Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (81972624) till D.L.

OBS: H1299-celler tillhandahölls vänligen av stamcellsbanken, Chinese Academy of Sciences och visade sig vara negativa för mykoplasmakontaminering.
1. Cellodling
<ol><li>För den ursprungliga odlingen, placera 1 x 106 celler av human lungadenokarcinomcellinje, H1299 i en 10 cm petriskål med 10-12 ml RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% glutaminadditiv, 1% natriumpyruvat och antibiotika (100 U / ml penicillin och 100 μg / ml stre...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions.">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li><li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling.">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li><li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

Ubiquitination spelar en kritisk roll i nästan alla fysiologiska och patologiska cellulära processer2. Under de senaste åren har stora framsteg gjorts för att förstå ubiquitins molekylära roll i signalvägar och hur förändringar i ubiquitinsystemet leder till olika mänskliga sjukdomar2. Rening av ubiquitinerade proteiner bidrar till att ge insikt i de exakta rollerna för ubiquitination i dessa processer. Blandningarna av ubiquitinkonjugerade proteiner kan renas f...

Ubiquitin är ett evolutionärt konserverat protein av 76 aminosyror 1,2,3. Ubiquitin binder kovalent lysinrester på målproteiner genom kaskader som involverar aktiverande (E1), konjugerande (E2) och ligas (E3) enzymer. Ubiquitin aktiveras först av E1-enzymet och överförs sedan till de E2-konjugerande enzymerna. Därefter interagerar E3 ubiquitinligaser med både ubiquitinbelastade E2-enzymer och substratproteiner och förmedlar bildandet av en isopeptidbindning mellan C-terminalen av ubiquitin och en lysinrest i substratet 1,2,3,4,5. Ubiquitination involverar bindning av ubiquitindelar till lysinrester på substratproteiner eller till sig själv, vilket leder till proteinmonoubiquitination eller polyubiquitination. Denna ubiquitinationsprocess sker intracellulärt i eukaryoter och reglerar en mängd olika biologiska processer. Ubiquitination resulterar i nedbrytning av substratproteiner via ubiquitin-proteasomsystemet 1,2,3,4,5. Dessutom modulerar ubiquitination protein subcellulär lokalisering, proteinkomplexbildning och proteinhandel i celler 3,5. Ubiquitindelar som ligerats till substratproteiner kan avlägsnas med deubiquitinerande enzymer (DUB)6,7. I synnerhet ger de olika sätten på vilka ubiquitinkedjor monteras en myriad av medel för att reglera olika biologiska processer 1,5. De exakta rollerna för ubiquitination för att reglera substratproteinfunktionen förblir ofullständigt förstådda hittills. Rening av ubiquitinerade proteiner bidrar till att belysa effekterna av proteinubiquitination på en mängd olika cellulära processer.
P53-proteinet är ett av de viktigaste tumörsuppressorproteinerna och uppvisar genetiska mutationer eller inaktivering i nästan alla mänskliga cancerformer 8,9,10,11. p53 stabilitet och aktivitet regleras delikat in vivo genom posttranslationella modifieringar, inklusive ubiquitination, fosforylering, acetylering och metylering12,13. P53-proteinet har en kort halveringstid som sträcker sig från 6 min till 40 min i olika celler, vilket huvudsakligen beror på dess polyubiquitination och efterföljande proteasomala nedbrytning10,12. Mus dubbelminut 2 (Mdm2) är en E3 ubiquitinligas av p53 som binder till N-änden av p53 för att hämma dess transkriptionella aktivitet12,14,15. Mdm2 främjar polyubiquitination och proteasomal nedbrytning av p53 för att kontrollera dess stabilitet och inducerar monoubiquitination av p53 för att underlätta dess kärnexport12,14,15,16. Här används Mdm2-medierad p53-ubiquitination som ett exempel för att introducera en metod för rening av ubiquitinerade proteiner från däggdjursceller i detalj. De regulatorer som påverkar målproteinernas ubiquitinationsstatus kan identifieras med hjälp av denna in vivo ubiquitinationsanalys när de överuttrycks eller slås ner/slås ut i däggdjursceller. Dessutom kan ubiquitinerade proteiner användas som substrat för in vitro-deubiquitinationsanalys. En screening med hög genomströmning kan utföras för att identifiera specifika DUB för målproteiner genom att inkubera ubiquitinerade substrat med enskilda DUB. Ubiquitinerade proteiner kan fungera som en byggnadsställning för att rekrytera nedströms signaleringsproteiner i celler. Ett ubiquitinerat målproteinkomplex kan renas genom sekventiell immunoprecipitation under inhemska reningsförhållanden och identifieras med masspektrometri. Det nuvarande protokollet kan användas i stor utsträckning för att undersöka de cellulära proteiner som regleras av ubiquitination.
Flera metoder har etablerats för att rena ubiquitinerade proteiner, som inkluderar användning av affinitetsmärkt ubiquitin, ubiquitinantikroppar, ubiquitinbindande proteiner och isolerade ubiquitinbindande domäner (UBD)17. Här tillhandahåller vi ett protokoll som använder affinitetsmärkt ubiquitin som medlare för att rena ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller. Användningen av poly-His-taggad ubiquitin erbjuder fördelar jämfört med de andra metoderna. Ubiquitinerade proteiner renas i närvaro av starka denatureringsmedel, vilket minskar icke-specifik bindning till nickelladdat harts genom att linjärisera cellulära proteiner och störa protein-proteininteraktioner. Däremot kan användningen av ubiquitinantikroppar, ubiquitinbindande proteiner och isolerade UBD som mediatorer effektivt utesluta bindande partners från målprotein eftersom rening måste utföras under mindre stränga förhållanden. Dessutom kan rening också leda till ökad bindning av orelaterade proteiner med hjälp av dessa mediatorer. Dessutom finns det en bindningsbenägenhet för olika ubiquitinlänktyper samt mono- och poly-ubiquitination av ubiquitinbindande proteiner eller isolerade UBD17. Användningen av poly-His-taggad ubiquitin bidrar till att dra ner alla cellulära ubiquitinerade proteiner. Alternativt gör användningen av kommersiellt tillgänglig anti-flagga eller anti-HA-antikroppskonjugerad agaros det lättare att immunoprecipitera storskaliga flagg- eller HA-märkta målproteiner under icke-denaturerande förhållanden. Ett andra reningssteg, till exempel av nickelladdat harts riktat mot poly-His-märkt ubiquitin, kan användas för att förvärva allestädes närvarande målproteiner med hög renhet för nedströmsexperiment. I synnerhet kan en epitopmärkningsreningsstrategi anpassas när en specifik antikropp inte kan förvärvas för att immunoprecipitera målproteiner effektivt. Slutligen behåller rening av ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller, i jämförelse med rening in vitro, ubiquitinbindningsläget för målproteiner under mer fysiologiska förhållanden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

Ubiquitination är en typ av posttranslationell modifiering som reglerar inte bara stabiliteten utan också lokaliseringen och funktionen hos ett substratprotein. Ubiquitinationsprocessen sker intracellulärt i eukaryoter och reglerar nästan alla grundläggande cellulära biologiska processer. Rening av ubiquitinerade proteiner hjälper till att undersöka ubiquitinationens roll för att kontrollera funktionen hos substratproteiner. Här beskrivs ett steg-för-steg-förfarande för att rena ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller med p53-tumörsuppressorproteinet som ett exempel. Ubiquitinerade p53-proteiner renades under stränga icke-denaturerings- och denatureringsförhållanden. Totalt cellulärt flaggmärkt p53-protein renades med anti-flaggantikroppskonjugerad agaros under icke-denaturerande förhållanden. Alternativt renades totalt cellulärt His-märkt ubiquitinerat protein med användning av nickelladdat harts under denatureringsförhållanden. Ubiquitinerade p53-proteiner i eluaterna detekterades framgångsrikt med specifika antikroppar. Med hjälp av denna procedur kan de allestädes närvarande formerna av ett givet protein effektivt renas från däggdjursceller, vilket underlättar studier av ubiquitinationens roller vid reglering av proteinfunktionen.

Det schematiska diagrammet visar flaggmärkta p53 (Flag-p53) och His/HA dubbelmärkta ubiquitinproteiner (HH-Ub) (figur 1A). De procedurer som används för att rena ubiquitinerade proteiner sammanfattas i figur 1B. Poly-His-taggat ubiquitin kan ligeras till målproteiner i däggdjursceller. Ubiquitinerade proteiner kan renas med flagg/M2-pärlor under icke-denaturerande förhållanden eller genom immobiliserad metalljonaffinitetskromatografi (IMAC) under denatu...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Protokollet beskriver en steg-för-steg-metod för att rena ubiquitinerade proteiner från däggdjursceller med hjälp av p53-tumörsuppressorproteinet som exempel. Ubiquitinerade p53-proteiner renades från celler under stränga icke-denaturerings- och denatureringsförhållanden.

Rening av Ubiquitinated p53-proteiner från däggdjursceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Med hjälp av detta protokoll kan de ubiquitinerade formerna av ett givet protein effektivt renas från däggdjursceller, vilket underlättar studier om ubiquitinationens roller för att reglera proteinfunktionen. Rening av ubiquitinerade proteiner i däggdjursceller i jämförelse med rening in vitro behåller ubiquitinlänkningsläget för målproteiner under mer radiologiskt tillstånd. Börja med att tillsätta 1,5 ml reducerat serummedium i tre 15 ml centrifugrör.Tillsätt plasmid-DNA redo för transfektion till varje rör och tillsätt 0,2 mikrogram grön fluorescerande proteinplasmid för att övervaka transfektionseffektiviteten. Tillsätt 78 mikroliter liposomtransfektionsreagens till 4,5 ml reducerat serummedium i ett annat centrifugrör för att späda liposomerna. Blanda noggrant genom att snärta röret och låt det sedan stå i fem minuter vid rumstemperatur.Tillsätt 1,5 ml av den utspädda liposomlösningen i varje rör innehållande 1,5 ml av den utspädda DNA-lösningen. Blanda noggrant och tvärlänka plasmiderna med liposomerna i minst 20 minuter vid rumstemperatur. Kassera det ursprungliga mediet från petriskålarna och tillsätt nio milliliter av det reducerade serummediet i varje skål.Tillsätt tre milliliter av liposom-DNA-blandningen och blanda lösningen genom att försiktigt skaka plattan fram och tillbaka tre gånger och sedan åt vänster och höger tre gånger för jämn fördelning av blandningen på plattan. Odla cellerna i den fuktade inkubatorn vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Byt ut mediet efter fyra till sex timmar och fortsätt att odla cellerna i 24 till 36 timmar.Efter 24 till 36 timmar, behandla cellerna med MG132 i en slutlig koncentration av 10 mikromolar i fyra till sex timmar. Kassera mediet och tvätta cellerna två gånger med iskall PBS. Tillsätt en milliliter PBS i skålen.Ta bort cellerna genom att skrapa dem med en ren skrapa och överför cellsuspensionen till mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 700 G i fem minuter för att samla cellpellets. Tillsätt 800 mikroliter av den iskalla FLAG-lysbufferten kompletterad med proteashämmare cocktail till cellerna i varje rör.Blanda cellerna med en virveloscillator eller en pipettpistol och inkubera sedan blandningen på en rotator vid fyra grader Celsius i 30 minuter. Ultraljud blandningen på isen med varje puls varar en sekund och utsätta blandningen för fem till 10 korta pulser. Inkubera blandningen på en rotator vid 40 rpm i 30 minuter vid fyra grader Celsius.Centrifugera sedan ultraljudsproverna vid 8 000 G i 20 till 30 minuter vid fyra grader Celsius. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör. Alikvotera 80 mikroliter av cellextraktet och blanda med 20 mikroliter 5X SDS-laddningsbuffert.Koka proverna vid 98 grader Celsius i fem minuter. Kyl på is i två minuter och förvara vid minus 20 grader Celsius tills den används. Använd dessa prover som indatagrupp för att övervaka proteinuttryck.Tillsätt sedan 30 mikroliter anti-FLAG M2-antikroppskonjugerade pärlor till de återstående cellextrakten och inkubera på en rotator vid fyra grader Celsius i minst fyra timmar eller över natten. Centrifugera vid 1 500 G i två minuter vid fyra grader Celsius för att samla pärlorna. Tillsätt en milliliter av den iskalla FLAG-lysbufferten till pärlorna och blanda genom att invertera röret flera gånger.Upprepa detta steg fyra till sex gånger och tillsätt sedan 40 mikroliter FLAG-peptiderna i en slutlig koncentration av 200 nanogram per mikroliter till pärlorna. Inkubera på en rotator i två timmar som visats tidigare och centrifugera sedan vid samma temperatur. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör och tillsätt 10 mikroliter 5X SDS-laddningsbuffert.Koka blandningen vid 98 grader Celsius i fem minuter och kyl den sedan på is i två minuter. Tillsätt en milliliter av den iskalla PBS till cellpelletsen och blanda jämnt. Alikvotera 100 mikroliter av cellsuspensionen i ett mikrocentrifugrör som ingångsprov och centrifugera vid 700 G i fem minuter vid fyra grader Celsius för att samla cellpelletsen.Tillsätt 80 mikroliter FLAG-lysbuffert till ingångsprovet och blanda cellerna med en virveloscillator som visats tidigare. Lysera cellerna på is i en timme och centrifugera sedan igen i 20 till 30 minuter. Efter centrifusion alikvoterar 80 mikroliter av supernatanten i ett nytt mikrocentrifugrör och tillsätter 20 mikroliter 5X SDS-laddningsbuffert till supernatanten.Koka blandningen vid 98 grader Celsius i fem till 10 minuter och svalna sedan på is i två minuter. Centrifugera de återstående 900 mikroliter av cellsuspensionen vid 700 G i fem minuter vid fyra grader Celsius för att samla cellpelleten. Tillsätt en milliliter ubiquitinbuffert 1 till cellpelletsen och blanda genom att pipettera upp och ner flera gånger för att fördela cellerna jämnt.Utsätt cellen lysater till 10 till 20 rundor ultraljud på is tills lösningen inte längre är viskös, och sedan centrifugera lösningen. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör och tillsätt 30 mikroliter nickelladdat harts till supernatanten. Inkubera på en rotator vid 15 rpm i fyra timmar eller över natten vid rumstemperatur och centrifugera sedan i två minuter.Efter centrifusion, samla pärlorna och tillsätt en milliliter ubiquitinbuffert 1 till den. Inkubera med rotation i en shaker i 10 minuter vid rumstemperatur och centrifugera sedan igen vid 1 500 G i två minuter, som tidigare visats. Tillsätt en milliliter ubiquitinbuffert 2 till pärlorna och utför inkubation följt av centrifugering, som tidigare visats, för att samla pärlorna.Upprepa detta steg en gång. Tillsätt sedan en milliliter PBS till pärlorna och följ samma procedur för inkubation och centrifugering för att samla pärlorna. Upprepa detta steg igen.Elutbundna proteiner genom att inkubera pärlorna med 40 mikroliter imidazol vid en slutlig koncentration av 0,5 molar i en timme vid rumstemperatur. Efter inkubation, centrifugera igen vid 1 500 G i två minuter. Överför supernatanten till ett rent mikrocentrifugrör och tillsätt 10 mikroliter 5X SDS-laddningsbuffert.Koka lösningen vid 98 grader Celsius i fem minuter och kyl den sedan på is i två minuter. Lös proverna med SDS-PAGE och överför dem sedan till ett nitrocellulosamembran genom western blotting för att detektera målproteiner med motsvarande antikroppar. Starta kemiluminescensavbildningssystemet för att upptäcka signaler från western blotting.Placera nitrocellulosamembranet i kamerans obscura med framsidan uppåt. Koda substratlösningen jämnt på membranet med hjälp av en pipettpistol. Välj slutligen den automatiska exponeringsproceduren för att fånga de kemiluminescerande signalerna och justera exponeringstiden manuellt tills en idealisk signal förvärvas.Totalt p53-protein, inklusive ubiquitinerat p53, immunutfälldes med FLAG M2-pärlor från H1299-celler under icke-denatureringsbetingelser. Eluatet utsattes för western blotting med anti p53 och anti hemagglutinin eller med anti p53 och monoklonala antikroppar. Här utsattes råcellsextrakten eller ingångarna för western blotting med anti p53 och anti MDM2 monoklonala antikroppar.Signalen från ubiquitinerat p53-protein som framträder som ett utsmetat band från låg till hög molekylvikt ökade markant när MDM2 ektopiskt uttrycktes i dessa celler. Detta resultat tyder på att det ubiquitinerade p53-proteinet effektivt har renats från celler. Därefter lyserades cellerna under denatureringsförhållanden.De totala cellulära ubiquitinerade proteinerna drogs ner med nickelladdat harts och utsattes sedan för western blotting med anti p53 och anti hemagglutinin monoklonala antikroppar. Ubiquitinerat p53-protein detekterades med användning av en anti p53-antikropp och en anti-hemagglutininantikropp. Här vid råcellsextrakten eller ingången utsattes för western blotting med anti p53 och anti MDM2 monoklonala antikroppar.Resultaten visade att den totala ubiquitinerade proteinnivån var oförändrad men den ubiquitinerade p53-proteinnivån ökade dramatiskt efter att MDM2 överuttrycktes i dessa celler. Detta indikerar att de totala ubiquitinproteinerna innehållande ubiquitinerad p53 effektivt drogs ner från celllysater under denatureringsförhållanden. När du försöker denna procedur, kom ihåg att behandla cellerna med MG132 före celluppsamling och ultraljud cellerna ordentligt på is för rening av allestädes närvarande proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinitetsrening av proteinkomplex från eukaryota celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rening av biotinylerade cellytaproteiner från<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rening av hepatocyter och sinusformad Endothelial celler från mus lever Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttryck och rening av däggdjur Bestrophin jonkanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Översätta ribosom affinitetsrening (fälla) för RNA-isolering från endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Snabb bedömning av membranproteinkvalitet genom fluorescerande storleksuteslutningskromatografi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extrahera modifierade mikrotubuli från däggdjursceller för att studera mikrotubuli-proteinkomplex med kryoelektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...