Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (81972624) a D.L.

NOTA: Le cellule H1299 sono state gentilmente fornite dalla Banca delle cellule staminali, Accademia cinese delle scienze e si sono dimostrate negative per la contaminazione da micoplasma.
1. Coltura cellulare
<ol><li>Per la coltura iniziale, posizionare 1 x 106 cellule della linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano, H1299 in una capsula di Petri da 10 cm con 10-12 ml di terreno RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale (FBS) al 1%, additivo glutamminic...

<ol>
	<li>Kwon, Y. 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(Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

L'ubiquitinazione svolge un ruolo critico in quasi tutti i processi cellulari fisiologici e patologici2. Negli ultimi anni, sono stati fatti grandi progressi nella comprensione del ruolo molecolare dell'ubiquitina nelle vie di segnalazione e di come i cambiamenti nel sistema dell'ubiquitina portino a diverse malattie umane2. La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce a fornire informazioni sui ruoli esatti dell'ubiquitinazione in questi processi. Le miscele d...

L'ubiquitina è una proteina evolutivamente conservata di 76 aminoacidi 1,2,3. L'ubiquitina lega covalentemente i residui di lisina sulle proteine bersaglio attraverso cascate che coinvolgono gli enzimi attivanti (E1), coniuganti (E2) e ligasi (E3). L'ubiquitina viene prima attivata dall'enzima E1 e quindi trasferita agli enzimi coniuganti E2. Successivamente, le ubiquitina ligasi E3 interagiscono sia con gli enzimi E2 caricati con ubiquitina che con le proteine del substrato e mediano la formazione di un legame isopeptidico tra il C-terminale dell'ubiquitina e un residuo di lisina nel substrato 1,2,3,4,5. L'ubiquitinazione comporta l'attaccamento delle frazioni di ubiquitina ai residui di lisina sulle proteine del substrato o a se stessa, portando alla monoubiquitinazione o alla poliubiquitinazione delle proteine. Questo processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola una grande varietà di processi biologici. L'ubiquitinazione provoca la degradazione delle proteine del substrato attraverso il sistema ubiquitina-proteasoma 1,2,3,4,5. Inoltre, l'ubiquitinazione modula la localizzazione subcellulare delle proteine, la formazione di complessi proteici e il traffico proteico nelle cellule 3,5. Le frazioni di ubiquitina legate alle proteine del substrato possono essere rimosse dagli enzimi deubiquitinanti (DUB)6,7. In particolare, i diversi modi in cui le catene di ubiquitina sono assemblate forniscono una miriade di mezzi per regolare vari processi biologici 1,5. I ruoli esatti dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica del substrato rimangono incompletamente compresi fino ad ora. La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce alla spiegazione degli effetti dell'ubiquitinazione delle proteine su una varietà di processi cellulari.
La proteina p53 è una delle più importanti proteine oncosoppressori e presenta mutazioni genetiche o inattivazione in quasi tutti i tumori umani 8,9,10,11. La stabilità e l'attività di p53 sono delicatamente regolate in vivo da modificazioni post-traduzionali, tra cui ubiquitinazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione12,13. La proteina p53 ha una breve emivita che va da 6 min a 40 min in varie cellule, che deriva principalmente dalla sua poliubiquitinazione e successiva degradazione proteasomica10,12. Il doppio minuto 2 del topo (Mdm2) è una ubiquitina ligasi E3 di p53 che si lega al N-terminale di p53 per inibire la sua attività trascrizionale12,14,15. Mdm2 promuove la poliubiquitinazione e la degradazione proteasomica di p53 per controllarne la stabilità e induce la monoubiquitinazione di p53 per facilitare la sua esportazione nucleare12,14,15,16. Qui, l'ubiquitinazione di p53 mediata da Mdm2 viene utilizzata come esempio per introdurre in dettaglio un metodo per la purificazione delle proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero. I regolatori che influenzano lo stato di ubiquitinazione delle proteine bersaglio possono essere identificati utilizzando questo test di ubiquitinazione in vivo quando sono sovraespressi o abbattuti / eliminati nelle cellule di mammifero. Inoltre, le proteine ubiquitinate possono essere utilizzate come substrati per il saggio di deubiquitinazione in vitro. È possibile eseguire uno screening ad alto rendimento per identificare DUB specifici per le proteine bersaglio incubando substrati ubiquitinati con singoli DUB. Le proteine ubiquitinate possono agire come un'impalcatura per reclutare proteine di segnalazione a valle nelle cellule. Un complesso proteico bersaglio ubiquitinata può essere purificato mediante immunoprecipitazione sequenziale in condizioni di purificazione native e identificato mediante spettrometria di massa. L'attuale protocollo può essere ampiamente utilizzato per studiare le proteine cellulari regolate dall'ubiquitinazione.
Sono stati stabiliti diversi metodi per purificare le proteine ubiquitinate, che includono l'uso di ubiquitina marcata per affinità, anticorpi ubiquitina, proteine leganti l'ubiquitina e domini isolati leganti l'ubiquitina (UBD)17. Qui, forniamo un protocollo che utilizza ubiquitina marcata di affinità come mediatore per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero. L'uso di ubiquitina poli-His-marcata offre vantaggi rispetto agli altri metodi. Le proteine ubiquitinate vengono purificate in presenza di forti denaturanti, che riducono il legame non specifico alla resina carica di nichel linearizzando le proteine cellulari e interrompendo le interazioni proteina-proteina. Al contrario, l'uso di anticorpi ubiquitina, proteine leganti l'ubiquitina e UBD isolati come mediatori non può escludere efficacemente i partner leganti dalla proteina bersaglio perché la purificazione deve essere eseguita in condizioni meno rigorose. Inoltre, la purificazione può anche portare ad un maggiore legame di proteine non correlate usando questi mediatori. Inoltre, vi è una propensione al legame per vari tipi di legame dell'ubiquitina e per la mono- e poli-ubiquitinazione da parte di proteine leganti l'ubiquitina o UBD isolate17. L'uso di ubiquitina poli-His-marcata contribuisce ad abbattere tutte le proteine ubiquitinate cellulari. In alternativa, l'uso di agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag o anti-HA disponibili in commercio rende più facile immunoprecipitare proteine bersaglio marcate con Flag o HA su larga scala in condizioni non denaturanti. Una seconda fase di purificazione, ad esempio, mediante resina carica di nichel mirata all'ubiquitina poli-His-marcata, può essere utilizzata per acquisire proteine bersaglio ubiquitinate con un'elevata purezza per esperimenti a valle. In particolare, una strategia di purificazione dell'epitopo può essere adattata quando un anticorpo specifico non può essere acquisito per immunoprecipitare efficacemente le proteine bersaglio. Infine, la purificazione delle proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero, rispetto alla purificazione in vitro, mantiene la modalità di legame ubiquitina delle proteine bersaglio in condizioni più fisiologiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

L'ubiquitinazione è un tipo di modificazione post-traduzionale che regola non solo la stabilità, ma anche la localizzazione e la funzione di una proteina substrato. Il processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola quasi tutti i processi biologici cellulari di base. La purificazione delle proteine ubiquitinate aiuta lo studio del ruolo dell'ubiquitinazione nel controllo della funzione delle proteine substrato. Qui, una procedura passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero è descritta con la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione. La proteina p53 cellulare totale Flag-tagged è stata purificata con agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag in condizioni non denaturanti. In alternativa, la proteina ubiquitinata cellulare totale marcata con His-è stata purificata utilizzando resina carica di nichel in condizioni di denaturazione. Le proteine p53 ubiquitinate negli eluati sono state rilevate con successo con anticorpi specifici. Utilizzando questa procedura, le forme ubiquitinate di una data proteina possono essere efficacemente purificate dalle cellule di mammifero, facilitando gli studi sui ruoli dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica.

Il diagramma schematico mostra le proteine p53 marcate con bandiera (Flag-p53) e ubiquitina (HH-Ub) con doppia marcatura His/HA (Figura 1A). Le procedure utilizzate per purificare le proteine ubiquitinate sono riassunte nella Figura 1B. L'ubiquitina Poly-His-taggata può essere legata alle proteine bersaglio nelle cellule di mammifero. Le proteine ubiquitinate possono essere purificate con sfere Flag/M2 in condizioni di non denaturazione o mediante cromatografia...

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Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Il protocollo descrive un metodo passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero usando la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate dalle cellule in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione.

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Utilizzando questo protocollo, le forme ubiquitinate di una data proteina possono essere efficacemente purificate dalle cellule di mammifero, facilitando gli studi sui ruoli dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica. La purificazione delle proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero rispetto alla purificazione in vitro mantiene la modalità di legame ubiquitina delle proteine bersaglio in condizioni più radiologiche. Iniziare aggiungendo 1,5 millilitri di mezzo sierico ridotto in tre provette da centrifuga da 15 millilitri.Aggiungere DNA plasmidico pronto per la trasfezione a ciascun tubo e aggiungere 0,2 microgrammi di plasmide proteico fluorescente verde per monitorare l'efficienza della trasfezione. Aggiungere 78 microlitri di reagente di trasfezione liposomica a 4,5 millilitri di mezzo sierico ridotto in un'altra provetta da centrifuga per diluire i liposomi. Mescolare accuratamente facendo scorrere il tubo e poi lasciarlo riposare per cinque minuti a temperatura ambiente.Aggiungere 1,5 millilitri della soluzione liposomica diluita in ciascuna provetta contenente 1,5 millilitri della soluzione di DNA diluito. Mescolare accuratamente e reticolare i plasmidi con i liposomi per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. Scartare il mezzo originale dalle piastre di Petri e aggiungere nove millilitri del mezzo sierico ridotto in ogni piatto.Aggiungere tre millilitri della miscela di DNA liposomico e mescolare la soluzione agitando delicatamente la piastra avanti e indietro tre volte e poi a destra e sinistra tre volte per una distribuzione uniforme della miscela sulla piastra. Coltivare le cellule nell'incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Sostituire il mezzo dopo quattro-sei ore e continuare a coltivare le cellule per 24-36 ore.Dopo 24-36 ore, trattare le cellule con MG132 ad una concentrazione finale di 10 micromolari per quattro-sei ore. Scartare il mezzo e lavare le celle due volte con PBS ghiacciato. Aggiungere un millilitro di PBS al piatto.Rimuovere le cellule raschiandole con un raschietto pulito e trasferire la sospensione cellulare in provette da microcentrifuga. Centrifugare a 700 g per cinque minuti per raccogliere i pellet cellulari. Aggiungere 800 microlitri di tampone di lisi ghiacciato FLAG integrato con cocktail inibitore della proteasi alle cellule di ciascuna provetta.Mescolare le celle usando un oscillatore a vortice o una pistola per pipette e quindi incubare la miscela su un rotatore a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Ultrasonicare la miscela sul ghiaccio con ogni impulso della durata di un secondo e sottoporre la miscela a cinque o 10 brevi impulsi. Incubare la miscela su un rotatore a 40 RPM per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi centrifugare i campioni ultrasonicati a 8.000 G per 20-30 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Aliquot 80 microlitri dell'estratto cellulare e miscelare con 20 microlitri di tampone di carico 5X SDS.Far bollire i campioni a 98 gradi Celsius per cinque minuti. Raffreddare sul ghiaccio per due minuti e conservare a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Utilizzare questi campioni come gruppo di input per monitorare l'espressione proteica.Quindi, aggiungere 30 microlitri di perle coniugate con anticorpi anti-FLAG M2 agli estratti cellulari rimanenti e incubare su un rotatore a quattro gradi Celsius per almeno quattro ore o durante la notte. Centrifugare a 1.500 g per due minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere le perle. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi FLAG ghiacciato alle perle e mescolare capovolgendo più volte il tubo.Ripetere questo passaggio da quattro a sei volte, quindi aggiungere 40 microlitri di peptidi FLAG ad una concentrazione finale di 200 nanogrammi per microlitro alle perline. Incubare su un rotatore per due ore come mostrato in precedenza e quindi centrifugare alla stessa temperatura. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga e aggiungere 10 microlitri di tampone di carico 5X SDS.Far bollire il composto a 98 gradi Celsius per cinque minuti e poi raffreddarlo sul ghiaccio per due minuti. Aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato ai pellet cellulari e mescolare uniformemente. Aliquot 100 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga come campione di ingresso e centrifugare a 700 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere i pellet cellulari.Aggiungere 80 microlitri di tampone di lisi FLAG al campione di ingresso e mescolare le celle usando un oscillatore a vortice come mostrato in precedenza. Lisare le cellule sul ghiaccio per un'ora e poi centrifugare di nuovo per 20-30 minuti. Dopo la centrfusione, trasferire 80 microlitri di surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga e aggiungere 20 microlitri di tampone di carico 5X SDS al surnatante.Far bollire la miscela a 98 gradi Celsius per cinque-10 minuti e poi raffreddare sul ghiaccio per due minuti. Centrifugare i restanti 900 microlitri della sospensione cellulare a 700 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere il pellet cellulare. Aggiungere un millilitro di tampone ubiquitina 1 ai pellet cellulari e mescolare pipettando su e giù più volte per distribuire uniformemente le cellule.Sottoporre i lisati cellulari a 10-20 cicli di ultrasuoni su ghiaccio fino a quando la soluzione non è più viscosa, quindi centrifugare la soluzione. Trasferire il surnatante in una nuova provetta di microcentrifuga e aggiungere 30 microlitri di resina carica di nichel al surnatante. Incubare su un rotatore a 15 RPM per quattro ore o durante la notte a temperatura ambiente e quindi centrifugare per due minuti.Dopo la centrifusione, raccogliere le perle e aggiungere un millilitro di ubiquitina tampone 1 ad esso. Incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a temperatura ambiente e quindi centrifugare nuovamente a 1.500 G per due minuti, come mostrato in precedenza. Aggiungere un millilitro di ubiquitina tampone 2 alle perle ed eseguire l'incubazione seguita da centrifugazione, come mostrato in precedenza, per raccogliere le perle.Ripetere questo passaggio una volta. Quindi, aggiungere un millilitro di PBS alle perle e seguire la stessa procedura per l'incubazione e la centrifugazione per raccogliere le perle. Ripetere questo passaggio ancora una volta.Eluire le proteine legate incubando le perle con 40 microlitri di imidazolo ad una concentrazione finale di 0,5 molari per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, centrifugare nuovamente a 1.500 G per due minuti. Trasferire il surnatante in una provetta di microcentrifuga pulita e aggiungere 10 microlitri di tampone di carico 5X SDS.Far bollire la soluzione a 98 gradi Celsius per cinque minuti e quindi raffreddarla sul ghiaccio per due minuti. Risolvere i campioni mediante SDS-PAGE e quindi trasferirli su una membrana di nitrocellulosa mediante western blotting per rilevare le proteine bersaglio utilizzando gli anticorpi corrispondenti. Avviare il sistema di imaging a chemiluminescenza per rilevare i segnali dal western blotting.Posizionare la membrana di nitrocellulosa nella camera oscura rivolta verso l'alto. Codificare la soluzione di substrato in modo uniforme sulla membrana utilizzando una pistola per pipette. Infine, selezionare la procedura di esposizione automatica per catturare i segnali chemiluminescenti e regolare manualmente il tempo di esposizione fino a quando non viene acquisito un segnale ideale.La proteina p53 totale, inclusa la p53 ubiquitinata, è stata immunoprecipitata con sfere FLAG M2 da cellule H1299 in condizioni di non denaturazione. L'eluato è stato sottoposto a western blotting con anti p53 e anti emoagglutinina o con anticorpi anti p53 e monoclonali. Qui, gli estratti o gli input di cellule grezze sono stati sottoposti a western blotting con anticorpi monoclonali anti p53 e anti MDM2.Il segnale della proteina p53 ubiquitinata che appare come una banda spalmata da basso ad alto peso molecolare è stato marcatamente aumentato quando MDM2 è stato espresso ectopicamente in queste cellule. Questo risultato suggerisce che la proteina p53 ubiquitinata è stata efficacemente purificata dalle cellule. Successivamente, le cellule sono state lisate in condizioni di denaturazione.Le proteine ubiquitinate cellulari totali sono state abbattute con resina carica di nichel e sono state quindi sottoposte a western blotting con anticorpi monoclonali anti p53 e anti emoagglutinina. La proteina p53 ubiquitinata è stata rilevata utilizzando un anticorpo anti p53 e un anticorpo anti emoagglutinina. Qui al grezzo gli estratti o gli input cellulari grezzi sono stati sottoposti a western blotting con anticorpi monoclonali anti p53 e anti MDM2.I risultati hanno mostrato che il livello totale di proteina ubiquitinata era invariato, ma il livello di proteina p53 ubiquitinata era drammaticamente aumentato dopo che MDM2 era sovraespresso in queste cellule. Ciò indica che le proteine ubiquitina totali contenenti p53 ubiquitinata sono state effettivamente estratte dai lisati cellulari in condizioni di denaturazione. Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di trattare le cellule con MG132 prima della raccolta cellulare e ultrasonicare correttamente le cellule sul ghiaccio per la purificazione delle proteine ubiquitinate.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Ricerca

Biochimica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

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Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellule epiteliali delle ghiandole

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

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Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

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Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Espressione, purificazione, cristallizzazione e saggi enzimatici di Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

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Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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Sezionamento trasversale di riso maturo (Oryza sativa L.) Kernel per la scansione di immagini al microscopio elettronico utilizzando le punte delle pipette come supporto per l'immobilizzazione

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During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

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