Name: purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (81972624) D.L.'ye verilen bir hibe ile desteklenmiştir.

NOT: H1299 hücreleri, Çin Bilimler Akademisi Kök Hücre Bankası tarafından nazikçe sağlanmıştır ve mikoplazma kontaminasyonu için negatif olduğu kanıtlanmıştır.
1. Hücre kültürü
<ol><li>İlk kültür için, insan akciğer adenokarsinom hücre hattının 1 x 106 hücresini, H1299'u% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 10 glutamin katkı maddesi,% 1 sodyum piruvat ve antibiyotikler (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin) ile desteklenmi?...

<ol>
	<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy.">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment.">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li><li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+ligases:+Structure,+function,+and+regulation.">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li><li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions.">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li><li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling.">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li><li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+chains:+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function.">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li><li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery:+emerging+opportunities.">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+the+p53+network.">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li><li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+and+Tumor+suppression:+It+takes+a+network.">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li><li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53:+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery.">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+light:+The+growing+complexity+of+p53.">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li><li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+ubiquitination:+Mdm2+and+beyond.">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li><li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+modifications:+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian.">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li><li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2:+Open+questions.">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li><li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome.">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono-+versus+polyubiquitination:+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2.">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li><li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins.">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li><li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).</li></ol>

Ubikitinasyon hemen hemen tüm fizyolojik ve patolojik hücresel süreçlerde kritik bir rol oynar2. Son yıllarda, ubikitinin sinyal yolaklarındaki moleküler rolünü ve ubikitin sistemindeki değişikliklerin farklı insan hastalıklarına nasıl yol açtığını anlamada büyük ilerleme kaydedilmiştir2. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, bu süreçlerde ubikitinasyonun kesin rolleri hakkında fikir vermeye katkıda bulunur. Ubikitin konjuge proteinler...

Ubikitin, 76 amino asit 1,2,3'ün evrimsel olarak korunmuş bir proteinidir. Ubikitin, hedef proteinler üzerindeki lizin kalıntılarını, aktive edici (E1), konjuge edici (E2) ve ligaz (E3) enzimlerini içeren kaskadlar yoluyla kovalent olarak bağlar. Ubikitin ilk önce E1 enzimi tarafından aktive edilir ve daha sonra E2 konjuge edici enzimlere aktarılır. Daha sonra, E3 ubikitin ligazları hem ubikitin yüklü E2 enzimleri hem de substrat proteinleri ile etkileşime girer ve ubikitinin C-terminali ile substrat 1,2,3,4,5'teki bir lizin kalıntısı arasında bir izopeptit bağının oluşumuna aracılık eder. Ubikitinasyon, ubikitin moieties substrat proteinleri üzerindeki lizin kalıntılarına veya kendisine bağlanmasını içerir ve bu da protein monoubikitinasyonuna veya poliubikitinasyona yol açar. Bu ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve çok çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinasyon, substrat proteinlerinin ubikitin-proteazom sistemi 1,2,3,4,5 yoluyla parçalanmasıyla sonuçlanır. Ek olarak, ubikitinasyon protein hücre altı lokalizasyonunu, protein kompleks oluşumunu ve hücrelerdeki protein kaçakçılığını modüle eder 3,5. Substrat proteinlerine bağlı ubikitin moieties deubikitinating enzimler (DUB'ler) tarafından uzaklaştırılabilir6,7. Özellikle, ubikitin zincirlerinin bir araya getirildiği farklı yollar, çeşitli biyolojik süreçleri düzenlemek için sayısız araç sağlar 1,5. Substrat protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun kesin rolü şimdiye kadar tam olarak anlaşılamamıştır. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, protein ubikitinasyonunun çeşitli hücresel süreçler üzerindeki etkilerinin aydınlatılmasına katkıda bulunur.
P53 proteini en önemli tümör baskılayıcı proteinlerden biridir ve hemen hemen tüm insan kanserlerinde genetik mutasyonlar veya inaktivasyon sergiler 8,9,10,11. p53 stabilitesi ve aktivitesi, ubikitinasyon, fosforilasyon, asetilasyon ve metilasyon12,13 dahil olmak üzere posttranslasyonel modifikasyonlarla in vivo olarak hassas bir şekilde düzenlenir. P53 proteini, çeşitli hücrelerde 6 dakika ila 40 dakika arasında değişen kısa bir yarı ömre sahiptir, bu da esas olarak poliubikitinasyonu ve ardından proteazomal bozunması 10,12'den kaynaklanır. Fare çift dakika 2 (Mdm2), transkripsiyonel aktivitesini inhibe etmek için p53'ün N-terminusuna bağlanan bir E3 ubikitin ligazıdır12,14,15. Mdm2, stabilitesini kontrol etmek için p53'ün poliubikitinasyonunu ve proteazomal bozunmasını teşvik eder ve nükleer ihracatını kolaylaştırmak için p53'ün monoubikitinasyonunu indükler12,14,15,16. Burada, Mdm2 aracılı p53 ubikitinasyonu, memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması için ayrıntılı olarak bir yöntem tanıtmak için örnek olarak kullanılmıştır. Hedef proteinlerin ubikitinasyon durumunu etkileyen düzenleyiciler, memeli hücrelerinde aşırı eksprese edildiklerinde veya yıkıldıklarında / nakavt edildiklerinde bu in vivo ubikitinasyon testi kullanılarak tanımlanabilir. Ek olarak, ubikitinlenmiş proteinler in vitro deubikitinasyon testi için substrat olarak kullanılabilir. Her yerde bulunan substratları bireysel DUB'lerle inkübe ederek hedef proteinler için spesifik DUB'leri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama yapılabilir. Ubikitinlenmiş proteinler, hücrelerde aşağı akış sinyal proteinlerini işe almak için bir iskele görevi görebilir. Her yerde bulunan bir hedef protein kompleksi, doğal saflaştırma koşulları altında sıralı immünopresipitasyon ile saflaştırılabilir ve kütle spektrometrisi ile tanımlanabilir. Mevcut protokol, ubikitinasyon tarafından düzenlenen hücresel proteinleri araştırmak için yaygın olarak kullanılabilir.
Ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için, afinite etiketli ubikitin, ubikitin antikorları, ubikitin bağlayıcı proteinler ve izole ubikitin bağlayıcı alanların (UBD'ler) kullanımını içeren çeşitli yöntemler oluşturulmuştur17. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için bir aracı olarak afinite etiketli ubikitini kullanan bir protokol sunuyoruz. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı diğer yöntemlere göre avantajlar sunar. Ubikitinlenmiş proteinler, hücresel proteinleri doğrusallaştırarak ve protein-protein etkileşimlerini bozarak nikel yüklü reçineye spesifik olmayan bağlanmayı azaltan güçlü denatürantların varlığında saflaştırılır. Buna karşılık, ubikitin antikorlarının, ubikitin bağlayıcı proteinlerin ve izole UBD'lerin aracılar olarak kullanılması, bağlanma ortaklarını hedef proteinden etkili bir şekilde dışlayamaz, çünkü saflaştırmanın daha az katı koşullar altında yapılması gerekir. Dahası, saflaştırma, bu aracıları kullanarak ilgisiz proteinlerin bağlanmasının artmasına da yol açabilir. Ek olarak, çeşitli ubikitin bağlantı tiplerinin yanı sıra ubikitin bağlayıcı proteinler veya izole UBD'ler tarafından mono- ve poli-ubikitinasyon için bağlanma eğilimi vardır17. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı, tüm hücresel ubikitinlenmiş proteinlerin aşağı çekilmesine katkıda bulunur. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen anti-Flag veya anti-HA antikor konjuge agarozun kullanılması, büyük ölçekli Bayrak veya HA etiketli hedef proteinlerin denatüre olmayan koşullar altında immünopreçökeltiyi kolaylaştırır. Örneğin, poli-His-etiketli ubikitini hedefleyen nikel yüklü reçine ile ikinci bir saflaştırma adımı, aşağı akış deneyleri için yüksek saflıkta ubikitinlenmiş hedef proteinleri elde etmek için kullanılabilir. Özellikle, bir epitop etiketleme saflaştırma stratejisi, hedef proteinleri etkili bir şekilde immünopreçökite etmek için spesifik bir antikor elde edilemediğinde uyarlanabilir. Son olarak, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, in vitro saflaştırma ile karşılaştırıldığında, hedef proteinlerin ubikitin bağlantı modunu daha fizyolojik koşullar altında korur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA931</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>NA935</td>
			<td>Secondary antibdoy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220</td>
			<td>FLAG/M2 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP monocolonal antibody</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA High Affinity</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-965</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG Peptide</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>Prepare elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100287-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H1299</td>
			<td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immidazole</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500529-0100</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagents</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610476-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>201154</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501726-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30230</td>
			<td>nickel-charged resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting membrane</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607011-0100</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-100-1ACS</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>Sigma-Alddich</td>
			<td>L5777</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Loading Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501492-0005</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610103-0250</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A110694-0500</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100777-0500</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A510907-0500</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of ubiquitinated p53 proteins from mammalian cells

Ubikitinasyon, bir substrat proteininin sadece stabilitesini değil, aynı zamanda lokalizasyonunu ve işlevini de düzenleyen bir tür posttranslasyonel modifikasyondur. Ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve neredeyse tüm temel hücresel biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, substrat proteinlerinin işlevini kontrol etmede ubikitinasyonun rolünün araştırılmasına yardımcı olur. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir prosedür, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı protein ile tanımlanmıştır. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında saflaştırıldı. Total hücresel Bayrak etiketli p53 proteini, denatüre olmayan koşullar altında anti-Flag antikor konjuge agaroz ile saflaştırıldı. Alternatif olarak, toplam hücresel His etiketli ubikitinlenmiş protein, denatüre edici koşullar altında nikel yüklü reçine kullanılarak saflaştırıldı. Elatlardaki ubikitinlenmiş p53 proteinleri, spesifik antikorlarla başarılı bir şekilde tespit edildi. Bu prosedürü kullanarak, belirli bir proteinin ubikitinlenmiş formları, memeli hücrelerinden verimli bir şekilde saflaştırılabilir ve bu da protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun rolleri üzerine çalışmaları kolaylaştırır.

Şematik diyagram Bayrak etiketli p53 (Bayrak-p53) ve Onun / HA çift etiketli ubikitin (HH-Ub) proteinlerini göstermektedir (Şekil 1A). Ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için kullanılan prosedürler Şekil 1B'de özetlenmiştir. Poli-His-etiketli ubikitin, memeli hücrelerindeki hedef proteinlere bağlanabilir. Ubikitinlenmiş proteinler, denatüre olmayan koşullar altında Flag/M2 boncukları ile veya denatüre koşullar altında immobilize metal...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells at JoVE.com

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Protokol, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı proteini kullanarak memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir yöntemi açıklar. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırıldı.

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Bu protokolü kullanarak, belirli bir proteinin ubikitinlenmiş formları, memeli hücrelerinden verimli bir şekilde saflaştırılabilir ve bu da protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun rolleri üzerine çalışmaları kolaylaştırır. Memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinlerin in vitro saflaştırılmasına kıyasla saflaştırılması, hedef proteinlerin ubikitin bağlantı modunu daha radyolojik koşullar altında tutar. Üç adet 15 mililitrelik santrifüj tüpüne 1,5 mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyerek başlayın.Her tüpe transfeksiyona hazır plazmid DNA'sı ekleyin ve transfeksiyon verimliliğini izlemek için 0.2 mikrogram yeşil floresan protein plazmidi ekleyin. Lipozomları seyreltmek için başka bir santrifüj tüpünde 4.5 mililitre azaltılmış serum ortamına 78 mikrolitre lipozom transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü hafifçe vurarak iyice karıştırın ve ardından oda sıcaklığında beş dakika bekletin.Seyreltilmiş DNA çözeltisinin 1.5 mililitresini içeren her tüpe 1.5 mililitre seyreltilmiş lipozom çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve plazmidleri oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca lipozomlarla çapraz bağlayın. Orijinal ortamı Petri kaplarından atın ve her bir kaba dokuz mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyin.Üç mililitre lipozom DNA karışımı ekleyin ve karışımın plaka üzerinde eşit dağılımı için plakayı üç kez ileri geri hafifçe sallayarak ve daha sonra üç kez sola ve sağa sallayarak çözeltiyi karıştırın. Nemlendirilmiş inkübatördeki hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kültürleyin. Dört ila altı saat sonra ortamı değiştirin ve hücreleri 24 ila 36 saat boyunca kültürlemeye devam edin.24 ila 36 saat sonra, hücreleri MG132 ile dört ila altı saat boyunca 10 mikromolar nihai konsantrasyonda tedavi edin. Ortamı atın ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Yemeğe bir mililitre PBS ekleyin.Hücreleri temiz bir kazıyıcı ile kazıyarak çıkarın ve hücre süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücre peletlerini toplamak için beş dakika boyunca 700 G'de santrifüj yapın. Her tüpteki hücrelere proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 800 mikrolitre buz gibi soğuk FLAG lizis tamponu ekleyin.Hücreleri bir vorteks osilatör veya pipet tabancası kullanarak karıştırın ve ardından karışımı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede bir rotatörde inkübe edin. Karışımı buz üzerinde her nabız bir saniye sürerek ultrasonikleştirin ve karışımı beş ila 10 kısa darbeye maruz bırakın. Karışımı 40 RPM'de bir rotatörde dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra ultrasonize edilmiş örnekleri dört santigrat derecede 20 ila 30 dakika boyunca 8, 000 G'de santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aliquot 80 mikrolitre hücre ekstresi ve 20 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ile karıştırın.Örnekleri beş dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın. İki dakika buz üzerinde soğutun ve kullanana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu örnekleri, protein ekspresyonunu izlemek için giriş grubu olarak kullanın.Daha sonra, kalan hücre ekstraktlarına 30 mikrolitre anti-FLAG M2 antikoru konjuge boncuk ekleyin ve en az dört saat veya bir gecede dört santigrat derecede bir rotatörde inkübe edin. Boncukları toplamak için dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 G'de santrifüj yapın. Boncuklara bir mililitre buz gibi soğuk FLAG lizis tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.Bu adımı dört ila altı kez tekrarlayın, ardından boncuklara mikrolitre başına 200 nanogramlık son konsantrasyonda 40 mikrolitre FLAG peptit ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi iki saat boyunca bir rotatör üzerinde inkübe edin ve ardından aynı sıcaklıkta santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ekleyin.Karışımı beş dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın ve ardından iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Hücre peletlerine bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve eşit şekilde karıştırın. Aliquot 100 mikrolitre hücre süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne giriş numunesi olarak girer ve hücre peletlerini toplamak için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 700 G'de santrifüj yapar.Giriş numunesine 80 mikrolitre FLAG lizis tamponu ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi bir vorteks osilatör kullanarak hücreleri karıştırın. Hücreleri bir saat boyunca buz üzerinde lize edin ve ardından 20 ila 30 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Santrifüzyondan sonra, süpernatantın 80 mikrolitresini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve süpernatana 20 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ekleyin.Karışımı beş ila 10 dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın ve ardından iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Hücre peletini toplamak için hücre süspansiyonunun kalan 900 mikrolitresini 700 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletlerine bir mililitre ubikitin tamponu 1 ekleyin ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.Hücre, çözelti artık viskoz olmayana kadar buz üzerinde ultrasonikasyonun 10 ila 20 turuna lizatlar yapın ve daha sonra çözeltiyi santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve süpernatana 30 mikrolitre nikel yüklü reçine ekleyin. 15 RPM'de bir rotatörde dört saat veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve ardından iki dakika boyunca santrifüj yapın.Santrifüzyondan sonra, boncukları toplayın ve bir mililitre ubikitin tamponu 1 ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve daha sonra daha önce gösterildiği gibi iki dakika boyunca 1.500 G'de tekrar santrifüj yapın. Boncuklara bir mililitre ubikitin tamponu 2 ekleyin ve boncukları toplamak için daha önce gösterildiği gibi inkübasyon ve ardından santrifüjleme yapın.Bu adımı bir kez tekrarlayın. Ardından, boncuklara bir mililitre PBS ekleyin ve boncukları toplamak için inkübasyon ve santrifüjleme için aynı prosedürü izleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.Boncukları oda sıcaklığında bir saat boyunca 0.5 molar nihai konsantrasyonda 40 mikrolitre imidazol ile inkübe ederek bağlı proteinleri inkübe edin. Kuluçkadan sonra, iki dakika boyunca tekrar 1.500 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ekleyin.Çözeltiyi beş dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın ve ardından iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Numuneleri SDS-PAGE ile çözün ve daha sonra karşılık gelen antikorları kullanarak hedef proteinleri tespit etmek için batı lekeleme yoluyla bir nitroselüloz membranına aktarın. Batı lekelenmesinden gelen sinyalleri tespit etmek için kemilüminesans görüntüleme sistemini başlatın.Nitroselüloz membranı kamera obscura'ya yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Bir pipet tabancası kullanarak substrat çözeltisini membran üzerinde eşit şekilde kodlayın. Son olarak, kemilüminesan sinyalleri yakalamak için otomatik pozlama prosedürünü seçin ve ideal bir sinyal elde edilene kadar pozlama süresini manuel olarak ayarlayın.Ubikitinlenmiş p53 de dahil olmak üzere toplam p53 proteini, denatüre olmayan koşullar altında H1299 hücrelerinden FLAG M2 boncukları ile immünoçökeltildi. Elüat, anti p53 ve anti hemaglutinin veya anti p53 ve monoklonal antikorlarla batı lekelenmesine maruz kaldı. Burada, ham hücre ekstraktları veya girdileri, anti p53 ve anti MDM2 monoklonal antikorları ile batı lekelenmesine tabi tutuldu.Düşük molekül ağırlığından yüksek molekül ağırlığına kadar bulaşmış bir bant olarak görünen ubikitinlenmiş p53 proteininden gelen sinyal, MDM2 bu hücrelerde ektopik olarak eksprese edildiğinde belirgin şekilde artmıştır. Bu sonuç, ubikitinlenmiş p53 proteininin hücrelerden etkili bir şekilde saflaştırıldığını göstermektedir. Daha sonra, hücreler denatüre edici koşullar altında lize edildi.Toplam hücresel ubikitinlenmiş proteinler nikel yüklü reçine ile aşağı çekildi ve daha sonra anti p53 ve anti hemaglutinin monoklonal antikorları ile batı lekelenmesine tabi tutuldu. Ubikitine p53 proteini, bir anti p53 antikoru ve bir anti hemaglutinin antikoru kullanılarak tespit edildi. Burada ham hücre ekstraktları veya girdileri, anti p53 ve anti MDM2 monoklonal antikorları ile batı lekelenmesine tabi tutuldu.Sonuçlar, toplam ubikitinlenmiş protein seviyesinin değişmediğini, ancak MDM2 bu hücrelerde aşırı eksprese edildikten sonra ubikitinlenmiş p53 protein seviyesinin çarpıcı bir şekilde arttığını göstermiştir. Bu, ubikitinlenmiş p53 içeren toplam ubikitin proteinlerinin, denatüre edici koşullar altında hücre lizatlarından etkili bir şekilde aşağı çekildiğini göstermektedir. Bu prosedürü denerken, hücre toplamadan önce hücreleri MG132 ile tedavi etmeyi ve ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması için hücreleri buz üzerinde düzgün bir şekilde ultrasonize etmeyi unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Floresan Boyut Dışlama Kromatografisi ile Membran Protein Kalitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Kriyo-Elektron Mikroskobu ile Mikrotübül Protein Komplekslerini İncelemek için Memeli Hücrelerinden Modifiye Mikrotübüllerin Çıkarılması

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...