Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81972624)의 DL 보조금으로 지원되었습니다.

참고 : H1299 세포는 중국 과학원의 줄기 세포 은행에서 친절하게 제공했으며 마이코 플라스마 오염에 대해 음성으로 입증되었습니다.
1. 세포 배양
<ol><li>초기 배양의 경우, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 글루타민 첨가제, 1% 나트륨 피루브산염 및 항생제(100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신)가 보충된 RPMI 1640 배지 10-12mL가 포함된 10cm 페트리 접시에 인간 폐 선암 ?...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions.">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li><li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling.">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li><li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

유비퀴틴화는 거의 모든 생리적 및 병리학적 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다2. 최근 몇 년 동안 신호 전달 경로에서 유비퀴틴의 분자 역할과 유비퀴틴 시스템의 변화가 어떻게 다른인간 질병을 유발하는지 이해하는 데 큰 진전이 있었습니다2. 유비퀴틴화 단백질의 정제는 이러한 공정에서 유비퀴틴화의 정확한 역할에 대한 통찰력을 제공하는 데 기여합니...

유비퀴틴은 76 개의 아미노산 1,2,3의 진화 적으로 보존 된 단백질입니다. 유비퀴틴은 활성화 (E1), 접합 (E2) 및 리가 아제 (E3) 효소를 포함하는 캐스케이드를 통해 표적 단백질의 라이신 잔기에 공유 결합합니다. 유비퀴틴은 먼저 E1 효소에 의해 활성화 된 다음 E2 접합 효소로 옮겨집니다. 이어서, E3 유비퀴틴 리가 아제는 유비퀴틴-로딩 된 E2 효소 및 기질 단백질 모두와 상호 작용하고, 유비퀴틴의 C- 말단과 기질 1,2,3,4,5의 라이신 잔기 사이의 이소 펩티드 결합의 형성을 매개한다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴 잔기를 기질 단백질 상의 라이신 잔기 또는 그 자체에 부착시켜 단백질 모노유비퀴틴화 또는 폴리유비퀴틴화를 유도하는 것을 포함한다. 이 유비퀴틴화 과정은 진핵생물에서 세포 내에서 발생하며 다양한 생물학적 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴-프로테 아좀 시스템 1,2,3,4,5를 통해 기질 단백질의 분해를 초래한다. 또한, 유비퀴틴화는 세포3,5에서 단백질 세포 내 국소화, 단백질 복합체 형성 및 단백질 트래피킹을 조절한다. 기질 단백질에 연결된 유비퀴틴 잔기는 데유비퀴틴화 효소(DUB)에 의해 제거될 수 있습니다6,7. 특히, 유비퀴틴 사슬이 조립되는 다양한 방법은 다양한 생물학적 과정을 조절하는 무수한 수단을 제공합니다 1,5. 기질 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 정확한 역할은 지금까지 불완전하게 이해되고 있습니다. 유비퀴틴화 된 단백질의 정제는 다양한 세포 과정에 대한 단백질 유비퀴틴화의 효과의 해명에 기여한다.
p53 단백질은 가장 중요한 종양 억제 단백질 중 하나이며 거의 모든 인간 암 8,9,10,11에서 유전 적 돌연변이 또는 불 활성화를 나타냅니다. p53 안정성 및 활성은 유비퀴틴화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화12,13을 포함하는 번역후 변형에 의해 생체내에서 섬세하게 조절된다. p53 단백질은 다양한 세포에서 6 분에서 40 분 범위의 짧은 반감기를 가지며, 이는 주로 폴리 유비 퀴틴 화 및 후속 프로테아좀 분해10,12로 인해 발생합니다. 마우스 더블분 2 (Mdm2)는 p53의 N 말단에 결합하여 그의 전사 활성12,14,15를 억제하는 p53의 E3 유비퀴틴 리가제이다. Mdm2는 p53의 폴리유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 촉진하여 안정성을 제어하고 p53의 모노유비퀴틴화를 유도하여 핵 수출12,14,15,16을 촉진합니다. 여기서, 유비퀴틴화 Mdm2 매개 p53은 포유동물 세포로부터 유비퀴틴화 단백질을 정제하는 방법을 구체적으로 소개하기 위한 예로 사용된다. 표적 단백질의 유비퀴틴화 상태에 영향을 미치는 조절자는 포유류 세포에서 과발현되거나 녹다운/녹아웃될 때 이 생체 내 유비퀴틴화 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 또한, 유비퀴틴화 단백질은 시험관내 탈유비퀴틴화 분석을 위한 기질로서 사용될 수 있다. 유비퀴틴화된 기질을 개별 DUB와 함께 배양하여 표적 단백질에 대한 특정 DUB를 식별하기 위해 고처리량 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 유비퀴틴화된 단백질은 세포에서 다운스트림 신호전달 단백질을 모집하는 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 유비퀴틴화된 표적 단백질 복합체는 천연 정제 조건 하에서 순차적 면역침전에 의해 정제될 수 있고 질량 분석법에 의해 확인될 수 있다. 현재 프로토콜은 유비퀴틴화에 의해 조절되는 세포 단백질을 조사하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다.
친화성 태그가 부착된 유비퀴틴, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 유비퀴틴 결합 도메인(UBD)의 사용을 포함하는 유비퀴틴화된 단백질을 정제하기 위한 몇 가지 방법이 확립되었습니다17. 여기에서는 포유동물 세포에서 유비퀴틴화 단백질을 정제하기 위한 매개체로 친화성 태그된 유비퀴틴을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 다른 방법들에 비해 이점을 제공한다. 유비퀴틴화 단백질은 강력한 변성제의 존재 하에서 정제되며, 이는 세포 단백질을 선형화하고 단백질-단백질 상호 작용을 방해함으로써 니켈 하전 수지에 대한 비특이적 결합을 감소시킵니다. 대조적으로, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 UBD를 매개체로 사용하는 것은 덜 엄격한 조건에서 정제를 수행해야 하기 때문에 표적 단백질에서 결합 파트너를 효과적으로 배제할 수 없습니다. 더욱이, 정제는 또한 이들 매개체를 사용하여 관련없는 단백질의 결합 증가를 유도 할 수있다. 또한, 다양한 유비퀴틴 결합 유형뿐만 아니라 유비퀴틴 결합 단백질 또는 단리된 UBDs(17)에 의한 모노- 및 폴리-유비퀴틴화에 대한 결합 성향이 존재한다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 모든 세포 유비퀴틴화 단백질을 끌어내리는 데 기여합니다. 대안적으로, 시판되는 항-플래그 또는 항-HA 항체-접합된 아가로스의 사용은 비변성 조건 하에서 대규모 플래그- 또는 HA-태그된 표적 단백질을 면역침전시키는 것을 용이하게 한다. 제2 정제 단계는, 예를 들어, 폴리-히스-태그된 유비퀴틴을 표적화하는 니켈-하전된 수지에 의해, 다운스트림 실험을 위해 고순도의 유비퀴틴화된 표적 단백질을 획득하는데 사용될 수 있다. 특히, 에피토프 태깅 정제 전략은 표적 단백질을 효과적으로 면역침전시키기 위해 특정 항체를 획득할 수 없을 때 적응될 수 있다. 마지막으로, 포유류 세포에서 유비퀴틴화 단백질의 정제는 시험관 내 정제와 비교하여 더 많은 생리학적 조건 하에서 표적 단백질의 유비퀴틴 결합 모드를 유지합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

유비퀴틴화는 기질 단백질의 안정성뿐만 아니라 국소화 및 기능을 조절하는 번역 후 변형의 한 유형입니다. 유비퀴틴화 과정은 진핵생물에서 세포 내에서 발생하며 거의 모든 기본적인 세포 생물학적 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화된 단백질의 정제는 기질 단백질의 기능을 제어하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 조사를 돕습니다. 여기서, 포유류 세포에서 유비퀴틴화 단백질을 정제하기 위한 단계별 절차가 p53 종양 억제 단백질을 예로 들어 설명된다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 정제하였다. 총 세포 플래그-태그된 p53 단백질을 비변성 조건 하에 항-플래그 항체-접합된 아가로스로 정제하였다. 대안적으로, 총 세포 His-태그된 유비퀴틴화 단백질을 변성 조건 하에 니켈-하전된 수지를 사용하여 정제하였다. 용출액에서 유비퀴틴화된 p53 단백질은 특정 항체로 성공적으로 검출되었습니다. 이 절차를 사용하여 주어진 단백질의 유비퀴틴화 된 형태를 포유류 세포로부터 효율적으로 정제하여 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 연구를 용이하게합니다.

도식도는 플래그 태그 p53(Flag-p53) 및 His/HA 이중 태그 유비퀴틴(HH-Ub) 단백질을 보여줍니다(그림 1A). 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 데 사용되는 절차는 그림 1B에 요약되어 있습니다. Poly-His-태그된 유비퀴틴은 포유동물 세포 내의 표적 단백질에 라이게이션될 수 있다. 유비퀴틴화된 단백질은 비변성 조건에서 Flag/M2 비드로 정제하거나 변성 조건에서 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

프로토콜은 p53 종양 억제 단백질을 예로 사용하여 포유류 세포로부터 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 단계별 방법을 설명합니다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제하였다.

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

이 프로토콜을 사용하면 주어진 단백질의 유비퀴틴화 된 형태를 포유류 세포로부터 효율적으로 정제하여 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 시험관내 정제와 비교하여 포유동물 세포에서 유비퀴틴화된 단백질의 정제는 보다 방사선학적 조건 하에서 표적 단백질의 유비퀴틴 결합 모드를 유지합니다. 3 개의 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 1.5 밀리리터의 감소 된 혈청 배지를 추가하여 시작하십시오.형질주입 준비가 된 플라스미드 DNA를 각 튜브에 추가하고 0.2마이크로그램의 녹색 형광 단백질 플라스미드를 추가하여 형질주입 효율을 모니터링합니다. 78 마이크로리터의 리포좀 형질주입 시약을 다른 원심분리 튜브의 4.5 밀리리터의 환원된 혈청 배지에 첨가하여 리포좀을 희석한다. 튜브를 튕겨서 완전히 섞은 다음 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.희석된 DNA 용액 1.5밀리리터가 들어 있는 각 튜브에 희석된 리포좀 용액 1.5밀리리터를 추가합니다. 완전히 혼합하고 플라스미드를 실온에서 최소 20분 동안 리포좀과 가교결합시킵니다. 페트리 접시에서 원래 배지를 버리고 각 접시에 환원 된 혈청 배지 9 밀리리터를 첨가하십시오.리포좀 DNA 혼합물 3 밀리리터를 넣고 플레이트를 앞뒤로 3 번 부드럽게 흔든 다음 플레이트에 혼합물을 고르게 분배하기 위해 좌우로 3 번 혼합하여 용액을 혼합합니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 세포를 5%이산화탄소로 배양합니다. 4 내지 6시간 후에 배지를 교체하고 24 내지 36시간 동안 세포를 계속 배양한다.24 내지 36시간 후, 세포를 MG132로 최종 농도 10 마이크로몰로 4 내지 6시간 동안 처리한다. 배지를 버리고 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척한다. 접시에 1 밀리리터의 PBS를 첨가하십시오.깨끗한 스크레이퍼로 세포를 긁어 제거하고 세포 현탁액을 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 700G에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하였다. 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 800마이크로리터의 얼음처럼 차가운 FLAG 용해 완충액을 각 튜브의 세포에 추가합니다.와류 발진기 또는 피펫 건을 사용하여 세포를 혼합 한 다음 섭씨 4 도의 회전 장치에서 혼합물을 30 분 동안 배양합니다. 각 펄스가 1 초 동안 지속되는 얼음 위의 혼합물을 초음파로 처리하고 혼합물을 5-10 개의 짧은 펄스로 만듭니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 30분 동안 40RPM의 회전 장치에서 배양합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 20-30 분 동안 8, 000 G에서 초음파 샘플을 원심 분리합니다. 상청액을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 세포 추출물 80 마이크로리터를 분취하고, 20 마이크로리터의 5X SDS 로딩 완충액과 혼합한다.샘플을 섭씨 98도에서 5 분 동안 끓입니다. 얼음에서 2 분 동안 식히고 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 이러한 샘플을 입력 그룹으로 사용하여 단백질 발현을 모니터링합니다.다음으로, 30마이크로리터의 항-FLAG M2 항체 접합 비드를 나머지 세포 추출물에 첨가하고 섭씨 4도의 회전 장치에서 최소 4시간 또는 밤새 배양합니다. 1, 500 G에서 섭씨 4도에서 2 분 동안 원심 분리하여 비드를 수집하십시오. 얼음처럼 차가운 FLAG 용해 버퍼 1밀리리터를 비드에 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다.이 단계를 4-6회 반복한 다음 마이크로리터당 200나노그램의 최종 농도로 40마이크로리터의 FLAG 펩타이드를 비드에 추가합니다. 앞서 표시된 대로 회전기에서 2시간 동안 배양한 다음 동일한 온도에서 원심분리합니다. 상청액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 10 마이크로 리터의 5X SDS 로딩 버퍼를 추가합니다.혼합물을 섭씨 98도에서 5 분 동안 끓인 다음 얼음에서 2 분 동안 식힌다. 얼음처럼 차가운 PBS 1밀리리터를 셀 펠릿에 넣고 고르게 섞습니다. 세포 현탁액 100 마이크로리터를 투입된 시료로서 마이크로원심분리 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 700G에서 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하였다.입력 샘플에 80마이크로리터의 FLAG 용해 버퍼를 추가하고 앞에서 설명한 대로 와류 발진기를 사용하여 세포를 혼합합니다. 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 용해시킨 다음, 20 내지 30분 동안 다시 원심분리한다. 원심융합 후 상청액 80 마이크로리터를 새로운 마이크로원심분리 튜브에 분취하고, 20 마이크로리터의 5X SDS 로딩 완충액을 상청액에 첨가한다.혼합물을 섭씨 98도에서 5-10 분 동안 끓인 다음 얼음에서 2 분 동안 식힌다. 나머지 900 마이크로리터의 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 700G에서 원심분리하여 세포 펠렛을 수집하였다. 세포 펠릿에 1 밀리리터의 유비퀴틴 완충액 1을 넣고 세포를 고르게 분배하기 위해 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.용액이 더 이상 점성이 없을 때까지 얼음에 초음파의 10-20 라운드에 세포 용해물을 적용한 다음 용액을 원심 분리하십시오. 상청액을 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 30 마이크로 리터의 니켈 충전 수지를 상청액에 첨가합니다. 회전 장치에서 15RPM으로 4시간 동안 또는 실온에서 밤새 배양한 다음 2분 동안 원심분리합니다.원심 융합 후, 비드를 모으고 1 밀리리터의 유비퀴틴 완충액 1을 첨가한다. 실온에서 10 분 동안 쉐이커에서 회전하면서 배양 한 다음 이전에 도시된 바와 같이 1, 500G에서 2 분 동안 다시 원심 분리합니다. 1 밀리리터의 유비퀴틴 완충액 2를 비드에 첨가하고 배양을 수행 한 후 이전에 표시된 것처럼 원심 분리하여 비드를 수집합니다.이 단계를 한 번 반복합니다. 다음으로, 1 밀리리터의 PBS를 비드에 첨가하고 배양 및 원심 분리에 대해 동일한 절차에 따라 비드를 수집합니다. 이 단계를 다시 한 번 반복하십시오.비드가 결합된 단백질을 실온에서 1시간 동안 0.5몰의 최종 농도로 40 마이크로리터의 이미다졸과 함께 인큐베이션하여 용리시킨다. 배양 후, 1, 500 G에서 2 분 동안 다시 원심 분리한다. 상청액을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 10 마이크로리터의 5X SDS 로딩 버퍼를 추가합니다.용액을 섭씨 98도에서 5 분 동안 끓인 다음 얼음에서 2 분 동안 식힌다. 샘플을 SDS-PAGE로 분해한 다음 웨스턴 블로팅을 통해 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨 해당 항체를 사용하여 표적 단백질을 검출합니다. 화학 발광 이미징 시스템을 시작하여 웨스턴 블로팅의 신호를 감지합니다.니트로셀룰로오스 멤브레인을 카메라 옵스큐라의 앞면이 위로 향하게 놓습니다. 피펫 건을 사용하여 멤브레인에 기판 용액을 고르게 인코딩하십시오. 마지막으로 자동 노출 절차를 선택하여 화학 발광 신호를 캡처하고 이상적인 신호가 획득 될 때까지 노출 시간을 수동으로 조정하십시오.유비퀴틴화된 p53을 포함하는 총 p53 단백질은 비변성 조건하에서 H1299 세포로부터의 FLAG M2 비드로 면역침전시켰다. 용출액을 항 p53 및 항 헤마글루티닌 또는 항 p53 및 단일클론 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 여기서, 조세포 추출물 또는 투입물을 항 p53 및 항 MDM2 단일클론항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.저분자량에서 고분자량까지 번진 밴드로 나타나는 유비퀴틴화된 p53 단백질의 신호는 MDM2가 이들 세포에서 외분비로 발현되었을 때 현저하게 증가했습니다. 이러한 결과는 유비퀴틴화된 p53 단백질이 세포로부터 효과적으로 정제되었음을 시사한다. 다음에, 세포를 변성 조건 하에서 용해시켰다.총 세포 유비퀴틴화 단백질을 니켈 하전 수지로 끌어내린 다음, 항 p53 및 항 헤마글루티닌 모노클로날 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 항 p53 항체 및 항 헤마글루티닌 항체를 사용하여 검출하였다. 여기에 조세포 추출물 또는 투입물을 항 p53 및 항 MDM2 모노클로날 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.결과는 총 유비퀴틴화 단백질 수준은 변하지 않았지만 MDM2가 이들 세포에서 과발현된 후 유비퀴틴화된 p53 단백질 수준이 극적으로 증가했음을 보여주었습니다. 이는 유비퀴틴화된 p53을 함유하는 총 유비퀴틴 단백질이 변성 조건 하에서 세포 용해물로부터 효과적으로 끌어내렸음을 나타낸다. 이 절차를 시도할 때 세포 수집 전에 MG132로 세포를 처리하고 유비퀴틴화된 단백질의 정제를 위해 얼음에서 세포를 적절하게 초음파 처리하는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

초저온 전자 현미경으로 미세소관-단백질 복합체를 연구하기 위해 포유류 세포에서 변형된 미세소관 추출

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...