Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation of China (81972624) til D.L.

MERK: H1299-celler ble vennlig levert av Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences og ble bevist å være negative for mykoplasmaforurensning.
1. Cellekultur
<ol><li>For den opprinnelige kulturen, plasser 1 x 106 celler av human lungeadenokarsinom cellelinje, H1299 i en 10 cm petriskål med 10-12 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutaminadditiv, 1% natriumpyruvat og antibiotika (100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomyci...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions.">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li><li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling.">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li><li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

Ubiquitination spiller en kritisk rolle i nesten alle fysiologiske og patologiske cellulære prosesser2. I de senere år har det blitt gjort store fremskritt i å forstå den molekylære rollen til ubiquitin i signalveier og hvordan endringer i ubiquitin-systemet fører til forskjelligemenneskelige sykdommer. Rensingen av ubiquitinerte proteiner bidrar til å gi innsikt i de nøyaktige rollene til ubiquitination i disse prosessene. Blandingene av ubiquitin-konjugerte protei...

Ubiquitin er et evolusjonært konservert protein av 76 aminosyrer 1,2,3. Ubiquitin binder kovalent lysinrester på målproteiner gjennom kaskader som involverer aktivering (E1), konjugerende (E2) og ligase (E3) enzymer. Ubiquitin aktiveres først av E1-enzymet og overføres deretter til E2-konjugerende enzymer. Deretter interagerer E3 ubiquitin-ligaser med både ubiquitinbelastede E2-enzymer og substratproteiner og formidler dannelsen av en isopeptidbinding mellom C-terminalen av ubiquitin og en lysinrest i substratet 1,2,3,4,5. Ubiquitination innebærer festing av ubiquitin deler til lysinrester på substratproteiner eller til seg selv, noe som fører til protein monoubiquitination eller polyubiquitination. Denne ubiquitinasjonsprosessen skjer intracellulært i eukaryoter og regulerer et stort utvalg av biologiske prosesser. Ubiquitination resulterer i nedbrytning av substratproteiner via ubiquitin-proteasomsystemet 1,2,3,4,5. I tillegg modulerer ubiquitination protein subcellulær lokalisering, proteinkompleksdannelse og proteinhandel i celler 3,5. Ubiquitindeler ligert til substratproteiner kan fjernes ved deubiquitinating enzymer (DUBs) 6,7. Spesielt gir de forskjellige måtene som ubiquitinkjeder er satt sammen et mylder av midler for å regulere ulike biologiske prosesser 1,5. De nøyaktige rollene til ubiquitination i regulering av substratproteinfunksjonen forblir ufullstendig forstått til nå. Rensingen av ubiquitinated proteiner bidrar til å belyse effekten av protein ubiquitination på en rekke cellulære prosesser.
P53-proteinet er et av de viktigste tumorsuppressorproteinene og utviser genetiske mutasjoner eller inaktivering i nesten alle humane kreftformer 8,9,10,11. P53 stabilitet og aktivitet reguleres delikat in vivo ved posttranslasjonelle modifikasjoner, inkludert ubiquitination, fosforylering, acetylering og metylering12,13. P53-proteinet har en kort halveringstid fra 6 minutter til 40 minutter i forskjellige celler, noe som hovedsakelig skyldes polyubiquitinering og påfølgende proteasomal nedbrytning10,12. Mus dobbelt minutt 2 (Mdm2) er en E3 ubiquitin ligase av p53 som binder seg til N-enden av p53 for å hemme dens transkripsjonsaktivitet12,14,15. Mdm2 fremmer polyubiquitination og proteasomal nedbrytning av p53 for å kontrollere stabiliteten og induserer monoubiquitination av p53 for å lette sin kjernefysiske eksport12,14,15,16. Her brukes Mdm2-mediert p53 ubiquitination som et eksempel for å introdusere en metode for rensing av ubiquitinerte proteiner fra pattedyrceller i detalj. Regulatorene som påvirker ubiquitinasjonsstatusen til målproteiner, kan identifiseres ved hjelp av denne in vivo ubiquitination-analysen når de overuttrykkes eller slås ned / slås ut i pattedyrceller. I tillegg kan ubiquitinerte proteiner brukes som substrater for in vitro deubiquitination assay. En høy gjennomstrømningsscreening kan utføres for å identifisere spesifikke DUBer for målproteiner ved å inkubere ubiquitinerte substrater med individuelle DUBs. Ubiquitinated proteiner kan fungere som et stillas for å rekruttere nedstrøms signalproteiner i celler. Et ubiquitinated målproteinkompleks kan renses ved sekvensiell immunprecipitation under innfødte renseforhold og identifiseres ved massespektrometri. Den nåværende protokollen kan i stor grad brukes til å undersøke de cellulære proteiner regulert av ubiquitination.
Flere metoder er etablert for å rense ubiquitinerte proteiner, som inkluderer bruk av affinitetsmerkede ubiquitin, ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerte ubiquitinbindende domener (UBDs)17. Her gir vi en protokoll som bruker affinitetsmerket ubiquitin som mediator for å rense ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller. Bruken av poly-His-merket ubiquitin gir fordeler i forhold til de andre metodene. Ubiquitinerte proteiner renses i nærvær av sterke denaturanter, noe som reduserer ikke-spesifikk binding til nikkelladet harpiks ved å linearisere cellulære proteiner og forstyrre protein-protein-interaksjoner. I motsetning til dette kan bruk av ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerte UBDs som mediatorer ikke effektivt utelukke bindende partnere fra målprotein fordi rensing må utføres under mindre strenge forhold. Videre kan rensing også føre til økt binding av ikke-relaterte proteiner ved bruk av disse mediatorene. I tillegg er det en bindende tilbøyelighet for ulike ubiquitinkoblingstyper samt mono- og poly-ubiquitinering av ubiquitinbindende proteiner eller isolerte UBDs17. Bruken av poly-His-merket ubiquitin bidrar til å trekke ned alle cellulære ubiquitinerte proteiner. Alternativt kan bruk av kommersielt tilgjengelige anti-flagg eller anti-HA antistoffkonjugert agarose gjøre det lettere å immunsupplere storskala Flag- eller HA-merkede målproteiner under ikke-naturlige forhold. Et annet rensetrinn, for eksempel ved nikkelladet harpiks rettet mot poly-His-merket ubiquitin, kan brukes til å skaffe ubiquitinated målproteiner med høy renhet for nedstrøms eksperimenter. Spesielt kan en epitop merking rensing strategi tilpasses når et spesifikt antistoff ikke kan erverves for å immunoprecipitate målproteiner effektivt. Endelig beholder rensing av ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller, sammenlignet med rensing in vitro, ubiquitin-koblingsmodusen for målproteiner under mer fysiologiske forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

Ubiquitination er en type posttranslasjonell modifikasjon som regulerer ikke bare stabiliteten, men også lokaliseringen og funksjonen til et substratprotein. Ubiquitinasjonsprosessen skjer intracellulært i eukaryoter og regulerer nesten alle grunnleggende cellulære biologiske prosesser. Rensing av ubiquitinerte proteiner hjelper undersøkelsen av rollen som ubiquitination i å kontrollere funksjonen av substratproteiner. Her beskrives en trinnvis prosedyre for å rense ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller med p53 tumor suppressor protein som et eksempel. Ubiquitinated p53 proteiner ble renset under strenge nondenaturing og denaturing forhold. Totalt cellulært Flag-merket p53-protein ble renset med anti-Flag antistoffkonjugert agarose under ikke-naturlige forhold. Alternativt ble totalt cellulært His-merket ubiquitinated protein renset ved hjelp av nikkelladet harpiks under denatureringsforhold. Ubiquitinated p53 proteiner i eluates ble vellykket oppdaget med spesifikke antistoffer. Ved hjelp av denne prosedyren kan de ubiquitinerte formene av et gitt protein effektivt renses fra pattedyrceller, noe som letter studier av rollene til ubiquitination i regulering av proteinfunksjon.

Det skjematiske diagrammet viser Flag-tagged p53 (Flag-p53) og His/HA dobbeltmerkede ubiquitin (HH-Ub) proteiner (figur 1A). Prosedyrene som brukes til å rense ubiquitinerte proteiner er oppsummert i figur 1B. Poly-His-merket ubiquitin kan ligeres for å målrette proteiner i pattedyrceller. Ubiquitinated proteiner kan renses med Flag / M2 perler under nondenaturing forhold eller ved immobilisert metall ion affinitet kromatografi (IMAC) under denaturerende forh...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Protokollen beskriver en trinnvis metode for å rense ubiquitinerte proteiner fra pattedyrceller ved hjelp av p53 tumor suppressor protein som et eksempel. Ubiquitinated p53 proteiner ble renset fra celler under strenge nondenaturing og denaturing forhold.

Rensing av allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Ved hjelp av denne protokollen kan de allestedsnærværende formene av et gitt protein effektivt renses fra pattedyrceller, noe som letter studier av rollene til ubiquitination i regulering av proteinfunksjon. Rensing av ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller sammenlignet med rensing in vitro beholder ubiquitinkoblingsmodusen til målproteiner under mer radiologisk tilstand. Begynn med å legge til 1,5 milliliter redusert serummedium i tre 15 milliliter sentrifugerør.Legg til plasmid-DNA klar for transfeksjon til hvert rør og tilsett 0,2 mikrogram grønt fluorescerende proteinplasmid for å overvåke transfeksjonseffektiviteten. Tilsett 78 mikroliter liposomtransfeksjonsreagens til 4,5 ml redusert serummedium i et annet sentrifugerør for å fortynne liposomene. Bland grundig ved å flikke på røret og la det stå i fem minutter ved romtemperatur.Tilsett 1,5 ml av den fortynnede liposomoppløsningen i hvert rør som inneholder 1,5 milliliter av den fortynnede DNA-løsningen. Bland grundig og krysskoble plasmidene med liposomene i minst 20 minutter ved romtemperatur. Kast det opprinnelige mediet fra petriskålene og tilsett ni milliliter av det reduserte serummediet i hver tallerken.Tilsett tre milliliter av liposom-DNA-blandingen og bland løsningen ved å forsiktig riste platen frem og tilbake tre ganger og deretter til venstre og høyre tre ganger for jevn fordeling av blandingen på platen. Dyrk cellene i den fuktede inkubatoren ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Bytt ut mediet etter fire til seks timer og fortsett å dyrke cellene i 24 til 36 timer.Etter 24 til 36 timer, behandle cellene med MG132 ved en endelig konsentrasjon på 10 mikromolar i fire til seks timer. Kast mediet og vask cellene to ganger med iskald PBS. Tilsett en milliliter PBS til parabolen.Fjern cellene ved å skrape dem med en ren skrape og overfør cellesuspensjonen til mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved 700 G i fem minutter for å samle cellepellets. Tilsett 800 mikroliter av den iskalde FLAG-lysebufferen supplert med proteasehemmercocktail til cellene i hvert rør.Bland cellene ved hjelp av en virveloscillator eller en pipettepistol og inkuber deretter blandingen på en rotator ved fire grader Celsius i 30 minutter. Ultralyd blandingen på isen med hver puls som varer ett sekund, og utsett blandingen for fem til 10 korte pulser. Inkuber blandingen på en rotator ved 40 o / min i 30 minutter ved fire grader Celsius.Sentrifuger deretter ultralydsprøvene ved 8.000 G i 20 til 30 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør. Aliquot 80 mikroliter av celleekstraktet og bland med 20 mikroliter 5X SDS-belastningsbuffer.Kok prøvene ved 98 grader Celsius i fem minutter. Avkjøl på is i to minutter og oppbevar ved minus 20 grader Celsius til bruk. Bruk disse prøvene som inngangsgruppe for å overvåke proteinuttrykk.Deretter legger du til 30 mikroliter av anti-FLAG M2 antistoffkonjugerte perler til de resterende celleekstraktene og inkuberer på en rotator ved fire grader Celsius i minst fire timer eller over natten. Sentrifuge ved 1.500 G i to minutter ved fire grader Celsius for å samle perlene. Tilsett en milliliter av den iskalde FLAG-lysebufferen til perlene og bland ved å invertere røret flere ganger.Gjenta dette trinnet fire til seks ganger, og tilsett deretter 40 mikroliter av FLAG-peptidene ved en endelig konsentrasjon på 200 nanogram per mikroliter til perlene. Inkuber på en rotator i to timer som vist tidligere og deretter sentrifuge ved samme temperatur. Overfør supernatanten til et nytt mikrocentrifugerør og tilsett 10 mikroliter 5X SDS lastebuffer.Kok blandingen ved 98 grader Celsius i fem minutter og avkjøl den deretter på is i to minutter. Tilsett en milliliter av den iskalde PBS til cellepellets og bland jevnt. Aliquot 100 mikroliter av cellesuspensjonen i et mikrocentrifugerør som inngangsprøve og sentrifuge ved 700 G i fem minutter ved fire grader Celsius for å samle cellepellets.Tilsett 80 mikroliter FLAG-lysisbuffer til inngangsprøven og bland cellene ved hjelp av en virveloscillator som vist tidligere. Lyse cellene på is i en time og sentrifuger deretter igjen i 20 til 30 minutter. Etter sentrifusjon aliquot 80 mikroliter av supernatanten i et nytt mikrosentrifugerør og tilsett 20 mikroliter 5X SDS lastebuffer til supernatanten.Kok blandingen ved 98 grader Celsius i fem til 10 minutter og avkjøl deretter på is i to minutter. Sentrifuge de resterende 900 mikroliter av cellesuspensjonen ved 700 G i fem minutter ved fire grader Celsius for å samle cellepelleten. Tilsett en milliliter ubiquitin buffer 1 til cellepellets og bland ved pipettering opp og ned flere ganger for å fordele cellene jevnt.Utsett cellelysatene til 10 til 20 runder med ultralydbehandling på is til løsningen ikke lenger er viskøs, og sentrifuger deretter løsningen. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør og tilsett 30 mikroliter nikkelladet harpiks til supernatanten. Inkuber på en rotator ved 15 o / min i fire timer eller over natten ved romtemperatur og sentrifuger deretter i to minutter.Etter sentrifusjon, samle perlene og tilsett en milliliter ubiquitin buffer 1 til den. Inkuber med rotasjon i en shaker i 10 minutter ved romtemperatur og sentrifuger igjen ved 1.500 G i to minutter, som vist tidligere. Tilsett en milliliter ubiquitin buffer 2 til perlene og utfør inkubasjon etterfulgt av sentrifugering, som vist tidligere, for å samle perlene.Gjenta dette trinnet én gang. Deretter legger du til en milliliter PBS til perlene og følger samme prosedyre for inkubasjon og sentrifugering for å samle perlene. Gjenta dette trinnet igjen.Eluere bundne proteiner ved å inkubere perlene med 40 mikroliter imidazol ved en endelig konsentrasjon på 0,5 molar i en time ved romtemperatur. Etter inkubasjon, sentrifuger igjen ved 1.500 G i to minutter. Overfør supernatanten til et rent mikrosentrifugerrør og tilsett 10 mikroliter 5X SDS-belastningsbuffer.Kok løsningen ved 98 grader Celsius i fem minutter og avkjøl den deretter på is i to minutter. Løs prøvene ved hjelp av SDS-PAGE og overfør dem deretter til en nitrocellulosemembran ved vestlig blotting for å oppdage målproteiner ved hjelp av de tilsvarende antistoffene. Start kjemiluminescensavbildningssystemet for å oppdage signaler fra vestlig blotting.Plasser nitrocellulosemembranen i camera obscura med forsiden opp. Kod substratløsningen jevnt på membranen ved hjelp av en pipettepistol. Til slutt velger du den automatiske eksponeringsprosedyren for å fange opp de kjemiluminescerende signalene og justere eksponeringstiden manuelt til et ideelt signal er oppnådd.Totalt p53-protein, inkludert ubiquitinert p53, ble immunpredusert med FLAG M2-perler fra H1299-celler under ikke-denaturerende forhold. Eluatet ble utsatt for western blotting med anti p53 og anti hemagglutinin eller med anti p53 og monoklonale antistoffer. Her ble råcelleekstraktene eller tilførselen utsatt for western blotting med anti p53 og anti MDM2 monoklonale antistoffer.Signalet fra ubiquitinated p53-protein som fremstår som et smurt bånd fra lav til høy molekylvekt, ble markant økt når MDM2 ble ektopisk uttrykt i disse cellene. Dette resultatet antyder at det ubiquitinerte p53-proteinet har blitt effektivt renset fra celler. Deretter ble cellene lyset under denaturerende forhold.De totale cellulære ubiquitinerte proteinene ble trukket ned med nikkelladet harpiks og ble deretter utsatt for vestlig blotting med anti p53 og anti hemagglutinin monoklonale antistoffer. Ubiquitinated p53 protein ble påvist med et anti p53 antistoff og et anti hemagglutinin antistoff. Her på råcelleekstrakter eller input ble utsatt for western blotting med anti p53 og anti MDM2 monoklonale antistoffer.Resultatene viste at det totale ubiquitinerte proteinnivået var uendret, men det ubiquitinerte p53-proteinnivået ble dramatisk økt etter at MDM2 ble overuttrykt i disse cellene. Dette indikerer at de totale ubiquitinproteinene som inneholder ubiquitinated p53 effektivt ble trukket ned fra cellelysater under denatureringsforhold. Når du prøver denne prosedyren, husk å behandle cellene med MG132 før celleinnsamling og ultralyd cellene riktig på is for rensing av ubiquitinerte proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rensing av biotinylerte celleoverflateproteiner fra<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epiteliale gutceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rensing av hepatocytter og sinusformet endotelceller fra musen leveren perfusjon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Rask vurdering av membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelsesekskluderingskromatografi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstrahering av modifiserte mikrotubuli fra pattedyrceller for å studere mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...