Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(81972624)からD.L.への助成金によって支援されました。

注:H1299細胞は、中国科学院の幹細胞バンクから親切に提供され、マイコプラズマ汚染に対して陰性であることが証明されました。
1. 細胞培養
<ol><li>最初の培養では、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%グルタミン添加剤、1%ピルビン酸ナトリウム、および抗生物質(100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を添加した10-12 mLのRPMI 1640培地を入れた10 cmペトリ皿?...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. 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J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

ユビキチン化は、ほとんどすべての生理学的および病理学的細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします2。近年、シグナル伝達経路におけるユビキチンの分子的役割と、ユビキチン系の変化がどのようにしてさまざまなヒト疾患につながるかを理解する上で大きな進歩が見られました2。ユビキチン化タンパク質の精製は、これらのプロセスにおけるユ?...

ユビキチンは、76個のアミノ酸1,2,3の進化的に保存されたタンパク質です。ユビキチンは、活性化(E1)、結合(E2)、およびリガーゼ(E3)酵素を含むカスケードを介して、標的タンパク質上のリジン残基に共有結合します。ユビキチンは最初にE1酵素によって活性化され、次にE2結合酵素に移されます。続いて、E3ユビキチンリガーゼは、ユビキチン負荷E2酵素および基質タンパク質の両方と相互作用し、ユビキチンのC末端と基質1,2,3,4,5中のリジン残基との間のイソペプチド結合の形成を媒介する。ユビキチン化は、ユビキチン部分の基質タンパク質上のリジン残基またはそれ自体への結合を含み、タンパク質モノユビキチン化またはポリユビキチン化をもたらす。このユビキチン化プロセスは真核生物の細胞内で起こり、多種多様な生物学的プロセスを調節します。ユビキチン化は、ユビキチン・プロテアソーム系を介して基質タンパク質の分解をもたらす1,2,3,4,5。さらに、ユビキチン化は、細胞におけるタンパク質細胞内局在、タンパク質複合体形成、およびタンパク質輸送を調節する3,5。基質タンパク質にライゲーションされたユビキチン部分は、脱ユビキチン化酵素(DUB)によって除去することができる6,7。特に、ユビキチン鎖が組み立てられるさまざまな方法は、さまざまな生物学的プロセスを調節するための無数の手段を提供します1,5。基質タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の正確な役割は、これまで完全には理解されていません。ユビキチン化タンパク質の精製は、タンパク質ユビキチン化が様々な細胞プロセスに及ぼす影響の解明に貢献します。
p53タンパク質は最も重要な腫瘍抑制タンパク質の1つであり、ほとんどすべてのヒト癌において遺伝子変異または不活性化を示す8,9,10,11。p53の安定性と活性は、ユビキチン化、リン酸化、アセチル化、メチル化などの翻訳後修飾によってin vivoで微妙に調節されています12,13。p53タンパク質は、様々な細胞において6分から40分の範囲の短い半減期を有し、これは主にそのポリユビキチン化およびその後のプロテアソーム分解に起因する10,12。マウスダブルミニッツ2(Mdm2)は、p53のE3ユビキチンリガーゼであり、p53のN末端に結合してその転写活性を阻害する12、14、15。Mdm2は、p53のポリユビキチン化とプロテアソーム分解を促進してその安定性を制御し、p53のモノユビキチン化を誘導して核輸送を促進します12,14,15,16。ここでは、Mdm2を介したp53ユビキチン化を例に、哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製する方法を詳細に紹介する。標的タンパク質のユビキチン化状態に影響を与える調節因子は、哺乳類細胞で過剰発現またはノックダウン/ノックアウトされた場合に、このin vivoユビキチン化アッセイを使用して同定できます。さらに、ユビキチン化タンパク質は、in vitroデユビキチン化アッセイの基質として使用できます。ハイスループットスクリーニングを実行して、ユビキチン化基質を個々のDUBとインキュベートすることにより、標的タンパク質の特定のDUBを同定できます。ユビキチン化タンパク質は、細胞内の下流のシグナル伝達タンパク質を動員するための足場として機能する可能性があります。ユビキチン化された標的タンパク質複合体は、天然の精製条件下での逐次免疫沈降によって精製し、質量分析によって同定することができる。現在のプロトコルは、ユビキチン化によって調節される細胞タンパク質を調査するために広く使用することができる。
ユビキチン化タンパク質を精製するには、アフィニティータグ付きユビキチン、ユビキチン抗体、ユビキチン結合タンパク質、単離されたユビキチン結合ドメイン(UBD)の使用など、いくつかの方法が確立されています17。ここでは、アフィニティタグ付きユビキチンをメディエーターとして使用して、哺乳類細胞内のユビキチン化タンパク質を精製するプロトコルを提供します。ポリHisタグ付きユビキチンの使用は、他の方法よりも優れています。ユビキチン化タンパク質は、強力な変性剤の存在下で精製され、細胞タンパク質を線形化し、タンパク質間相互作用を破壊することにより、ニッケル荷電樹脂への非特異的結合を低減します。対照的に、ユビキチン抗体、ユビキチン結合タンパク質、および単離されたUBDをメディエーターとして使用すると、精製はそれほど厳しくない条件下で行う必要があるため、結合パートナーを標的タンパク質から効果的に排除することはできません。さらに、精製は、これらのメディエーターを使用した無関係タンパク質の結合の増加にもつながる可能性があります。さらに、様々なユビキチン結合型ならびにユビキチン結合タンパク質または単離されたUBDによるモノおよびポリユビキチン化に対する結合傾向がある17。ポリHisタグ付きユビキチンの使用は、すべての細胞ユビキチン化タンパク質を引き下げることに寄与する。あるいは、市販の抗Flagまたは抗HA抗体結合アガロースを使用することで、非変性条件下で大規模なFlagまたはHAタグ付き標的タンパク質の免疫沈降が容易になります。第2の精製工程は、例えば、ポリHisタグ付きユビキチンを標的とするニッケル荷電樹脂によって、ダウンストリーム実験のために高純度でユビキチン化標的タンパク質を取得するために使用することができる。特に、エピトープタグ付け精製戦略は、特異的抗体を取得できない場合に、標的タンパク質を効果的に免疫沈降させることができます。最後に、哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質の精製は、インビ トロでの精製と比較して、より生理学的条件下で標的タンパク質のユビキチン結合様式を保持する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

ユビキチン化は、基質タンパク質の安定性だけでなく局在や機能も調節する翻訳後修飾の一種です。ユビキチン化プロセスは真核生物の細胞内で起こり、ほとんどすべての基本的な細胞生物学的プロセスを調節します。ユビキチン化タンパク質の精製は、基質タンパク質の機能制御におけるユビキチン化の役割の研究に役立ちます。ここでは、哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質を精製するための段階的な手順を、p53腫瘍抑制タンパク質を例に説明する。ユビキチン化p53タンパク質は、ストリンジェントな非変性および変性条件下で精製した。全細胞Flagタグ付きp53タンパク質を、非変性条件下で抗Flag抗体結合アガロースで精製しました。あるいは、全細胞Hisタグユビキチン化タンパク質を、変性条件下でニッケル荷電樹脂を用いて精製した。溶出液中のユビキチン化p53タンパク質は、特異的抗体で検出することに成功しました。この手順を使用すると、特定のタンパク質のユビキチン化形態を哺乳類細胞から効率的に精製することができ、タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の役割に関する研究が容易になります。

この模式図は、フラグタグ付きp53(Flag-p53)およびHis/HA二重タグ付きユビキチン(HH-Ub)タンパク質を示しています(図1A)。ユビキチン化タンパク質を精製するために利用される手順を 図1Bに要約する。ポリHisタグ付きユビキチンは、哺乳類細胞の標的タンパク質にライゲーションすることができます。ユビキチン化タンパク質は、非変性条件下でFlag/M2ビ...

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Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

このプロトコルは、例としてp53腫瘍抑制タンパク質を使用して哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製するための段階的な方法を記載している。ユビキチン化p53タンパク質を、ストリンジェントな非変性および変性条件下で細胞から精製した。

哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

このプロトコルを使用すると、特定のタンパク質のユビキチン化形態を哺乳類細胞から効率的に精製することができ、タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の役割に関する研究が容易になります。哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質の精製は、in vitroでの精製と比較して、より多くの放射線条件下で標的タンパク質のユビキチン結合様式を保持する。まず、15ミリリットルの遠心分離管3本に1.5ミリリットルの還元血清培地を加えます。トランスフェクション可能なプラスミドDNAを各チューブに加え、0.2マイクログラムの緑色蛍光タンパク質プラスミドを加えてトランスフェクション効率をモニタリングします。78マイクロリットルのリポソームトランスフェクション試薬を別の遠沈管の4.5ミリリットルの還元血清培地に加え、リポソームを希釈します。チューブをフリックして完全に混合し、室温で5分間放置します。1.5ミリリットルの希釈DNA溶液を含む各チューブに1.5ミリリットルの希釈リポソーム溶液を追加します。プラスミドを室温で少なくとも20分間完全に混合し、リポソームと架橋します。ペトリ皿から元の培地を廃棄し、9ミリリットルの還元血清培地を各皿に加えます。3ミリリットルのリポソームDNA混合物を加え、プレートを前後に3回、次に左右に3回穏やかに振って溶液を混合し、プレート上に混合物を均等に分配します。加湿インキュベーター内の細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で培養します。4〜6時間後に培地を交換し、24〜36時間細胞培養を続けます。24〜36時間後、細胞を最終濃度10マイクロモルのMG132で4〜6時間処理します。培地を廃棄し、氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。皿に1ミリリットルのPBSを加えます。きれいなスクレーパーで細胞をこすって細胞を取り除き、細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移します。700Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した800マイクロリットルの氷冷FLAG溶解バッファーを各チューブの細胞に加えます。ボルテックスオシレーターまたはピペットガンを使用して細胞を混合し、ローテーター上で摂氏4度で30分間インキュベートします。各パルスが1秒間続く氷上で混合物を超音波処理し、混合物を5〜10回の短いパルスにさらします。混合物をローテーター上で40 RPMで摂氏4度で30分間インキュベートします。次に、8, 000 Gで超音波処理されたサンプルを摂氏4度で20〜30分間遠心分離します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。80マイクロリットルの細胞抽出物を分注し、20マイクロリットルの5X SDSローディングバッファーと混合します。サンプルを摂氏98度で5分間煮沸します。氷上で2分間冷やし、使用するまでマイナス20°Cで保管してください。これらのサンプルを入力グループとして使用して、タンパク質発現をモニターします。次に、残りの細胞抽出液に30マイクロリットルの抗FLAG M2抗体結合ビーズを加え、ローテーター上で摂氏4度で少なくとも4時間または一晩インキュベートします。ビーズを集めるために摂氏4度で2分間1, 500 gで遠心分離します。1ミリリットルの氷冷FLAG溶解バッファーをビーズに加え、チューブを数回反転させて混合します。この手順を4〜6回繰り返してから、40マイクロリットルのFLAGペプチドを最終濃度200ナノグラム/マイクロリットルでビーズに加えます。前に示したようにローテーターで2時間インキュベートし、同じ温度で遠心分離します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、10マイクロリットルの5X SDSローディングバッファーを追加します。混合物を摂氏98度で5分間煮沸し、次に氷上で2分間冷却します。1ミリリットルの氷冷PBSをセルペレットに加え、均一に混合します。細胞懸濁液100マイクロリットルを投入試料としてマイクロ遠心チューブに分注し、700Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。80マイクロリットルのFLAG溶解バッファーを投入サンプルに加え、前に示したようにボルテックス発振器を使用して細胞を混合します。細胞を氷上で1時間溶解し、その後20〜30分間再び遠心分離します。遠心分離後、80マイクロリットルの上清を新しいマイクロ遠心チューブに分注し、20マイクロリットルの5X SDSローディングバッファーを上清に加えます。混合物を摂氏98度で5〜10分間沸騰させてから、氷上で2分間冷却します。残りの900マイクロリットルの細胞懸濁液を700Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。細胞ペレットに1ミリリットルのユビキチンバッファー1を加え、細胞を均等に分配するために数回上下にピペッティングして混合する。溶液がもはや粘性でなくなるまで、氷上で超音波の10〜20ラウンドに細胞溶解物をさらし、次いで溶液を遠心分離する。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、30マイクロリットルのニッケル仕込み樹脂を上清に加えます。ローテーターで15 RPMで4時間、または室温で一晩インキュベートしてから、2分間遠心分離します。遠心分離後、ビーズを集め、それに1ミリリットルのユビキチンバッファー1を加える。前に示したように、振とう機で室温で10分間回転させてインキュベートし、次に1, 500 Gで2分間再び遠心分離します。1ミリリットルのユビキチンバッファー2をビーズに加え、前に示したようにインキュベーションとそれに続く遠心分離を行い、ビーズを回収します。この手順を一度繰り返します。次に、1ミリリットルのPBSをビーズに加え、インキュベーションと遠心分離と同じ手順に従ってビーズを収集します。この手順をもう一度繰り返します。ビーズを40マイクロリットルのイミダゾールと最終濃度0.5モルで室温で1時間インキュベートすることにより、結合タンパク質を溶出します。インキュベーション後、1, 500 Gで2分間再び遠心分離します。上清を清潔な微量遠心チューブに移し、10マイクロリットルの5X SDSローディングバッファーを追加します。溶液を摂氏98度で5分間煮沸し、次に氷上で2分間冷却します。SDS-PAGEでサンプルを分離し、ウェスタンブロッティングでニトロセルロースメンブレンに転写し、対応する抗体を使用して標的タンパク質を検出します。化学発光イメージングシステムを起動して、ウェスタンブロッティングからのシグナルを検出します。ニトロセルロースメンブレンをカメラオブスクラに上向きに置きます。ピペットガンを使用して、メンブレン上に基質溶液を均一にエンコードします。最後に、自動露光手順を選択して化学発光信号をキャプチャし、理想的な信号が得られるまで露光時間を手動で調整します。ユビキチン化p53を含む全p53タンパク質を、非変性条件下でH1299細胞からFLAG M2ビーズで免疫沈降した。溶出液を、抗p53および抗ヘマグルチニン、または抗p53およびモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングに供した。ここで、粗細胞抽出液または投入物を、抗p53および抗MDM2モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティングに供した。これらの細胞でMDM2を異所的に発現させると、低分子量から高分子への塗抹バンドとして現れるユビキチン化p53タンパク質からのシグナルが著しく増加しました。この結果は、ユビキチン化p53タンパク質が細胞から効果的に精製されていることを示唆している。次に、変性条件下で細胞を溶解した。細胞ユビキチン化された全タンパク質をニッケル荷電樹脂でプルダウンし、抗p53および抗ヘマグルチニンモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングにかけました。ユビキチン化p53タンパク質は、抗p53抗体および抗ヘマグルチニン抗体を用いて検出した。ここで粗細胞抽出液または投入物にて、抗p53および抗MDM2モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティングを行った。結果は、ユビキチン化タンパク質の総レベルは変化しなかったが、MDM2がこれらの細胞で過剰発現された後、ユビキチン化p53タンパク質レベルが劇的に増加したことを示した。これは、ユビキチン化p53を含むユビキチンタンパク質全体が、変性条件下で細胞溶解物から効果的に引き下げられたことを示しています。この手順を試みるときは、細胞収集の前にMG132で細胞を処理し、ユビキチン化タンパク質の精製のために氷上で細胞を適切に超音波処理することを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt;上皮腸細胞

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質品質の迅速評価(英語)

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

クライオ電子顕微鏡による微小管-タンパク質複合体の研究のための哺乳類細胞からの修飾微小管抽出

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...