Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81972624) a D.L.

NOTA: Las células H1299 fueron amablemente proporcionadas por el Banco de Células Madre de la Academia China de Ciencias y se demostró que eran negativas para la contaminación por micoplasma.
1. Cultivo celular
<ol><li>Para el cultivo inicial, colocar 1 x 106 células de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano, H1299 en una placa de Petri de 10 cm con 10-12 ml de RPMI 1640 medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de aditivo de g...

<ol>
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(Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

La ubiquitinación juega un papel crítico en casi todos los procesos celulares fisiológicos y patológicos2. En los últimos años, se ha avanzado mucho en la comprensión del papel molecular de la ubiquitina en las vías de señalización y cómo los cambios en el sistema de ubiquitina conducen a diferentes enfermedades humanas2. La purificación de proteínas ubiquitinadas contribuye a proporcionar información sobre los roles exactos de ubiquitinación en estos proceso...

La ubiquitina es una proteína evolutivamente conservada de 76 aminoácidos 1,2,3. La ubiquitina se une covalentemente a los residuos de lisina en las proteínas diana a través de cascadas que involucran enzimas activadoras (E1), conjugadas (E2) y ligasas (E3). La ubiquitina es activada primero por la enzima E1 y luego se transfiere a las enzimas conjugadoras E2. Posteriormente, las ligasas de ubiquitina E3 interactúan tanto con las enzimas E2 cargadas de ubiquitina como con las proteínas de sustrato y median la formación de un enlace isopeptídico entre el C-terminal de ubiquitina y un residuo de lisina en el sustrato 1,2,3,4,5. La ubiquitinación implica la unión de restos de ubiquitina a residuos de lisina en proteínas de sustrato o a sí misma, lo que lleva a la monoubiquitinación de proteínas o poliubiquitinación. Este proceso de ubiquitinación ocurre intracelularmente en eucariotas y regula una gran variedad de procesos biológicos. La ubiquitinación resulta en la degradación de proteínas sustrato a través del sistema ubiquitina-proteasoma 1,2,3,4,5. Además, la ubiquitinación modula la localización subcelular de proteínas, la formación de complejos proteicos y el tráfico de proteínas en las células 3,5. Las fracciones de ubiquitina ligadas a proteínas sustrato pueden ser eliminadas por enzimas desubiquitinantes (DUB)6,7. En particular, las diferentes formas en que se ensamblan las cadenas de ubiquitina proporcionan una miríada de medios para regular diversos procesos biológicos 1,5. Los roles exactos de la ubiquitinación en la regulación de la función de la proteína sustrato siguen sin entenderse completamente hasta ahora. La purificación de proteínas ubiquitinadas contribuye a la elucidación de los efectos de la ubiquitinación de proteínas en una variedad de procesos celulares.
La proteína p53 es una de las proteínas supresoras de tumores más importantes y exhibe mutaciones genéticas o inactivación en casi todos los cánceres humanos 8,9,10,11. La estabilidad y la actividad de p53 están delicadamente reguladas in vivo mediante modificaciones postraduccionales, incluyendo ubiquitinación, fosforilación, acetilación y metilación12,13. La proteína p53 tiene una vida media corta que varía de 6 min a 40 min en varias células, lo que resulta principalmente de su poliubiquitinación y posterior degradación proteasómica10,12. El ratón doble minuto 2 (Mdm2) es una ubiquitina ligasa E3 de p53 que se une al N-terminal de p53 para inhibir su actividad transcripcional12,14,15. Mdm2 promueve la poliubiquitinación y degradación proteasómica de p53 para controlar su estabilidad e induce la monoubiquitinación de p53 para facilitar su exportación nuclear12,14,15,16. Aquí, la ubiquitinación de p53 mediada por Mdm2 se utiliza como ejemplo para introducir un método para la purificación de proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos en detalle. Los reguladores que influyen en el estado de ubiquitinación de las proteínas diana se pueden identificar utilizando este ensayo de ubiquitinación in vivo cuando se sobreexpresan o se derriban / eliminan en células de mamíferos. Además, las proteínas ubiquitinadas se pueden utilizar como sustratos para el ensayo de desubiquitinación in vitro. Se puede realizar un cribado de alto rendimiento para identificar DUB específicos para proteínas diana mediante la incubación de sustratos ubiquitinados con DUB individuales. Las proteínas ubiquitinadas pueden actuar como un andamio para reclutar proteínas de señalización aguas abajo en las células. Un complejo de proteína diana ubiquitinado puede purificarse mediante inmunoprecipitación secuencial en condiciones de purificación nativas e identificarse mediante espectrometría de masas. El protocolo actual se puede utilizar ampliamente para investigar las proteínas celulares reguladas por ubiquitinación.
Se han establecido varios métodos para purificar proteínas ubiquitinadas, que incluyen el uso de ubiquitina marcada por afinidad, anticuerpos de ubiquitina, proteínas de unión a ubiquitina y dominios aislados de unión a ubiquitina (UBD)17. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza ubiquitina marcada con afinidad como mediador para purificar proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos. El uso de ubiquitina poli-marcada con His ofrece ventajas sobre los otros métodos. Las proteínas ubiquitinadas se purifican en presencia de desnaturalizantes fuertes, lo que reduce la unión no específica a la resina cargada de níquel mediante la linealización de proteínas celulares y la interrupción de las interacciones proteína-proteína. Por el contrario, el uso de anticuerpos contra la ubiquitina, proteínas de unión a ubiquitina y UBD aisladas como mediadores no puede excluir eficazmente a los socios de unión de la proteína diana porque la purificación debe realizarse en condiciones menos estrictas. Además, la purificación también puede conducir a una mayor unión de proteínas no relacionadas utilizando estos mediadores. Además, existe una propensión a la unión a varios tipos de enlaces de ubiquitina, así como a la mono y poliubiquitinación por proteínas de unión a ubiquitina o UBD aisladas17. El uso de ubiquitina poli-marcada con His contribuye a derribar todas las proteínas ubiquitinizadas celulares. Alternativamente, el uso de agarosa conjugada con anticuerpos anti-Flag o anti-HA disponibles comercialmente facilita la inmunoprecipitación de proteínas diana marcadas con Flag o HA a gran escala en condiciones no desnaturalizantes. Un segundo paso de purificación, por ejemplo, mediante resina cargada de níquel dirigida a ubiquitina poli-marcada con His, se puede utilizar para adquirir proteínas diana ubiquitinadas con una alta pureza para experimentos posteriores. En particular, una estrategia de purificación de marcado de epítopos se puede adaptar cuando no se puede adquirir un anticuerpo específico para inmunoprecipitar proteínas diana de manera efectiva. Finalmente, la purificación de proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos, en comparación con la purificación in vitro, conserva el modo de enlace de ubiquitina de las proteínas diana en condiciones más fisiológicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

La ubiquitinación es un tipo de modificación postraduccional que regula no solo la estabilidad sino también la localización y función de una proteína sustrato. El proceso de ubiquitinación ocurre intracelularmente en eucariotas y regula casi todos los procesos biológicos celulares básicos. La purificación de proteínas ubiquitinadas ayuda a la investigación del papel de la ubiquitinación en el control de la función de las proteínas de sustrato. Aquí, se describe un procedimiento paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos con la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes. La proteína p53 marcada con Flag celular total se purificó con agarosa conjugada con anticuerpos anti-Flag en condiciones no desnaturalizantes. Alternativamente, la proteína ubiquitinada marcada con His celular total se purificó utilizando resina cargada de níquel en condiciones de desnaturalización. Las proteínas p53 ubiquitinadas en los eluidos se detectaron con éxito con anticuerpos específicos. Usando este procedimiento, las formas ubiquitinadas de una proteína dada pueden purificarse eficientemente a partir de células de mamíferos, facilitando estudios sobre el papel de la ubiquitinación en la regulación de la función de las proteínas.

El diagrama esquemático muestra las proteínas p53 (Flag-p53) y ubiquitina doble marcada con His/HA (HH-Ub) (Figura 1A). Los procedimientos utilizados para purificar las proteínas ubiquitinadas se resumen en la Figura 1B. La ubiquitina marcada con Poly-His se puede ligar a proteínas diana en células de mamíferos. Las proteínas ubiquitinadas pueden purificarse con perlas Flag/M2 en condiciones no desnaturalizantes o mediante cromatografía de afinidad ióni...

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Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

El protocolo describe un método paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos utilizando la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron de células bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes.

Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Usando este protocolo, las formas ubiquitinadas de una proteína dada pueden purificarse eficientemente a partir de células de mamíferos, facilitando estudios sobre el papel de la ubiquitinación en la regulación de la función de las proteínas. La purificación de proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos en comparación con la purificación in vitro mantiene el modo de enlace de ubiquitina de las proteínas diana en condiciones más radiológicas. Comience agregando 1.5 mililitros de medio sérico reducido en tres tubos de centrífuga de 15 mililitros.Agregue ADN plásmido listo para la transfección a cada tubo y agregue 0.2 microgramos de plásmido de proteína fluorescente verde para monitorear la eficiencia de la transfección. Agregue 78 microlitros de reactivo de transfección de liposomas a 4,5 mililitros de medio sérico reducido en otro tubo de centrífuga para diluir los liposomas. Mezcle bien moviendo el tubo y luego déjelo reposar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Agregue 1,5 mililitros de la solución liposomal diluida en cada tubo que contenga 1,5 mililitros de la solución de ADN diluida. Mezcle bien y entregue los plásmidos con los liposomas durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. Deseche el medio original de las placas de Petri y agregue nueve mililitros del medio sérico reducido en cada plato.Agregue tres mililitros de la mezcla de ADN liposomático y mezcle la solución agitando suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás tres veces y luego hacia la izquierda y hacia la derecha tres veces para una distribución uniforme de la mezcla en la placa. Cultive las células en la incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Reemplace el medio después de cuatro a seis horas y continúe cultivando las células durante 24 a 36 horas.Después de 24 a 36 horas, tratar las células con MG132 a una concentración final de 10 micromolares durante cuatro a seis horas. Deseche el medio y lave las celdas dos veces con PBS helado. Agregue un mililitro de PBS al plato.Retire las células raspándolas con un raspador limpio y transfiera la suspensión celular a tubos de microcentrífuga. Centrifugar a 700 G durante cinco minutos para recoger los gránulos celulares. Agregue 800 microlitros del tampón de lisis FLAG helado complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa a las células de cada tubo.Mezcle las células con un oscilador de vórtice o una pistola de pipetas y luego incube la mezcla en un rotador a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Ultrasonicar la mezcla en el hielo con cada pulso que dura un segundo, y someter la mezcla a cinco a 10 pulsos breves. Incubar la mezcla en un rotador a 40 RPM durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.Luego centrifugar las muestras ultrasónicas a 8, 000 G durante 20 a 30 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Alícuota 80 microlitros del extracto celular y mezclar con 20 microlitros de tampón de carga 5X SDS.Hervir las muestras a 98 grados centígrados durante cinco minutos. Enfríe en hielo durante dos minutos y guárdelo a menos 20 grados centígrados hasta que lo use. Utilice estas muestras como grupo de entrada para controlar la expresión de proteínas.A continuación, agregue 30 microlitros de las perlas conjugadas de anticuerpos anti-FLAG M2 a los extractos celulares restantes e incube en un rotador a cuatro grados centígrados durante al menos cuatro horas o durante la noche. Centrifugar a 1.500 G durante dos minutos a cuatro grados centígrados para recoger las cuentas. Agregue un mililitro del tampón de lisis FLAG helado a las perlas y mezcle invirtiendo el tubo varias veces.Repita este paso de cuatro a seis veces, luego agregue 40 microlitros de los péptidos FLAG a una concentración final de 200 nanogramos por microlitro a las perlas. Incubar en un rotador durante dos horas como se mostró anteriormente y luego centrifugar a la misma temperatura. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 10 microlitros de tampón de carga 5X SDS.Hervir la mezcla a 98 grados centígrados durante cinco minutos y luego enfriarla en hielo durante dos minutos. Agregue un mililitro de PBS helado a los gránulos de celda y mezcle uniformemente. Alícuota 100 microlitros de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga como muestra de entrada y centrifugar a 700 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para recoger los gránulos celulares.Agregue 80 microlitros de tampón de lisis FLAG a la muestra de entrada y mezcle las células con un oscilador de vórtice como se mostró anteriormente. Lise las células en hielo durante una hora y luego centrifugar nuevamente durante 20 a 30 minutos. Después de la centrifusión, alícuota 80 microlitros del sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 20 microlitros de tampón de carga 5X SDS al sobrenadante.Hervir la mezcla a 98 grados centígrados durante cinco a 10 minutos y luego enfriar en hielo durante dos minutos. Centrifugar los 900 microlitros restantes de la suspensión celular a 700 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para recoger el pellet celular. Agregue un mililitro de tampón de ubiquitina 1 a los gránulos celulares y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para distribuir las células de manera uniforme.Someter los lisados celulares a 10 a 20 rondas de ultrasonido en hielo hasta que la solución ya no sea viscosa, y luego centrifugar la solución. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 30 microlitros de resina cargada de níquel al sobrenadante. Incubar en un rotador a 15 RPM durante cuatro horas o durante la noche a temperatura ambiente y luego centrifugar durante dos minutos.Después de la centrifusión, recoja las perlas y agréguele un mililitro de tampón de ubiquitina 1. Incubar con rotación en una coctelera durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego centrifugar de nuevo a 1.500 G durante dos minutos, como se mostró anteriormente. Agregue un mililitro de tampón de ubiquitina 2 a las perlas y realice la incubación seguida de centrifugación, como se mostró anteriormente, para recolectar las perlas.Repita este paso una vez. A continuación, agregue un mililitro de PBS a las perlas y siga el mismo procedimiento de incubación y centrifugación para recoger las perlas. Repita este paso una vez más.Eluyó las proteínas unidas incubando las perlas con 40 microlitros de imidazol a una concentración final de 0,5 molares durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, centrifugar nuevamente a 1, 500 G durante dos minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio y agregue 10 microlitros de tampón de carga 5X SDS.Hervir la solución a 98 grados centígrados durante cinco minutos y luego enfriarla en hielo durante dos minutos. Resuelva las muestras por SDS-PAGE y luego transfiéralas a una membrana de nitrocelulosa mediante Western blot para detectar proteínas diana utilizando los anticuerpos correspondientes. Inicie el sistema de imágenes de quimioluminiscencia para detectar señales de Western blotting.Coloque la membrana de nitrocelulosa en la cámara oscura boca arriba. Codifique la solución de sustrato uniformemente en la membrana con una pipeta. Finalmente, seleccione el procedimiento de exposición automática para capturar las señales quimioluminiscentes y ajuste manualmente el tiempo de exposición hasta que se adquiera una señal ideal.La proteína p53 total, incluida la p53 ubiquitinada, se inmunoprecipitó con perlas FLAG M2 de células H1299 en condiciones no desnaturalizantes. El eluido fue sometido a western blot con anti p53 y anti hemaglutinina o con anticuerpos anti p53 y monoclonales. Aquí, los extractos de células crudas o la entrada se sometieron a Western blot con anticuerpos monoclonales anti p53 y anti MDM2.La señal de la proteína p53 ubiquitinada que aparece como una banda manchada de bajo a alto peso molecular aumentó notablemente cuando MDM2 se expresó ectópicamente en estas células. Este resultado sugiere que la proteína p53 ubiquitinada ha sido efectivamente purificada de las células. A continuación, las células se lisaron en condiciones de desnaturalización.Las proteínas ubiquitinadas celulares totales se retiraron con resina cargada de níquel y luego se sometieron a Western blot con anticuerpos monoclonales anti p53 y antihemaglutinina. La proteína p53 ubiquitinada se detectó utilizando un anticuerpo anti p53 y un anticuerpo anti hemaglutinina. Aquí en las células crudas los extractos o insumos fueron sometidos a western blot con anticuerpos monoclonales anti p53 y anti MDM2.Los resultados mostraron que el nivel total de proteína ubiquitinada se mantuvo sin cambios, pero el nivel de proteína ubiquitinada p53 aumentó dramáticamente después de que MDM2 se sobreexpresó en estas células. Esto indica que las proteínas ubiquitinas totales que contienen p53 ubiquitinado fueron efectivamente retiradas de los lisados celulares en condiciones de desnaturalización. Al intentar este procedimiento, recuerde tratar las células con MG132 antes de la recolección celular y ultrasonicar las células adecuadamente en hielo para la purificación de proteínas ubiquitinadas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Investigación

Bioquímica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células epiteliales intestinales

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

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Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Evaluación rápida de la calidad de la proteína de membrana mediante cromatografía de exclusión de tamaño fluorescente

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extracción de microtúbulos modificados de células de mamíferos para estudiar complejos microtúbulos-proteínas mediante microscopía crioelectrónica

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...