immunpräzipiert. Das Eluat wurde einem Western Blotting mit Anti-p53 und Anti-Hämagglutinin oder mit Anti-p53 und monoklonalen Antikörpern unterzogen. Hier wurden die Rohzellextrakte oder -inputs einem Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53- und Anti-MDM2-Antikörpern unterzogen.Das Signal des ubiquitinierten p53-Proteins, das als verschmierte Bande von niedrigem bis hohem Molekulargewicht erscheint, war deutlich erhöht, wenn MDM2 in diesen Zellen ektopisch exprimiert wurde. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass das ubiquitinierte p53-Protein effektiv aus Zellen gereinigt wurde. Als nächstes wurden die Zellen unter denaturierenden Bedingungen lysiert.Die gesamten zellulären ubiquitinierten Proteine wurden mit nickelgeladenem Harz heruntergezogen und dann einem Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53- und Anti-Hämagglutinin-Antikörpern unterzogen. Ubiquitiniertes p53-Protein wurde mit einem Anti-p53-Antikörper und einem Anti-Hämagglutinin-Antikörper nachgewiesen. Hier wurden an den Rohzellextrakten oder -inputs Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53- und Anti-MDM2-Antikörpern unterzogen.Die Ergebnisse zeigten, dass der gesamte ubiquitinierte Proteinspiegel unverändert war, aber der ubiquitinierte p53-Proteinspiegel dramatisch erhöht war, nachdem MDM2 in diesen Zellen überexprimiert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die gesamten Ubiquitinproteine, die ubiquitiniertes p53 enthalten, unter Denaturierungsbedingungen effektiv aus Zelllysaten gezogen wurden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, denken Sie daran, die Zellen vor der Zellentnahme mit MG132 zu behandeln und die Zellen auf Eis zur Reinigung von ubiquitinierten Proteinen ordnungsgemäß zu beschallen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epithel-Darmzellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

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Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Schnelle Beurteilung der Qualität von Membranproteinen durch Fluoreszenzgrößenausschlusschromatographie

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extraktion modifizierter Mikrotubuli aus Säugetierzellen zur Untersuchung von Mikrotubuli-Protein-Komplexen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...