Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81972624) לד.ל.

הערה: תאי H1299 סופקו בחביבות על ידי בנק תאי הגזע, האקדמיה הסינית למדעים והוכחו כשליליים לזיהום מיקופלסמה.
1. תרבית תאים
<ol><li>עבור התרבית הראשונית, יש למקם 1 x 106 תאים של קו תאי אדנוקרצינומה בריאה אנושית, H1299 בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ עם 10-12 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% ס...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions.">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li><li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling.">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li><li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

יוביקוויטינציה ממלאת תפקיד קריטי כמעט בכל התהליכים התאיים הפיזיולוגיים והפתולוגיים2. בשנים האחרונות חלה התקדמות רבה בהבנת התפקיד המולקולרי של יוביקוויטין במסלולי איתות וכיצד שינויים במערכת האוביקוויטין מובילים למחלות אנושיות שונות2. הטיהור של חלבונים המכילי?...

אוביקוויטין הוא חלבון משומר אבולוציונית של 76 חומצות אמינו 1,2,3. אוביקוויטין קושר באופן קוולנטי שאריות ליזין על חלבוני מטרה באמצעות מפלים המערבים אנזימים מפעילים (E1), מצומדים (E2) וליגאז (E3). יוביקוויטין מופעל תחילה על ידי האנזים E1 ולאחר מכן מועבר לאנזימים המצומדים E2. לאחר מכן, ליגאזות יוביקוויטין E3 מתקשרות הן עם אנזימי E2 טעונים ביוביקוויטין והן עם חלבוני סובסטרט ומתווכות את היווצרותו של קשר איזופפטידי בין מסוף C של יוביקוויטין לבין שאריות ליזין במצע 1,2,3,4,5. יוביקוויטינציה כרוכה בחיבור של יוביקוויטין מואטי לשאריות ליזין על חלבוני המצע או לעצמה, מה שמוביל למונוביקוויטינציה של חלבונים או לפוליוביקוויטינציה. תהליך זה של ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומסדיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. יוביקוויטינציה גורמת לפירוק חלבוני הסובסטרט באמצעות מערכת יוביקוויטין-פרוטאזומים 1,2,3,4,5. בנוסף, יוביקוויטינציה מווסתת לוקליזציה של חלבונים תת-תאיים, היווצרות קומפלקס חלבונים וסחר בחלבונים בתאים 3,5. ניתן להסיר יוביקוויטין מואטי הקשור לחלבוני סובסטרט על ידי דה-אוביקוויטין אנזימים (DUBs)6,7. יש לציין כי הדרכים השונות שבהן שרשראות יוביקוויטין מורכבות מספקות מספר עצום של אמצעים לוויסות תהליכים ביולוגיים שונים 1,5. התפקידים המדויקים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד חלבון המצע עדיין אינם מובנים במלואם עד כה. הטיהור של חלבונים ubiquitinated תורם להבהרת ההשפעות של חלבון ubiquitination על מגוון רחב של תהליכים תאיים.
החלבון p53 הוא אחד החלבונים מדכאי הגידול החשובים ביותר והוא מציג מוטציות גנטיות או השבתה כמעט בכל סוגי הסרטן האנושיים 8,9,10,11. היציבות והפעילות של P53 מווסתות בעדינות in vivo על-ידי שינויים פוסט-טרנסלציוניים, כולל יוביקוויטינציה, זרחון, אצטילציה ומתילציה12,13. לחלבון p53 יש זמן מחצית חיים קצר הנע בין 6 דקות ל-40 דקות בתאים שונים, מה שנובע בעיקר מהפוליוביקוויטינציה שלו ומפירוק פרוטאזומלי10,12 לאחר מכן. עכבר כפול דקה 2 (Mdm2) הוא ליגאז יוביקוויטין E3 של p53 הנקשר ל-N-terminus של p53 כדי לעכב את פעילות השעתוק שלו12,14,15. Mdm2 מקדם את הפוליוביקוויטינציה והפירוק הפרוטיאזומלי של p53 כדי לשלוט ביציבותו וגורם למונוביקוויטינציה של p53 כדי להקל על ייצוא הגרעין שלה12,14,15,16. כאן, יוביקוויטינציה p53 בתיווך Mdm2 משמשת כדוגמה להצגת שיטה לטיהור חלבונים יוביקוויטין מתאי יונקים בפירוט. ניתן לזהות את הרגולטורים המשפיעים על מצב האוביקוויטינציה של חלבוני המטרה באמצעות בדיקת יוביקוויטינציה in vivo זו כאשר הם מתבטאים יתר על המידה או מופלים/נדפקים בתאי יונקים. בנוסף, חלבונים המכילים יוביקוויטין יכולים לשמש כמצעים לבדיקת דאוביקוויטינציה במבחנה. ניתן לבצע בדיקת תפוקה גבוהה כדי לזהות DUBs ספציפיים עבור חלבוני מטרה על ידי דגירה של מצעים ubiquitinated עם DUBs בודדים. חלבונים הנמצאים בכל מקום עשויים לשמש כפיגום לגיוס חלבוני איתות במורד הזרם בתאים. קומפלקס חלבוני מטרה הנמצאים בכל מקום יכול להיות מטוהר על ידי מיצוי חיסוני רציף בתנאי טיהור מקומיים ולזהות על ידי ספקטרומטריית מסה. ניתן להשתמש בפרוטוקול הנוכחי באופן נרחב כדי לחקור את החלבונים התאיים המווסתים על ידי יוביקוויטינציה.
מספר שיטות הוקמו כדי לטהר חלבונים ubiquitinated, הכוללות שימוש ביוביקוויטין המתויג על ידי זיקה, נוגדני יוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין, ותחומים מבודדים הקושרים יוביקוויטין (UBDs)17. כאן, אנו מספקים פרוטוקול המשתמש ביוביקוויטין המתויג כמתווך לטיהור חלבונים הנמצאים בתאים של יונקים. השימוש ביוביקוויטין המתויג של פולי-היס מציע יתרונות על פני השיטות האחרות. חלבונים הנמצאים בכל מקום מטוהרים בנוכחות דנטורנטים חזקים, מה שמפחית קשירה לא ספציפית לשרף טעון ניקל על ידי ליניאריזציה של חלבונים תאיים ושיבוש אינטראקציות חלבון-חלבון. לעומת זאת, השימוש בנוגדנים ליוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין ו-UBDs מבודדים כמתווכים אינו יכול להוציא ביעילות שותפים קושרים מחלבון המטרה מכיוון שיש לבצע טיהור בתנאים פחות מחמירים. יתר על כן, טיהור עשוי גם להוביל לקשירה מוגברת של חלבונים שאינם קשורים באמצעות מתווכים אלה. בנוסף, קיימת נטייה מחייבת לסוגי קישור שונים של יוביקוויטין, כמו גם מונו ופולי-יוביקוויטינציה על ידי חלבונים קושרי יוביקוויטין או UBDs17 מבודדים. השימוש באוביקוויטין המתויג על-ידי פולי-היס תורם להורדת כל החלבונים הנמצאים בכל התאים הנמצאים בכל מקום. לחלופין, השימוש באגרוז מצומד נגד פלאג או אנטי-HA זמין מסחרית ומקל על חיסונית חלבוני מטרה מתויגים של דגל או HA בקנה מידה גדול בתנאים שאינם מתויגים. שלב טיהור שני, לדוגמה, על ידי שרף טעון ניקל המכוון ליוביקוויטין מתויג פולי-היס, יכול לשמש לרכישת חלבוני מטרה ubiquitinated עם טוהר גבוה לניסויים במורד הזרם. יש לציין כי אסטרטגיית טיהור תיוג אפיטופים יכולה להיות מותאמת כאשר לא ניתן לרכוש נוגדן מסוים לחלבוני מטרה חיסוניים יעילים. לבסוף, טיהור של חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים, בהשוואה לטיהור במבחנה, שומר על מצב הקישור של יוביקוויטין של חלבוני מטרה בתנאים פיזיולוגיים יותר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

Ubiquitination הוא סוג של שינוי posttranslational המסדיר לא רק את היציבות אלא גם את לוקליזציה ותפקוד של חלבון המצע. תהליך ה-ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומווסת כמעט את כל התהליכים הביולוגיים הבסיסיים של התאים. טיהור של חלבונים ubiquitinated מסייע לחקור את התפקיד של ubiquitination בשליטה על תפקוד של חלבונים המצע. כאן, הליך שלב אחר שלב לטיהור חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים מתואר עם חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו בתנאים מחמירים של אי-דנטורינג ודנאטורציה. סה"כ חלבון p53 המתויג כ-Flag טוהר באמצעות אגרוז מצומד נגד נוגדנים של פלאג בתנאים של אי-דנטורציה. לחלופין, סך כל החלבון התאי המתויג כיוביקוויטין טוהר באמצעות שרף טעון ניקל בתנאי דנטורציה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום באלואטים זוהו בהצלחה עם נוגדנים ספציפיים. באמצעות הליך זה, ניתן לטהר ביעילות את הצורות הנמצאות בכל מקום של חלבון נתון מתאי יונקים, ובכך להקל על מחקרים על התפקידים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד החלבון.

הדיאגרמה הסכמטית מציגה את חלבוני האוביקוויטין המתויגים בדגל (HH-Ub) (איור 1A). ההליכים המשמשים לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מסוכמים באיור 1B. ניתן לקשור יוביקוויטין מתויג של Poly-His לחלבונים ממוקדים בתאי יונקים. חלבונים הנמצאים בכל מקום יכולים להיות מטוהרים בא...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים באמצעות חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו מתאים בתנאים מחמירים של אי-דנטורציה ודנאטורציה.

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטהר ביעילות את הצורות הנמצאות בכל מקום של חלבון נתון מתאי יונקים, מה שמקל על מחקרים על התפקידים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד החלבון. טיהור של חלבונים הנמצאים בכל מקום בתאי יונקים בהשוואה לטיהור במבחנה שומר על מצב קישור האוביקוויטין של חלבוני המטרה במצב רדיולוגי יותר. התחל על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של בינוני סרום מופחת בשלושה צינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר.הוסיפו דנ"א פלסמיד מוכן להעברה לכל שפופרת והוסיפו 0.2 מיקרוגרם של פלסמיד חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לנטר את יעילות הטרנספקציה. הוסף 78 מיקרוליטרים של ריאגנט טרנספקציה של ליפוזום ל-4.5 מיליליטר של מדיום סרום מופחת בצינור צנטריפוגה אחר כדי לדלל את הליפוזומים. מערבבים היטב על ידי הבהוב הצינור ולאחר מכן מאפשרים לו לעמוד במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.הוסף 1.5 מיליליטר של תמיסת ליפוזום מדולל לתוך כל צינור המכיל 1.5 מיליליטר של תמיסת DNA מדולל. מערבבים היטב ומקשרים את הפלסמידים עם הליפוזומים למשך 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. השליכו את המדיום המקורי מצלחות הפטרי והוסיפו תשעה מיליליטר של מדיום הסרום המופחת לכל מנה.מוסיפים שלושה מיליליטר מתערובת הדנ"א הליפוזום ומערבבים את התמיסה על ידי ניעור עדין של הצלחת הלוך ושוב שלוש פעמים ואז שמאלה וימינה שלוש פעמים לפיזור שווה של התערובת על הצלחת. תרבית את התאים באינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. החלף את המדיום לאחר ארבע עד שש שעות והמשיך לתרבת את התאים במשך 24 עד 36 שעות.לאחר 24 עד 36 שעות, לטפל בתאים עם MG132 בריכוז סופי של 10 micromolar במשך ארבע עד שש שעות. השליכו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לתבשיל.הסר את התאים על ידי גירוד אותם עם מגרד נקי ולהעביר את מתלה התא לתוך צינורות microcentrifuge. צנטריפוגה ב 700 G במשך חמש דקות כדי לאסוף את כדורי התא. הוסיפו 800 מיקרוליטרים של חיץ FLAG lysis קר כקרח בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז לתאים בכל צינור.מערבבים את התאים באמצעות מתנד מערבולת או אקדח פיפטה ולאחר מכן לדגור את התערובת על מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. אולטרא-סאונד של התערובת על הקרח כאשר כל פולס נמשך שנייה אחת, והכפיף את התערובת לחמש עד 10 פולסים קצרים. לדגור את התערובת על סיבוב ב 40 סל"ד במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.ואז צנטריפוגה דגימות ultrasonicated ב 8, 000 G במשך 20 עד 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. Aliquot 80 microliters של תמצית התא לערבב עם 20 microliters של 5X SDS טעינה חיץ.מרתיחים את הדגימות ב 98 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. מצננים על הקרח כשתי דקות ומאחסנים בחום של מינוס 20 מעלות עד לשימוש. השתמש בדגימות אלה כקבוצת הקלט כדי לנטר את ביטוי החלבון.לאחר מכן, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של חרוזים מצומדים נגד נוגדן M2 נגד FLAG לתמציות התאים הנותרות ודגרו על סיבוב בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות או למשך הלילה. צנטריפוגה ב 1, 500 גרם במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את החרוזים. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ FLAG lysis קר כקרח לחרוזים ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.חזור על שלב זה ארבע עד שש פעמים, ולאחר מכן הוסף 40 מיקרוליטרים של פפטידי FLAG בריכוז סופי של 200 ננוגרם למיקרוליטר לחרוזים. דגירה על מסובב במשך שעתיים כפי שהוצג קודם לכן ולאחר מכן צנטריפוגה באותה טמפרטורה. העבר את הסופר-נאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש והוסף 10 מיקרוליטרים של מאגר טעינת SDS 5X.מרתיחים את התערובת ב 98 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחר מכן לקרר אותו על קרח במשך שתי דקות. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לכדורי התא ומערבבים באופן שווה. Aliquot 100 microliters של מתלה התא לתוך צינור microcentrifuge כמו דגימת קלט צנטריפוגה ב 700 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את כדורי התא.הוסף 80 מיקרוליטרים של מאגר FLAG lysis לדגימת הקלט וערבב את התאים באמצעות מתנד מערבולת כפי שהוצג קודם לכן. מניחים את התאים על הקרח במשך שעה ואז שוב צנטריפוגה למשך 20 עד 30 דקות. לאחר צנטריפוזיה aliquot 80 microliters של supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 20 microliters של 5X SDS טעינה מאגר supernatant.מרתיחים את התערובת ב 98 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 10 דקות ולאחר מכן מגניב על קרח במשך שתי דקות. צנטריפוגה של 900 המיקרוליטרים הנותרים של מתלה התא ב 700 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את כדור התא. הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר יוביקוויטין 1 לכדורי התא וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפזר את התאים באופן שווה.נושא התא ליזאט ל 10 עד 20 סיבובים של אולטרה סאונד על הקרח עד שהתמיסה כבר לא צמיגית, ולאחר מכן צנטריפוגה את התמיסה. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש והוסיפו 30 מיקרוליטרים של שרף טעון ניקל לסופרנטנט. לדגור על סיבוב ב 15 סל"ד במשך ארבע שעות או לילה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגה במשך שתי דקות.לאחר centrifusion, לאסוף את החרוזים ולהוסיף מיליליטר אחד של ubiquitin חיץ 1 אליו. דגירה עם סיבוב בשייקר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגה שוב ב 1, 500 G במשך שתי דקות, כפי שהוצג קודם לכן. מוסיפים מיליליטר אחד של מאגר יוביקוויטין 2 לחרוזים ומבצעים דגירה ואחריה צנטריפוגה, כפי שהוצג קודם לכן, כדי לאסוף את החרוזים.חזור על שלב זה פעם אחת. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של PBS לחרוזים ופעל לפי אותו הליך של דגירה וצנטריפוגה כדי לאסוף את החרוזים. חזור על שלב זה שוב.חלבונים הקשורים לאלוטה על ידי דגירה של החרוזים עם 40 מיקרוליטרים של אימידזול בריכוז סופי של 0.5 טוחנות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, צנטריפוגה שוב ב 1, 500 G במשך שתי דקות. העבירו את הסופר-נאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי והוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר טעינת SDS 5X.מרתיחים את התמיסה ב 98 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחר מכן לקרר אותו על קרח במשך שתי דקות. פתור את הדגימות על ידי SDS-PAGE ולאחר מכן העבר אותן לקרום ניטרוצלולוז על ידי כתם מערבי כדי לזהות חלבוני מטרה באמצעות הנוגדנים המתאימים. הפעל את מערכת ההדמיה chemiluminescence כדי לזהות אותות מהכתם המערבי.מניחים את קרום הניטרוצלולוז בקמרה אובסקורה עם הפנים כלפי מעלה. לקודד את תמיסת המצע באופן שווה על הממברנה באמצעות אקדח פיפטה. לבסוף, בחר את הליך החשיפה האוטומטי כדי ללכוד את האותות הכימילומינסנטיים וכוונן ידנית את זמן החשיפה עד להשגת אות אידיאלי.סה"כ חלבון p53, כולל p53 ubiquitinated, היה חיסוני עם חרוזי FLAG M2 מתאי H1299 בתנאים שאינם דנטורציה. האלואט היה נתון לכתמים מערביים עם אנטי p53 ואנטי המגלוטינין או עם אנטי p53 ונוגדנים חד שבטיים. כאן, תמציות התאים הגולמיים או הקלט היו נתונים לכתמים מערביים עם נוגדנים חד שבטיים נגד p53 ונגד MDM2.האות מחלבון p53 המצוי בכל מקום, המופיע כלהקה מרוחה ממשקל מולקולרי נמוך לגבוה, עלה במידה ניכרת כאשר MDM2 בא לידי ביטוי באופן אקטופי בתאים אלה. תוצאה זו מרמזת על כך שהחלבון p53 המצוי בכל מקום טוהר ביעילות מהתאים. לאחר מכן, התאים היו שוכבים בתנאי דנטורציה.סך כל החלבונים הנמצאים בכל מקום בתאים נמשכו למטה עם שרף טעון ניקל, ולאחר מכן היו נתונים לכתמים מערביים עם נוגדנים חד-שבטיים נגד p53 ונגד המגלוטינין. חלבון p53 המצוי בכל מקום זוהה באמצעות נוגדן נגד p53 ונוגדן נגד המגלוטינין. כאן בתמציות התאים הגולמיים או הקלט היו נתונים לכתמים מערביים עם נוגדנים חד שבטיים נגד p53 ונגד MDM2.התוצאות הראו כי רמת החלבון הכוללת של יוביקוויטין לא השתנתה, אך רמת החלבון p53 המצוי בכל מקום עלתה באופן דרמטי לאחר ש-MDM2 התבטא יתר על המידה בתאים אלה. זה מצביע על כך שסך חלבוני האוביקוויטין המכילים יוביקוויטין p53 נמשכו למעשה מליזאטים של תאים בתנאי דנטורציה. כאשר מנסים הליך זה, זכור לטפל בתאים עם MG132 לפני איסוף תאים אולטרה סאונד את התאים כראוי על הקרח לטיהור של חלבונים ubiquitinated.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

הערכה מהירה של איכות חלבון הממברנה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

חילוץ מיקרוטובולים מהונדסים מתאי יונקים לחקר קומפלקסים של מיקרוטובולים-חלבונים באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...