Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81972624) para D.L.

NOTA: As células H1299 foram gentilmente fornecidas pelo Banco de Células-Tronco da Academia Chinesa de Ciências e provaram ser negativas para a contaminação por micoplasma.
1. Cultura celular
<ol><li>Para a cultura inicial, coloque 1 x 106 células de linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar humano, H1299 em uma placa de Petri de 10 cm com 10-12 mL de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), aditivo de glutamina a 1%, piruvato de s?...

<ol>
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H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. 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(Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

A ubiquitinação desempenha um papel crítico em quase todos os processos celulares fisiológicos e patológicos2. Nos últimos anos, grandes progressos têm sido feitos na compreensão do papel molecular da ubiquitina nas vias de sinalização e como as mudanças no sistema de ubiquitina levam a diferentes doenças humanas2. A purificação de proteínas ubiquitinadas contribui para fornecer informações sobre os papéis exatos da ubiquitinação nesses processos. As mis...

A ubiquitina é uma proteína conservada evolutivamente de 76 aminoácidos 1,2,3. A ubiquitina liga-se covalentemente aos resíduos de lisina nas proteínas-alvo através de cascatas que envolvem enzimas ativadoras (E1), conjugantes (E2) e ligase (E3). A ubiquitina é ativada pela primeira vez pela enzima E1 e é então transferida para as enzimas conjugadoras E2. Posteriormente, os ligases de ubiquitina E3 interagem com enzimas E2 carregadas de ubiquitina e proteínas de substrato e mediam a formação de uma ligação isopeptídica entre o terminal C da ubiquitina e um resíduo de lisina no substrato 1,2,3,4,5. A ubiquitinação envolve a ligação de metades de ubiquitina a resíduos de lisina em proteínas do substrato ou a si mesma, levando à monoubiquitinação ou poliubiquitinação de proteínas. Este processo de ubiquitinação ocorre intracelularmente em eucariotas e regula uma grande variedade de processos biológicos. A ubiquitinação resulta na degradação de proteínas do substrato através do sistema ubiquitina-proteassoma 1,2,3,4,5. Além disso, a ubiquitinação modula a localização subcelular de proteínas, a formação de complexos proteicos e o tráfico de proteínas nas células 3,5. Parcelas de ubiquitina ligadas a proteínas de substrato podem ser removidas por enzimas desubiquitinantes (DUBs)6,7. Notavelmente, as diferentes maneiras pelas quais as cadeias de ubiquitina são montadas fornecem uma miríade de meios para regular vários processos biológicos 1,5. Os papéis exatos da ubiquitinação na regulação da função proteica do substrato permanecem incompletamente compreendidos até agora. A purificação de proteínas ubiquitinadas contribui para a elucidação dos efeitos da ubiquitinação de proteínas em uma variedade de processos celulares.
A proteína p53 é uma das mais importantes proteínas supressoras de tumor e apresenta mutações genéticas ou inativação em quase todos os cânceres humanos 8,9,10,11. A estabilidade e a atividade do p53 são delicadamente reguladas in vivo por modificações pós-traducionais, incluindo ubiquitinação, fosforilação, acetilação e metilação12,13. A proteína p53 tem uma meia-vida curta variando de 6 min a 40 min em várias células, o que resulta principalmente de sua poliubiquitinação e subsequente degradação proteassômica10,12. O duplo minuto 2 do rato (Mdm2) é uma ligase de ubiquitina E3 de p53 que se liga ao N-terminal de p53 para inibir sua atividade transcricional12,14,15. O Mdm2 promove a poliubiquitinação e degradação proteassômica do p53 para controlar sua estabilidade e induz a monoubiquitinação do p53 para facilitar sua exportação nuclear12,14,15,16. Aqui, a ubiquitinação p53 mediada por Mdm2 é usada como exemplo para introduzir um método para a purificação de proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos em detalhes. Os reguladores que influenciam o status de ubiquitinação das proteínas-alvo podem ser identificados usando este ensaio de ubiquitinação in vivo quando são superexpressos ou derrubados / nocauteados em células de mamíferos. Além disso, proteínas ubiquitinadas podem ser usadas como substratos para o ensaio de desubiquitinação in vitro. Uma triagem de alto rendimento pode ser realizada para identificar DUBs específicos para proteínas-alvo, incubando substratos ubiquitinados com DUBs individuais. As proteínas ubiquitinadas podem atuar como um andaime para recrutar proteínas de sinalização a jusante nas células. Um complexo proteico-alvo ubiquitinado pode ser purificado por imunoprecipitação sequencial em condições de purificação nativas e identificado por espectrometria de massa. O protocolo atual pode ser amplamente utilizado para investigar as proteínas celulares reguladas pela ubiquitinação.
Vários métodos têm sido estabelecidos para purificar proteínas ubiquitinadas, que incluem o uso de ubiquitina marcada com afinidade, anticorpos ubiquitina, proteínas ligadoras de ubiquitina e domínios isolados de ligação à ubiquitina (UBDs)17. Aqui, fornecemos um protocolo usando ubiquitina marcada com afinidade como mediador para purificar proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos. O uso de ubiquitina poli-His-tagged oferece vantagens sobre os outros métodos. As proteínas ubiquitinadas são purificadas na presença de desnaturantes fortes, o que reduz a ligação inespecífica à resina carregada de níquel, linearizando as proteínas celulares e interrompendo as interações proteína-proteína. Em contraste, o uso de anticorpos de ubiquitina, proteínas de ligação à ubiquitina e UBDs isoladas como mediadores não pode efetivamente excluir parceiros de ligação da proteína-alvo porque a purificação precisa ser realizada sob condições menos rigorosas. Além disso, a purificação também pode levar ao aumento da ligação de proteínas não relacionadas usando esses mediadores. Além disso, há uma propensão de ligação para vários tipos de ligação de ubiquitina, bem como mono e poli-ubiquitinação por proteínas ligadoras de ubiquitina ou UBDs isoladas17. O uso de ubiquitina poli-His-etiquetada contribui para puxar para baixo todas as proteínas ubiquitinadas celulares. Alternativamente, o uso de agarose conjugada com anticorpos anti-Flag ou anti-HA comercialmente disponíveis facilita a imunoprecipitação de proteínas-alvo marcadas com Flag ou HA em larga escala em condições não desnaturantes. Uma segunda etapa de purificação, por exemplo, por resina carregada de níquel visando ubiquitina poli-His-marcada, pode ser usada para adquirir proteínas-alvo ubiquitinadas com alta pureza para experimentos a jusante. Notavelmente, uma estratégia de purificação de marcação de epítopos pode ser adaptada quando um anticorpo específico não pode ser adquirido para imunoprecipitar proteínas-alvo de forma eficaz. Finalmente, a purificação de proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos, em comparação com a purificação in vitro, mantém o modo de ligação da ubiquitina das proteínas-alvo sob condições mais fisiológicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

A ubiquitinação é um tipo de modificação pós-translacional que regula não apenas a estabilidade, mas também a localização e a função de uma proteína de substrato. O processo de ubiquitinação ocorre intracelularmente em eucariotas e regula quase todos os processos biológicos celulares básicos. A purificação de proteínas ubiquitinadas auxilia na investigação do papel da ubiquitinação no controle da função das proteínas do substrato. Aqui, um procedimento passo-a-passo para purificar proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos é descrito com a proteína supressora de tumor p53 como exemplo. As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas sob rigorosas condições de não desnaturação e desnaturação. A proteína p53 total celular marcada com Flag foi purificada com agarose conjugada com anticorpos anti-Flag em condições não desnaturantes. Alternativamente, a proteína ubiquitinada celular total marcada com His foi purificada usando resina carregada de níquel sob condições de desnaturação. As proteínas p53 ubiquitinadas nos eluídos foram detectadas com sucesso com anticorpos específicos. Usando este procedimento, as formas ubiquitinadas de uma determinada proteína podem ser eficientemente purificadas a partir de células de mamíferos, facilitando estudos sobre os papéis da ubiquitinação na regulação da função da proteína.

O diagrama esquemático mostra as proteínas p53 (Flag-p53) e His/HA double-tagged ubiquitina (HH-Ub) (Figura 1A). Os procedimentos utilizados para purificar proteínas ubiquitinadas estão resumidos na Figura 1B. A ubiquitina com etiqueta Poly-His pode ser ligada a proteínas-alvo em células de mamíferos. As proteínas ubiquitinadas podem ser purificadas com esferas Flag/M2 em condições não desnaturantes ou por cromatografia imobilizada de afinidade de ío...

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Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

O protocolo descreve um método passo-a-passo para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos usando a proteína supressora de tumor p53 como exemplo. As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas a partir de células sob rigorosas condições de não desnaturação e desnaturação.

Purificação de proteínas p53 ubiquitinadas de células de mamíferos

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Usando este protocolo, as formas ubiquitinadas de uma determinada proteína podem ser eficientemente purificadas a partir de células de mamíferos, facilitando estudos sobre os papéis da ubiquitinação na regulação da função proteica. A purificação de proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos em comparação com a purificação in vitro retém o modo de ligação da ubiquitina das proteínas-alvo sob condição mais radiológica. Comece adicionando 1,5 mililitros de meio sérico reduzido em três tubos de centrífuga de 15 mililitros.Adicione DNA plasmidial pronto para transfecção a cada tubo e adicione 0,2 microgramas de plasmídeo de proteína fluorescente verde para monitorar a eficiência da transfecção. Adicione 78 microlitros de reagente de transfecção de lipossomas a 4,5 mililitros de meio sérico reduzido em outro tubo de centrífuga para diluir os lipossomas. Misture bem mexendo o tubo e, em seguida, deixe-o repousar durante cinco minutos à temperatura ambiente.Adicionar 1,5 mililitros da solução de lipossoma diluída em cada tubo contendo 1,5 mililitros da solução de ADN diluído. Misture bem e faça a ligação cruzada dos plasmídeos com os lipossomas por pelo menos 20 minutos à temperatura ambiente. Descarte o meio original das placas de Petri e adicione nove mililitros do meio sérico reduzido em cada prato.Adicione três mililitros da mistura de DNA do lipossomo e misture a solução agitando suavemente a placa para frente e para trás três vezes e, em seguida, para a esquerda e para a direita três vezes para distribuição uniforme da mistura na placa. Cultivar as células na incubadora umidificada a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. Substitua o meio após quatro a seis horas e continue a cultivar as células por 24 a 36 horas.Após 24 a 36 horas, trate as células com MG132 a uma concentração final de 10 micromolares durante quatro a seis horas. Descarte o meio e lave as células duas vezes com PBS gelado. Adicione um mililitro de PBS ao prato.Remova as células raspando-as com um raspador limpo e transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga. Centrifugar a 700 G durante cinco minutos para recolher os pellets celulares. Adicione 800 microlitros do tampão de lise FLAG gelado suplementado com coquetel inibidor de protease às células de cada tubo.Misture as células usando um oscilador de vórtice ou uma pistola de pipeta e, em seguida, incube a mistura em um rotador a quatro graus Celsius por 30 minutos. Ultrasonice a mistura no gelo com cada pulso durando um segundo e submeta a mistura a cinco a 10 pulsos breves. Incubar a mistura num rotador a 40 RPM durante 30 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, centrifugar as amostras ultra-sonizadas a 8.000 G por 20 a 30 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Aliquot 80 microlitros do extrato da célula e misture com 20 microlitros de buffer de carregamento SDS 5X.Ferva as amostras a 98 graus Celsius por cinco minutos. Esfrie no gelo por dois minutos e armazene a menos 20 graus Celsius até o uso. Use essas amostras como o grupo de entrada para monitorar a expressão de proteínas.Em seguida, adicione 30 microlitros das esferas conjugadas do anticorpo anti-FLAG M2 aos extratos celulares restantes e incube em um rotador a quatro graus Celsius por pelo menos quatro horas ou durante a noite. Centrífuga a 1.500 G por dois minutos a quatro graus Celsius para coletar as contas. Adicione um mililitro do tampão de lise FLAG gelado às contas e misture invertendo o tubo várias vezes.Repita este passo quatro a seis vezes e, em seguida, adicione 40 microlitros dos péptidos FLAG a uma concentração final de 200 nanogramas por microlitro às contas. Incubar em um rotador por duas horas, como mostrado anteriormente, e depois centrifugar na mesma temperatura. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e adicione 10 microlitros de buffer de carga SDS 5X.Ferva a mistura a 98 graus Celsius por cinco minutos e depois esfrie no gelo por dois minutos. Adicione um mililitro do PBS gelado aos pellets de células e misture uniformemente. Aliquot 100 microlitros da suspensão celular em um tubo de microcentrífuga como a amostra de entrada e centrífuga a 700 G por cinco minutos a quatro graus Celsius para coletar os pellets celulares.Adicione 80 microlitros de tampão de lise FLAG à amostra de entrada e misture as células usando um oscilador de vórtice, como mostrado anteriormente. Lise as células no gelo por uma hora e depois centrifugar novamente por 20 a 30 minutos. Após a alíquota de centrifusão, coloque 80 microlitros do sobrenadante em um novo tubo de microcentrífuga e adicione 20 microlitros de tampão de carga SDS 5X ao sobrenadante.Ferva a mistura a 98 graus Celsius por cinco a 10 minutos e depois esfrie no gelo por dois minutos. Centrifugar os 900 microlitros restantes da suspensão celular a 700 G por cinco minutos a quatro graus Celsius para coletar a pastilha celular. Adicione um mililitro de tampão de ubiquitina 1 aos pellets de células e misture pipetando para cima e para baixo várias vezes para distribuir as células uniformemente.Submeta a célula lisa a 10 a 20 rodadas de ultrassom no gelo até que a solução não seja mais viscosa e, em seguida, centrifugar a solução. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e adicione 30 microlitros de resina carregada de níquel ao sobrenadante. Incubar num rotador a 15 RPM durante quatro horas ou durante a noite à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar durante dois minutos.Após a centrifusão, colete as contas e adicione um mililitro de tampão de ubiquitina 1 a ele. Incubar com rotação num agitador durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar novamente a 1 500 G durante dois minutos, como indicado anteriormente. Adicione um mililitro de tampão de ubiquitina 2 às contas e realize a incubação seguida de centrifugação, como mostrado anteriormente, para coletar as contas.Repita esta etapa uma vez. Em seguida, adicione um mililitro de PBS às contas e siga o mesmo procedimento de incubação e centrifugação para coletar as contas. Repita este passo mais uma vez.Elute proteínas ligadas por incubação das esferas com 40 microlitros de imidazol a uma concentração final de 0,5 molar por uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, centrifugar novamente a 1.500 G por dois minutos. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo e adicione 10 microlitros de buffer de carga SDS 5X.Ferva a solução a 98 graus Celsius por cinco minutos e depois esfrie no gelo por dois minutos. Resolva as amostras por SDS-PAGE e, em seguida, transfira-as para uma membrana de nitrocelulose por western blotting para detectar proteínas-alvo usando os anticorpos correspondentes. Inicie o sistema de imagem de quimioluminescência para detectar sinais de western blotting.Coloque a membrana de nitrocelulose na câmera obscura virada para cima. Codifique a solução de substrato uniformemente na membrana usando uma pistola de pipeta. Finalmente, selecione o procedimento de exposição automática para capturar os sinais quimioluminescentes e ajuste manualmente o tempo de exposição até que um sinal ideal seja adquirido.A proteína p53 total, incluindo a p53 ubiquitinada, foi imunoprecipitada com esferas FLAG M2 de células H1299 em condições não desnaturantes. O eluato foi submetido a western blotting com anti p53 e anti hemaglutinina ou com anticorpos anti p53 e monoclonais. Aqui, os extratos de células brutas ou insumos foram submetidos a western blotting com anticorpos monoclonais anti p53 e anti MDM2.O sinal da proteína p53 ubiquitinada, que aparece como uma banda manchada de baixo a alto peso molecular, foi acentuadamente aumentado quando o MDM2 foi expresso ectopicamente nessas células. Este resultado sugere que a proteína p53 ubiquitinada foi efetivamente purificada a partir das células. Em seguida, as células foram lisadas sob condições de desnaturação.As proteínas ubiquitinadas celulares totais foram puxadas para baixo com resina carregada de níquel e foram então submetidas a western blotting com anticorpos monoclonais anti p53 e anti-hemaglutinina. A proteína p53 ubiquitinada foi detectada usando um anticorpo anti p53 e um anticorpo anti-hemaglutinina. Aqui no momento em que os extratos de células brutas ou de entrada foram submetidos a western blotting com anticorpos monoclonais anti p53 e anti MDM2.Os resultados mostraram que o nível total de proteína ubiquitinada permaneceu inalterado, mas o nível de proteína p53 ubiquitinada aumentou drasticamente após o MDM2 ser superexpresso nessas células. Isso indica que as proteínas totais de ubiquitina contendo p53 ubiquitinado foram efetivamente retiradas dos lisados celulares sob condições de desnaturação. Ao tentar este procedimento, lembre-se de tratar as células com MG132 antes da coleta de células e ultra-sonicar as células adequadamente no gelo para a purificação de proteínas ubiquitinadas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Bioquímica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressão, purificação, cristalização e ensaios enzimáticos de proteínas contendo domínio de Fumarilacetoacetato de hidrolase

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Avaliação Rápida da Qualidade de Proteínas de Membrana por Cromatografia de Exclusão de Tamanho Fluorescente

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extração de Microtúbulos Modificados de Células de Mamíferos para Estudo de Complexos Microtúbulo-Proteína por Microscopia Crio-Eletrônica

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...