Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (81972624) D.L.

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки H1299 были любезно предоставлены Банком стволовых клеток Китайской академии наук и оказались отрицательными для загрязнения микоплазмой.
1. Клеточная культура
<ol><li>Для первоначальной культуры поместите 1 х 106 клеток клеточной линии адено...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions.">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li><li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling.">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li><li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

Убиквитинация играет важнейшую роль практически во всех физиологических и патологических клеточных процессах2. В последние годы был достигнут большой прогресс в понимании молекулярной роли убиквитина в сигнальных путях и того, как изменения в системе убиквитина приводя?...

Убиквитин представляет собой эволюционно сохраненный белок из 76 аминокислот 1,2,3. Убиквитин ковалентно связывает остатки лизина с белками-мишенями через каскады, включающие активирующие (E1), конъюгирующие (E2) и лигазные (E3) ферменты. Убиквитин сначала активируется ферментом E1, а затем переносится на конъюгирующие ферменты E2. Впоследствии лигазы убиквитина Е3 взаимодействуют как с убиквитин-нагруженными ферментами Е2, так и с белками субстрата и опосредуют образование изопептидной связи между С-терминалом убиквитина и остатком лизина в субстрате 1,2,3,4,5. Убиквитинирование включает в себя присоединение фрагментов убиквитина к остаткам лизина на белках субстрата или к самому себе, что приводит к моноубиквитинированию белка или полиубиквитинированию. Этот процесс убиквитинирования происходит внутриклеточным образом у эукариот и регулирует большое разнообразие биологических процессов. Убиквитинирование приводит к деградации белков субстрата через убиквитин-протеасомную систему 1,2,3,4,5. Кроме того, убиквитинирование модулирует субклеточную локализацию белка, образование белкового комплекса и незаконный оборот белка в клетках 3,5. Фрагменты убиквитина, лигированные белкам субстрата, могут быть удалены деубиквитинирующими ферментами (DUBs)6,7. Примечательно, что различные способы, которыми собраны цепи убиквитина, обеспечивают множество средств для регулирования различных биологических процессов 1,5. Точные роли убиквитинирования в регуляции функции субстратного белка до сих пор остаются не полностью изученными. Очистка убиквитинированных белков способствует выяснению влияния убиквитинирования белка на различные клеточные процессы.
Белок p53 является одним из наиболее важных белков-супрессоров опухолей и проявляет генетические мутации или инактивацию почти во всех раковых заболеваниях человека 8,9,10,11. Стабильность и активность p53 деликатно регулируются in vivo посттрансляционными модификациями, включая убиквитинирование, фосфорилирование, ацетилирование и метилирование12,13. Белок p53 имеет короткий период полувыведения от 6 мин до 40 мин в различных клетках, что является результатом в основном его полиубиквитинирования и последующей протеасомальной деградации10,12. Мышиная двойная минута 2 (Mdm2) представляет собой E3-убиквитин-лигазу p53, которая связывается с N-концом p53 для ингибирования его транскрипционной активности 12,14,15. Mdm2 способствует полиубиквитинированию и протеасомальной деградации р53 для контроля его стабильности и индуцирует моноубиквитинацию р53 для облегчения его ядерного экспорта 12,14,15,16. Здесь Mdm2-опосредованная p53 убиквитинация используется в качестве примера для введения способа очистки убиквитинированных белков из клеток млекопитающих в деталях. Регуляторы, которые влияют на статус убиквитинации белков-мишеней, могут быть идентифицированы с помощью этого анализа убиквитинирования in vivo, когда они чрезмерно экспрессируются или сбиваются / выбиваются в клетках млекопитающих. Кроме того, убиквитинированные белки могут быть использованы в качестве субстратов для анализа деубиквитинации in vitro. Высокопроизводительный скрининг может быть выполнен для идентификации конкретных DUB для целевых белков путем инкубации убиквитинированных субстратов с отдельными DUB. Убиквитинированные белки могут действовать как каркас для набора нисходящих сигнальных белков в клетках. Убиквитинированный целевой белковый комплекс может быть очищен последовательным иммунопреципитацией в условиях нативной очистки и идентифицирован масс-спектрометрией. Текущий протокол может быть широко использован для исследования клеточных белков, регулируемых убиквитинацией.
Было установлено несколько методов очистки убиквитинированных белков, которые включают использование аффинно-меченого убиквитина, антител убиквитина, убиквитин-связывающих белков и изолированных убиквитин-связывающих доменов (UBD)17. Здесь мы предоставляем протокол, использующий убиквитин с аффинными метками в качестве медиатора для очистки убиквитинированных белков в клетках млекопитающих. Использование поли-Гис-меченого убиквитина дает преимущества по сравнению с другими методами. Убиквитинированные белки очищаются в присутствии сильных денатурантов, что снижает неспецифическое связывание с никелевой смолой путем линеаризации клеточных белков и нарушения белково-белковых взаимодействий. Напротив, использование убиквитиновых антител, убиквитин-связывающих белков и изолированных UBD в качестве медиаторов не может эффективно исключать связывающих партнеров из целевого белка, потому что очистка должна выполняться в менее строгих условиях. Кроме того, очистка может также привести к усилению связывания несвязанных белков с использованием этих медиаторов. Кроме того, существует склонность к связыванию для различных типов связей убиквитина, а также моно- и полиубиквитинирования убиквитин-связывающими белками или изолированными UBDs17. Использование поли-Гис-меченого убиквитина способствует снижению всех клеточных убиквитинированных белков. Альтернативно, использование коммерчески доступной анти-Флаг или анти-ГК антитело-конъюгированной агарозы облегчает иммунопреципитацию крупномасштабных флаг- или ГК-меченых целевых белков в неденатурирующих условиях. Вторая стадия очистки, например, никелевой смолой, нацеленной на поли-Гис-меченый убиквитин, может быть использована для получения убиквитинированных целевых белков с высокой чистотой для последующих экспериментов. Примечательно, что стратегия очистки эпитопных меток может быть адаптирована, когда специфическое антитело не может быть приобретено для эффективного иммунопреципитации белков-мишеней. Наконец, очистка убиквитинированных белков в клетках млекопитающих, по сравнению с очисткой in vitro, сохраняет режим убиквитиновой связи белков-мишеней в более физиологических условиях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

Убиквитинация — это тип посттрансляционной модификации, которая регулирует не только стабильность, но и локализацию и функцию субстратного белка. Процесс убиквитинирования происходит внутриклеточным образом у эукариот и регулирует практически все основные клеточные биологические процессы. Очистка убиквитинированных белков помогает исследовать роль убиквитинирования в контроле функции субстратных белков. Здесь описана пошаговая процедура очистки убиквитинированных белков в клетках млекопитающих с помощью белка-супрессора опухоли p53 в качестве примера. Убиквитинированные белки р53 очищали в строгих условиях неденатурации и денатурации. Общий клеточный белок p53, помеченный флагом, очищали антифланг-конъюгированной агарозой в неденатурирующих условиях. Альтернативно, общий клеточный убиквитинированный белок, помеченный His, очищали с использованием никелевой смолы в условиях денатурации. Убиквитинированные белки р53 в элюатах были успешно обнаружены со специфическими антителами. Используя эту процедуру, убиквитинированные формы данного белка могут быть эффективно очищены от клеток млекопитающих, что облегчает исследования роли убиквитинирования в регулировании функции белка.

На принципиальной схеме показаны помеченные флагом белки p53 (Flag-p53) и his/HA с двойными метками убиквитина (HH-Ub) (рисунок 1A). Процедуры, используемые для очистки убиквитинированных белков, обобщены на рисунке 1B. Убиквитин, помеченный поли-Гисом, может быть лиги...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Протокол описывает пошаговый метод очистки убиквитинированных белков из клеток млекопитающих с использованием белка-супрессора опухоли p53 в качестве примера. Убиквитинированные белки р53 были очищены из клеток в строгих условиях неденатурации и денатурации.

Очистка убиквитинированных белков p53 из клеток млекопитающих

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Используя этот протокол, убиквитинированные формы данного белка могут быть эффективно очищены от клеток млекопитающих, что облегчает исследования роли убиквитинирования в регулировании функции белка. Очистка убиквитинированных белков в клетках млекопитающих по сравнению с очисткой in vitro сохраняет режим убиквитиновой связи белков-мишеней при более рентгенологических условиях. Начните с добавления 1,5 миллилитров восстановленной сывороточной среды в три 15-миллилитровые центрифужные трубки.Добавьте плазмидную ДНК, готовую к трансфекции, в каждую трубку и добавьте 0,2 мкг зеленой флуоресцентной плазмиды белка для контроля эффективности трансфекции. Добавьте 78 микролитров реагента трансфекции липосом к 4,5 миллилитрам восстановленной сывороточной среды в другой центрифужной трубке для разбавления липосом. Тщательно перемешайте, щелкнув тюбиком, а затем дайте ему постоять в течение пяти минут при комнатной температуре.Добавьте 1,5 миллилитра разбавленного раствора липосом в каждую пробирку, содержащую 1,5 миллилитра разбавленного раствора ДНК. Тщательно перемешайте и смешайте плазмиды с липосомами в течение не менее 20 минут при комнатной температуре. Отбросьте исходную среду из чашки Петри и добавьте в каждую чашку девять миллилитров восстановленной сывороточной среды.Добавьте три миллилитра смеси ДНК липосом и перемешайте раствор, осторожно встряхнув пластину вперед и назад три раза, а затем влево и вправо три раза для равномерного распределения смеси по пластине. Культивируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. Замените среду через четыре-шесть часов и продолжайте культивировать клетки в течение 24-36 часов.Через 24-36 часов обработайте клетки MG132 в конечной концентрации 10 микромоляров в течение четырех-шести часов. Выбросьте среду и дважды промойте ячейки ледяным холодом PBS. Добавьте в блюдо один миллилитр PBS.Удалите ячейки, соскоблив их чистым скребком и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужные трубки. Центрифуга на 700 г в течение пяти минут для сбора гранул клеток. Добавьте 800 микролитров ледяного буфера лизиса FLAG, дополненного коктейлем ингибитора протеазы, к клеткам в каждой трубке.Смешайте ячейки с помощью вихревого генератора или пипетки, а затем инкубируйте смесь на ротаторе при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. Ультразвуком нанесите смесь на лед с каждым импульсом продолжительностью в одну секунду и подвергайте смесь от пяти до 10 коротких импульсов. Инкубируйте смесь на ротаторе при 40 об/мин в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.Затем центрифугируют ультразвуковые образцы при 8 000 G в течение 20-30 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку. Aliquot 80 микролитров клетки извлекают и смешивают с 20 микролитрами 5X SDS нагрузочного буфера.Кипятите образцы при 98 градусах Цельсия в течение пяти минут. Остудить на льду в течение двух минут и хранить при минус 20 градусах Цельсия до использования. Используйте эти образцы в качестве входной группы для мониторинга экспрессии белка.Затем добавьте 30 микролитров конъюгированных шариков антитела АНТИ-FLAG M2 к оставшимся клеточным экстрактам и инкубируйте на ротаторе при четырех градусах Цельсия в течение не менее четырех часов или на ночь. Центрифуга при 1 500 г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия для сбора бусин. Добавьте один миллилитр ледяного буфера лизиса FLAG к шарикам и перемешайте, перевернув трубку несколько раз.Повторите этот шаг четыре-шесть раз, затем добавьте 40 микролитров пептидов FLAG в конечной концентрации 200 нанограммов на микролитр к шарикам. Инкубируйте на ротаторе в течение двух часов, как показано ранее, а затем центрифугируйте при той же температуре. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку и добавьте 10 микролитров 5X SDS нагрузочного буфера.Отварите смесь при 98 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем охладите ее на льду в течение двух минут. Добавьте один миллилитр ледяного холодного PBS в гранулы ячейки и равномерно перемешайте. Aliquot 100 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную трубку в качестве входного образца и центрифугу при 700 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для сбора гранул ячейки.Добавьте 80 микролитров буфера лизиса FLAG к входному образцу и перемешайте ячейки с помощью вихревого генератора, как показано ранее. Лизируйте клетки на льду в течение одного часа, а затем снова центрифугируйте в течение 20-30 минут. После центрифузии аликвот 80 микролитров супернатанта в новую микроцентрифужную трубку и добавляют 20 микролитров 5X SDS нагрузочного буфера к супернатанту.Кипятите смесь при 98 градусах Цельсия в течение пяти-10 минут, а затем охладите на льду в течение двух минут. Центрифугируйте оставшиеся 900 микролитров клеточной суспензии при 700 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы собрать гранулу ячейки. Добавьте один миллилитр буфера убиквитина 1 к гранулам клеток и перемешайте путем пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы равномерно распределить клетки.Подвергайте клетку лизатам до 10-20 раундов ультразвуковой обработки на льду до тех пор, пока раствор не перестанет быть вязким, а затем центрифугируют раствор. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку и добавьте к нему 30 микролитров никелевой смолы. Инкубировать на ротаторе при 15 об/мин в течение четырех часов или на ночь при комнатной температуре, а затем центрифугу в течение двух минут.После центрифузии соберите шарики и добавьте в него один миллилитр буфера убиквитина 1. Инкубировать с вращением в шейкере в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем снова центрифугировать при 1 500 г в течение двух минут, как показано ранее. Добавьте один миллилитр буфера убиквитина 2 к шарикам и выполните инкубацию с последующим центрифугированием, как показано ранее, для сбора шариков.Повторите этот шаг один раз. Затем добавьте один миллилитр PBS в шарики и следуйте той же процедуре инкубации и центрифугирования для сбора шариков. Повторите этот шаг еще раз.Элюируют связанные белки путем инкубации шариков с 40 микролитрами имидазола в конечной концентрации 0,5 моляра в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации центрифугируют снова по 1 500 г в течение двух минут. Перенесите супернатант в чистую микроцентрифужную трубку и добавьте 10 микролитров 5X SDS загрузочного буфера.Кипятите раствор при 98 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем охладите его на льду в течение двух минут. Разрешите образцы с помощью SDS-PAGE, а затем перенесите их на нитроцеллюлозную мембрану с помощью вестерн-блоттинга для обнаружения целевых белков с использованием соответствующих антител. Запустите систему визуализации хемилюминесценции для обнаружения сигналов от западного блоттинга.Поместите нитроцеллюлозную мембрану в камеру-обскуру лицевой стороной вверх. Равномерно кодируйте раствор подложки на мембране с помощью пипетки. Наконец, выберите автоматическую процедуру экспозиции для захвата хемилюминесцентных сигналов и вручную отрегулируйте время экспозиции до тех пор, пока не будет получен идеальный сигнал.Общий белок p53, включая убиквитинированный p53, был иммунопреципитирован шариками FLAG M2 из клеток H1299 в условиях отсутствия денатурации. Элуат подвергали вестерн-блоттингу анти-р53 и антигемагглютинином или анти-р53 и моноклональными антителами. Здесь сырые клеточные экстракты или входные данные подвергались западному блоттингу анти-p53 и анти-MDM2 моноклональными антителами.Сигнал от убиквитинированного белка р53, который появляется в виде размазанной полосы от низкой до высокой молекулярной массы, был заметно увеличен, когда MDM2 был эктопически экспрессирован в этих клетках. Этот результат говорит о том, что убиквитинированный белок p53 был эффективно очищен из клеток. Затем клетки были лизированы в условиях денатурации.Общие клеточные убиквитинированные белки были опущены никелевой заряженной смолой, а затем подверглись вестерн-блоттингу анти-р53 и антигемагглютининовыми моноклональными антителами. Убиквитинированный белок р53 был обнаружен с использованием антитела против р53 и антигемагглютинина. Здесь на сырых клеточных экстрактах или входе подвергали вестерн-блоттингу анти-p53 и анти-MDM2 моноклональными антителами.Результаты показали, что общий уровень убиквитинированного белка не изменился, но уровень убиквитинированного белка p53 был резко увеличен после того, как MDM2 был чрезмерно экспрессирован в этих клетках. Это указывает на то, что общие белки убиквитина, содержащие убиквитинированный р53, эффективно извлекались из клеточных лизатов в условиях денатурации. При попытке этой процедуры не забудьте обработать клетки MG132 перед сбором клеток и ультразвуком правильно обработать клетки на льду для очистки убиквитинированных белков.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Очистка биотинилированных клеточных поверхностных белков от<em&gt; Ripicephalus microplus</em&gt; Эпителиальные кишечные клетки

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Очистка гепатоцитов и синусоидальных эндотелиальных клеток от мыши печени перфузии

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Экспресс-оценка качества мембранного белка методом флуоресцентной эксклюзионной хроматографии

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Извлечение модифицированных микротрубочек из клеток млекопитающих для изучения микротрубочек-белковых комплексов методом криоэлектронной микроскопии

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...