Name: combining 3d-printing and electrospinning to manufacture biomimetic heart valve leaflets
Uploaded: 2022-03-23T13:40:00
Duration: 10 min 29 s
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这项工作得到了血管医学临床科学家计划（PRIME）的支持，该计划由Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG，德国研究基金会）资助，项目编号为MA 2186/14-1。

1. 准备工作
<ol><li>3D打印 注意：以下步骤需要下载随本手稿一起提供的“标准三角形语言”（STL） 文件，这些文件作为 补充文件 1、补充文件 2、补充文件 3、补充文件 4 和 补充文件 5 提供。收集器零件以 STL 文件的形式提供。连接法兰以“用于交换产品模型数据的STandard”（STEP）文件的形式提供，以允许调整收集器以适应各个设置。此外，中央金属棒的技术图纸作为 补充文件6提供用于常规制造。<ol>
<li>打开切片软件（参见 材料表），为非导电聚乳酸 （PLA） 和 0.4 mm 喷嘴配置有源打印头。 注意：切片软件、灯丝和喷嘴直径可能因可用的 3D 打印机而异。</li>
		<li>将 STL 文件 Specimen_mount_A（补充文件 3） 和 Speciment_mount_B（补充文件 4） 上传到切片软件中。</li>
		<li>旋转模型，以便将三角形曲面放置在构建板上。</li>
		<li>标记所有零件，单击鼠标右键，然后选择“乘以所选模型”。在提示的份数中输入 1，然后单击确定。在构建板上放置总共四个模型。</li>
		<li>将切片厚度设置为 0.1 mm，壁厚设置为 1 mm，将填充密度设置为 40%，然后取消选中 生成支撑 框。</li>
		<li>单击切片按钮|保存到“可移动”以将打印文件保存到 USB 驱动器。</li>
		<li>将非导电 PLA 装入打印机并启动打印文件。</li>
		<li>打印完成后，从构建板上取下模型，并检查底部角落的翘曲。</li>
		<li>在切片软件中，保留材料参数，并将模型替换为Collector_Flange（补充文件1和补充文件5）和Leaflet_Template（补充文件2）。</li>
		<li>旋转法兰，使平坦的圆形表面靠在构建板上。此外，旋转传单模板，以便将方形表面直接放置在构建板上。</li>
		<li>标记法兰并将模型相乘，如步骤 1.1.4 所示。键入 1 以接收构建板上法兰模型的 1 份副本和 1 份原 件。</li>
		<li>按照 1.1.4 中描述的步骤，标记传单模型并乘以 8 以接收总共 9 个传单模型。</li>
		<li>将 切片厚度 设置为 0.1 mm，壁厚 设置为 1 mm，填充密度 设置为 80%，然后取消选中 生成支撑 框。</li>
		<li>单击切片按钮|保存到可移动以将新的打印文件保存到 USB 驱动器。</li>
		<li>将导电 PLA 装入打印机并开始打印过程。</li>
		<li>打印完成后，从构建板中取出模型。如果小叶型号中存在，请用线切割器小心地去除小叶底部的单个灯丝纤维（因为未使用支撑结构）。</li>
	</ol></li>
	<li>纺纱解决方案 注意：四氢呋喃（THF）和二甲基甲酰胺（DMF）是有害溶剂，不应吸入或接触皮肤。强烈建议在处理时戴上耐溶剂手套和护目镜。在处理它们时，请在排气罩下工作，因为它们非常不稳定。<ol>
<li>在排气罩下放置一个秤，并在其上放置一个 200 mL 螺旋盖玻璃瓶。去皮量表。</li>
		<li>将50毫升DMF和50毫升THF倒入玻璃瓶中。注意溶剂的重量。</li>
		<li>在瓶子内放置一个磁棒，将瓶子放在磁力搅拌器上，然后将其打开。</li>
		<li>将记示的重量乘以0.15（= 15%w / v），并将相应量的聚氨酯（PU）缓慢转移到含有溶剂混合物（DIN 1310）的玻璃瓶中。</li>
		<li>关闭瓶子并在室温下搅拌至少12小时以获得均质溶液。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 静电纺丝设置
<ol><li>集会 注意：由于使用所呈现的收集器创建的传单脚手架相对较小，因此建议选择使用大直径滚筒心轴（D：110 mm）。这允许创建更大的多层支架，这将有利于微观，生物相容性和生物力学评估。<ol>
<li>使用 3D 打印部件和六个 M3 x 15 螺钉组装收集器。</li>
		<li>使用三个螺钉将金属棒固定在其中一个法兰上。</li>
		<li>在金属棒之间滑动一 Specimen_mount_B 。确保模板的空间指向法兰的相反方向。</li>
		<li>用心脏瓣膜小叶模板填充 Specimen_mount_B 的三个插槽。</li>
		<li>将 Specimen_mount_A 放在顶部，并用模板填充空间。</li>
		<li>将另一个 Specimen_mount_A 滑入并用模板填充空间。</li>
		<li>通过将第二 个Specimen_mount_B 放在顶部来固定模板。</li>
		<li>将第二个法兰放在顶部，然后使用M3螺钉将其固定。 注：确保小叶模板的方向都朝同一方向（小叶的直边平行于金属棒）。</li>
		<li>将组装好的传单收集器置于静电纺丝装置中，并将法兰紧紧地固定在电机轴上（即M6螺钉和翼形螺母）上（图1）。 注意：由于导电 PLA 比普通 PLA 更脆，因此在紧固对材料施加压力的螺栓时，请使用 1.4 Nm 的扭矩扳手，以避免折断。</li>
		<li>将针架放在离收集器 30 厘米的位置。</li>
		<li>将一个14号（G）的针头固定在针座上，用扁平的尖端将其固定在收集器轴的高度。</li>
		<li>将柔性、耐溶剂（例如聚四氟乙烯 （PTFE））管连接到针的鲁尔锁定端口。 注意：DMF和THF可溶解许多塑料。在使用这些溶剂（例如金属和玻璃工具）时，必须使用耐溶剂材料。当需要塑料工具（即注射器或管道）时，请确保使用耐溶剂材料。</li>
		<li>将管子引导至注射器泵，以便以后连接聚合物填充的注射器。</li>
	</ol>
</li>
	<li>电源单元 （PSU） 的连接 注意：在设置过程中，请确保电源已与主电源断开连接。<ol>
<li>将两根屏蔽高压电缆连接到电源的阳极和阴极。</li>
		<li>使用鳄鱼夹，将连接到阴极（-杆）的电缆连接到14 G针。检查夹子和针头之间的连接。接下来，引导高压电缆，使其在旋转区域外运行，以避免干扰。</li>
		<li>使用鳄鱼夹和第二根高压电缆将集电极连接到阳极（+极）。使用滑环或滑动触点，使用剥离电缆在收集器的法兰处形成接触。</li>
	</ol>
</li>
	<li>注射器的准备 注意：此步骤应在纺纱过程开始之前立即执行。<ol>
<li>用步骤1.2中制备的纺丝溶液填充20 mL鲁尔锁定注射器。</li>
		<li>将注射器连接到耐溶剂管，并手动将溶液推入管路系统中，直到针尖处可见液滴。</li>
		<li>将注射器放入注射器泵中。打开泵后，输入以下参数： 直径：19.129 mm; 容量： 5 毫升; 速度 3 毫升/小时。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 静电纺丝工艺
<ol><li>电机试运行 注意：使用 3D 打印制造收集器可能会导致收集器偏离中心运动。因此，强烈建议以较低的转速运行，但没有高电压。<ol>
<li>通过双击计算机上的图标打开电机控制软件。</li>
		<li>通过单击“ 连接 ”按钮连接到电机控件。</li>
		<li>连接后，选择 “配置文件速度 ”操作模式，然后单击位于屏幕左上角的“ 操作 ”选项卡。</li>
		<li>选择由红线框住的快速停止按钮下方的“轮廓速度”选项卡。输入以下设置： 目标速度： 200 rpm;轮廓加速度：100;型材减速： 200;快速停止：5000。 注意：指针侧的旋转方向应朝上，可以通过将“目标速度”字段中的符号从“+”更改为“-”来调整。</li>
		<li>开始测试运行并检查收集器是否存在任何不平衡。如果收集器运行平稳，请继续执行协议。否则，请停止电机并按照步骤2.1.9中所述重新调整收集器。</li>
		<li>通过单击 启用开关 按钮停止电机，并将 目标速度 更改为 2，000 rpm。</li>
	</ol></li>
	<li>制造工艺 注：静电纺丝是一种对环境参数高度依赖的过程。在21至24°C的温度下，相对湿度在15-20%之间获得最佳的静电纺丝结果。<ol><li>第一层 注意：在设置阶段，可能在针尖形成了一滴干燥的PU液滴。如有必要，使用长而非导电的工具去除液滴。<ol>
<li>在电机控制软件中，单击 启用操作 按钮以打开电机。</li>
			<li>打开高压电源，调整阳极和阴极的电压：负极（针）：18 kV;加极（集电极）：1.5千伏。</li>
			<li>以 3 mL/h 的流速启动注射泵。</li>
			<li>将计时器设置为 20 分钟。</li>
			<li>观察针尖形成裁缝锥体。根据针尖锥体的形状，以±100 V的增量调整阴极的电压，直到建立稳定的定制锥体。 注：如果压降挂起，则电压过低。然而，不稳定的流动可能表明电压设置得太高。</li>
			<li>等待20分钟，让尖点模板被纤维充分覆盖。</li>
			<li>关闭注射泵。</li>
			<li>通过翻转电源开关关闭 PSU。</li>
			<li>通过单击电机控制软件中的 “打开启用 ”按钮停止电机。 注意：为防止系统中移动部件造成伤害，请等到收集器完全停止后再打开测试室。</li>
		</ol></li>
		<li>第二层<ol>
<li>在电机控制软件中，将输入字段 目标速度 更改为 10 rpm。</li>
			<li>重复步骤 3.2.1.1-3.2.1.9。</li>
		</ol></li>
		<li>第三层 注意：在脚手架完全干燥之前，它们对机械应力非常敏感。执行步骤 3.2.3.2-3.2.3.6 时要非常小心。在这些步骤中避免触摸支架/纤维，因为支架可能会变得无用。<ol>
<li>小心地打开将收集器法兰连接到电机轴的螺钉，然后从静电纺丝装置上取下小叶收集器（图2B）。</li>
			<li>使用手术刀，沿着每个小叶模板的外轮廓切割电纺纤维（图2C）。</li>
			<li>卸下收集器一侧的法兰。</li>
			<li>拉出3D打印的插入物，并将传单模板与非导电三角形支架分开。</li>
			<li>将所有传单模板旋转 90°，然后重新组装收集器。</li>
			<li>将收集器插入静电纺丝装置并紧紧固定。</li>
			<li>同样，在继续旋转过程之前，请检查是否有任何不平衡。</li>
			<li>在电机控制软件中，将输入字段 目标速度 更改为 2，000 rpm。</li>
			<li>重复步骤 3.2.1.1-3.2.1.9。 注意：完成静电纺丝过程后，强烈建议使用纯DMF冲洗管子和针头，以防止管子堵塞。</li>
		</ol></li>
		<li>荧光染色支架（可选） 注意：荧光染料用于使纤维在常规荧光显微镜下可见。这仅在实现方法和应用新设置后的质量控制时才需要。在使用既定设置制造支架时，不建议使用荧光染料。<ol>
<li>将步骤1.2中制备的纺丝溶液分成三个相等的份，装在单独的瓶子中。</li>
			<li>使用秤，测量每克（0.1重量%）聚合物溶液1mg荧光染料。对所有三种荧光染料（即荧光素，德克萨斯红，4'，6-二脒-2-苯基吲哚[DAPI]）重复上述步骤。</li>
			<li>将染料加入纺丝溶液中，关闭瓶盖，搅拌2-3小时或直到均质化。 注意：为了防止荧光染料褪色，请尽可能保护纺丝溶液免受光照，即通过在磁力搅拌器上放置不透明的盖子。荧光染色支架的工艺与步骤3.2.1-3.2.3中描述的标准工艺非常相似。</li>
			<li>在步骤3.2.1中，用装有含有第一荧光染料的纺丝溶液的注射器替换标准注射器。</li>
			<li>在步骤3.2.2中，用新的或清洁过的管子和针头替换当前使用的管材和针头。随后，将装有含有第二种荧光染料的纺丝溶液的注射器置于注射器泵中。</li>
			<li>再次在步骤3.2.3中，用新的或清洁过的管子和针头替换管子和针头，并用装有含有第三种荧光染料的纺丝溶液的注射器替换注射器。 注：为避免制造过程中的延误，最好使用三套管材和针头。或者，可以在生产层之间用THF和DMF彻底冲洗管和针，直到系统中没有残留含有荧光染料的纺丝溶液。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. 后处理和样品采集
<ol><li>后处理脚手架<ol>
<li>从静电纺丝装置上取下收集器。</li>
		<li>使用手术刀，按照步骤3.2.3.2中所述，在其底部免费切割每个模板。</li>
		<li>如上所述，打开收集器，然后将模板放在托盘上。</li>
		<li>将托盘放在干燥柜中在40°C下过夜。</li>
		<li>样品完全干燥后，用手术刀沿着传单模板的边缘小心地切割，以除去多余的纤维。</li>
		<li>然后，小心地剥离模板的小叶支架，并将其放在托盘上进行进一步处理。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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作者声明没有利益冲突。

所描述的方案提出了（心血管）组织工程领域的两项创新：低成本制造用于静电纺丝的完全3D打印幻影，以及使用多功能收集器生产适应性强的多层心脏瓣膜传单。
最近，3D打印已成为生产实验室设备的宝贵工具，例如，生物反应器或制造和测试装置11，12。因此，可以在短时间内以负担得起的预算制造本研究中介绍的静电纺丝装置（表1）。这与之前通过使用3D打印低成本生产静电纺丝装置的发现一致13。 
此外，据作者所知，这是第一次使用导电3D打印材料来创建心脏瓣膜传单的静电纺丝收集器。到目前为止，3D打印的收集器要么通过金属激光烧结14 制造，要么使用非导电聚合物打印和随后的后处理与导电涂层15。与这种新颖的方法相比，这些程序处于明显的劣势，因为它们更昂贵，需要更长的时间或需要更多的体力劳动。
静电纺丝取决于影响所创建纤维形态的众多变量。虽然市场上有不同的商业静电纺丝装置，但许多研究小组使用高度个性化的装置来满足他们的特定需求16.考虑到这一点，该协议中描述的值（电压，距离和转速）可能需要针对各个设置进行调整，并且应被视为起点而不是固定值。此外，已知环境参数可对静电纺丝结果17，18产生重大影响。因此，强烈建议在静电纺丝钻机内至少控制温度和湿度。在21至24°C的温度下，相对湿度在15-20%之间获得最佳的静电纺丝结果。 为了遵循该协议，以下设备至关重要：能够将重约300 g的除尘器加速至2，000 rpm的转速的电机，适用于1-3 mL / h的小体积流量的注射泵，以及能够±20 kV直流电（DC）的双极电源单元。
与先前的研究一致，可以通过荧光显微镜19可视化静电纺丝支架的纤维结构。可以成功地展示支架的多层结构，包括不同的纤维取向。特别是在处理多层或多种材料时，应将引入荧光染料视为严格质量控制的标准程序。它可以改善参数或工作流程协议更改后结果的视觉评估。不能推荐在支架中应用染料以进行 体内 或 体外 评估。这对于避免干扰已建立的分析方法非常重要。
模仿自然心脏瓣膜形态对于产生用作心脏瓣膜假体的组织工程复制品非常重要（图4B）。已经证明，特定的阀门几何形状对 体内 改造20具有很高的影响。在这种情况下，用于静电纺丝的传单几何形状的3D打印是有利的，因为迭代很容易和快速地实现。甚至可以想象个性化瓣膜几何形状的生产，并且可以随后开发心脏瓣膜异常的个性化和个性化3D模型，例如，用于教学目的。
进一步改善组织工程心脏瓣膜特性是当前研究工作的核心，因为几个研究小组致力于开发具有定义纤维取向的多层支架。Masoumi等人由模塑聚甘油癸二酸酯层和电纺聚己内酯（PCL）纤维毡21制备复合支架。因此，可以由两个定向的电纺层创建三层，由一片微加工的聚甘油癸二酸酯隔开。然而，与手头的脚手架相比，它们既不是3D形状，也没有充分模仿中间层（海绵体）。另一种生产生物启发组织工程心脏瓣膜的方法由Jana等人追求，22，23。他们成功地生产了带有定向纤维的三层支架，使用铝收集器进行基于PCL的静电纺丝。同样，这些脚手架也呈现出形态上的缺陷，因为它们只有2D外观，而最终的脚手架则由辐条渗透。 
尽管该协议提供了有关如何生产3D三层心脏瓣膜传单的详细信息，但还需要几个步骤才能创建实际的心脏瓣膜假体。对于此处描述的小叶，建议使用直径为 24 mm 的支架。作为对所用支架的补充，传单可以提供额外的支撑结构进行缝合。为了获得最大的灵活性，此处显示的传单没有针对特定的支架设计进行个性化设置。这可以通过简单地使用CAD软件更改模板来完成。
虽然用于心脏瓣膜组织工程，但所提出的方法将很容易适用于骨科24，泌尿科25，耳鼻喉科26等的静电纺丝装置。通过实施其他3D打印收集器，可以生产复杂和/或个性化的3D结构。虽然集热器的材料发生了变化，但静电纺丝的原理保持完好无损27。因此，使用不同的聚合物在理论上是可能的，尽管可能需要调整静电纺丝参数。
总体而言，所提出的方案描述了一种制造多层心脏瓣膜传单的简单且经济高效的方法。3D打印的应用允许快速适应和修改收集器和刀片。这允许生产患者特定的假体，而无需复杂的制造工艺，例如金属收集器。在相同条件下，一次运行可以创建多个样本。因此，可以对样品进行材料破坏性测试，并具有（几乎）相同的样品以构建实际阀门的好处。在本研究中将打印文件作为 补充文件 包含在内，旨在支持多层心脏瓣膜支架的进步。这种新的静电纺丝技术对于再生医学的其他领域也具有很高的潜力，因为改良的收集器和其他3D打印的纺丝模板很容易实现。

心血管疾病是西方国家的主要死因 1.尽管在这一领域进行了广泛的研究，但据估计，退行性心脏瓣膜疾病的负担将在未来几年进一步增加2。手术或介入性心脏瓣膜置换术可作为治疗选择。在这一点上，机械和生物假体心脏瓣膜是可用的，两者都有各自的缺点。机械瓣膜是血栓形成的，需要终身抗凝治疗。虽然生物瓣膜不需要抗凝，但它们表现出缺乏重塑，钙化率高以及伴随的降解3。
组织工程心脏瓣膜可能能够通过将微纤维支架引入体内以允许 体内 重塑来解决这些缺点。可以使用各种方法，例如静电纺丝（ESP），脱细胞化，微成型，喷雾，浸涂和3D生物打印。可以选择这些方法来创建特定的属性，更便宜，更快捷，或者只是由于缺乏替代方案。方法和材料甚至可以组合在一起，创造出更复杂的结构4.例如，ESP一直是组织工程中创建支架的标准技术，允许组合不同的材料并调整纤维直径，纤维取向和孔隙率4。此外，各种后处理技术允许优化组织重塑，改善血液相容性，以及可调节的静电纺丝支架5，6，7的生物降解。
基本ESP使用静态或旋转收集器，其直接影响光纤对准度和获得的光纤直径8。由于制造限制，经典的ESP旋转收集器由旋转鼓，圆盘，电线或金属棒组成。3D打印的引入允许创建更个性化的收集器几何形状，不受传统制造技术的限制。这种个性化对于创建3D结构（如心脏瓣膜传单）特别有用。
人类心脏瓣膜传单的天然三层（纤维，海绵体，心室）结构是组织对它们在心脏周期中暴露的机械力和剪切应力的反应9，10。纤维板的纤维沿周向定向，而海绵层的纤维是随机排列的，而心室板的纤维是径向排列的。因此，提出了具有相应纤维取向的三层，以模拟组织工程支架中这些瓣膜的性质。
工作流程协议描述了一种使用3D打印和静电纺丝生产三层3D心脏瓣膜传单的创新方法。此外，还介绍了一个质量控制步骤，以确保每一层的纤维取向准确。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BTC-FR2.5TN.D09</td>
			<td>ZwickRoell GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td>Traction engine (Tensile tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C5-E Motor Controller</td>
			<td>Nanotec Electronic GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td>Motor controll unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA</td>
			<td>iseg Spezialelectronik GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Power Supply Unit Anode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA</td>
			<td>iseg Spezialelektronik GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Power Supply Unit Kathode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Composite PLA</td>
			<td>ProtoPasta</td>
			<td></td>
			<td>Conductive PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cura 4.7.1</td>
			<td>Ultimaker BV</td>
			<td></td>
			<td>Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td></td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel No. 23</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td></td>
			<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume Hood as per DIN 12924 Class 2</td>
			<td>K&#246;ttermann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Software for Confocal Laser Scanning Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luerlock Syringe 20 mL</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td></td>
			<td>Luerlock Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm</td>
			<td>Unimed S.A.</td>
			<td></td>
			<td>Needle with plane tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16&#34; x 1/8&#34;, length 1.000 mm</td>
			<td>Bohlender GmbH</td>
			<td>F740-28</td>
			<td>Solvent resistant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellethane 2363 80AE</td>
			<td>Velox GmbH Hamburg</td>
			<td></td>
			<td>Polyurethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLA</td>
			<td>Ultimaker BV</td>
			<td></td>
			<td>PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug&#38;Drive Studio (1.0.4)</td>
			<td>Nanotec Electronic GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td>Motor operation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Evo LS 10</td>
			<td>Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHT 31-D</td>
			<td>Adafruit Industries</td>
			<td></td>
			<td>Temperature and Humidity Sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2020 CAD Software</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td>Commercial CAD Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulforhodamine 101 50 mg</td>
			<td>Sigma - Aldrich&#160;</td>
			<td>S 7635</td>
			<td>Texas Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump Model: Fusion 100</td>
			<td>Chemyx Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8 inverted CEL BMi8</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>testXpert V11.02</td>
			<td>ZwickRoell GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td>Software Tensile Test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran &#8805;99.9%</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1511530000202 #980361</td>
			<td>Binder Labortechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Heating Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 3 Extended</td>
			<td>Ultimaker BV</td>
			<td></td>
			<td>3D Printer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining 3d-printing and electrospinning to manufacture biomimetic heart valve leaflets

静电纺丝已成为心血管组织工程中广泛使用的技术，因为它提供了创建具有可调节性质的（微）纤维支架的可能性。这项研究的目的是使用导电3D打印收集器创建多层支架，模仿人类心脏瓣膜传单的建筑纤维特性。
主动脉瓣尖的模型是使用商业计算机辅助设计（CAD）软件创建的。导电聚乳酸用于制造3D打印的传单模板。这些尖点负片被集成到一个专门设计的旋转静电纺丝心轴中。将三层聚氨酯纺到收集器上，模仿人体心脏瓣膜的纤维取向。用扫描电子显微镜（SEM）评估表面和纤维结构。荧光染料的应用还允许多层纤维结构的微观可视化。进行拉伸测试以评估支架的生物力学特性。
以低预算在短时间内可以对静电纺丝钻机的基本部件进行3D打印。按照该协议创建的主动脉瓣尖是三层的，纤维直径为4.1±1.6μm。荧光显微镜揭示了具有不同排列的纤维的单个层，每层精确地达到所需的纤维配置。生产的脚手架显示出很高的拉伸强度，特别是沿着对准方向。不同收集器的打印文件可用作 补充文件 1、 补充文件 2、 补充文件 3、 补充文件 4 和 补充文件 5。
通过高度专业化的设置和工作流程方案，可以在多层上模拟具有复杂纤维结构的组织。直接在3D打印的收集器上旋转，在以较低的生产成本制造3D形状方面创造了相当大的灵活性。

该协议旨在开发一种三层小叶支架，用于心脏瓣膜的心血管组织工程。它模仿了人类天然心脏瓣膜中三层的胶原蛋白配置。每层由总直径为4.1±1.6μm的纤维组成（图1）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63604/63604fig01.jpg"> 图 1：光纤特性。 纤维分析：总纤维数;直径（μm）：平均值、模式、标准偏差、最小直径、最大直径。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/63604fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
小叶模板设计用于适合Ø 24 mm主动脉瓣假体（图2C）。干燥后，小叶支架保持其3D心脏瓣膜尖端的形状（图3A）。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63604/63604fig02.jpg"> 图2：静电纺丝设置。 （A）旋转设置中组装的3D打印收集器;（B） 3D打印收集器的CAD渲染;（三）CAD渲染的心脏瓣膜小叶阴性，如 B所示;三角形表示放大的部分。缩写：CAD = 计算机辅助设计。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/63604fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
SEM成像用于评估对齐和未对齐的层（TEMP F3512-21）。照片是在支架上的三个不同位置以100x，500x和2，000x放大倍率拍摄的。对齐的纤维支架在圆周方向上具有光滑的表面和严格的取向（图3B）。对2，000x图像的纤维取向进行视觉分析，确认了纤维的主要对准（图3C）。与对齐的纤维相比，未对齐的光纤支架显示出类似的光滑表面。纤维取向是无序的，纤维之间有许多突出的交叉点（图3D）。随后的视觉分析证实了纤维的未对准，看不到主要取向（图3E）。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63604/63604fig03.jpg"> 图3：静电纺纱小叶和SEM成像。 （A）电纺多层小叶和3D打印小叶收集器;（B） 未对齐纤维的扫描电镜图像（放大倍率为1 000倍）;（C） 未对准纤维的纤维取向分析;（D） 对齐光纤的扫描电镜图像（放大倍率为1 000倍）;（五）排列纤维的纤维取向分析。比例尺 = 10 毫米 （A）， 100 μm （B， D）。缩写：SEM=扫描电子显微镜。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/63604fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
荧光染色多层支架的成像显示三层具有不同纤维取向的单独层（图4D）。底层（图4A;蓝色）以水平方向显示对齐的光纤，光纤之间的交点很小。中间层（图4B;绿色）显示未对齐的光纤，没有初级纤维取向。顶层（图4C;红色）以垂直方向显示对齐的纤维。对顶层和底层的视觉分析显示，两层之间的平均角度为89°，这与纺丝过程中收集器的90°旋转一致（图4E）。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63604/63604fig04.jpg"> 图4：多层支架的荧光显微镜（A）第一层的荧光图像，主要方向从左下角到右上;（B）具有未对齐纤维取向的第二层的荧光图像;（C）第三层的荧光图像，主要方向从右下到左上;（D） 所有三层合并在一个支架中的荧光图像;（E） 所有三层的纤维取向分析（第1层：蓝色;第2层：绿色;第3层：红色）;放大倍率 = 400x （A-D）;比例尺 = 100 μm （A-D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/63604fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
对21个样品进行厚度测量（图5A）（TEMP F3510-21）。所有样本都是应用相同的参数创建的。温度和湿度可能分别在20.3 °C和26.1 °C以及35%和55%的湿度之间变化。结果显示厚度相对线性增加，每分钟约2.65μm。
另一个实验显示了在匹配参数下旋转60分钟后结果的一致性（图5B）。湿度和温度分别在35%和50%湿度和20.3°C至26.1°C之间变化。结果是厚度在126至181μm之间的支架。平均厚度为151.11±13.17μm。厚度的增加平均约为每分钟2.52μm。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63604/63604fig05.jpg"> 图5：厚度测量。 （A）每次纺丝的脚手架厚度;n = 21;相关系数 （r） = 0.653;p** = 0.00132;（B）60分钟后的样品厚度;n = 13;红线：平均值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/63604fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
对齐和未对齐的纤维支架的拉伸测试在两个方向上进行，沿着圆周方向垂直于它。每个灌浆由15个试样组成。根据DIN 53504：2017-03从飞机支架中取出样品。在每个样品的三个不同点测量厚度，并用于计算每平方毫米的最大力值。
厚度值介于 0.03 和 0.2 mm 之间。极限拉伸强度的比较显示，对齐的纤维支架的取向之间存在显着差异（p <0.001）（图6A）。支架沿圆周方向的最大强度达到12.26±2.59 N / mm2 。拉伸强度在垂直方向上降低到3.86±1.08 N/mm2 。
未对齐的纤维支架在不同方向上的极限拉伸强度没有差异（F1：7.19 ±1.75 N/mm2，F2：7.54 ±1.59 N/mm2;p = 0.60）。对齐纤维支架断裂伸长率的比较分析显示，方向之间的膨胀性存在显着差异（p <0.001）（图6B）。延伸率达到187.01±圆周方向为39.37%，垂直方向为107.16±为30.04%。
相比之下，未对齐纤维毡的断裂伸长率在两个方向上都显示出均匀的延展性（F1：269.74±24.78%;F2： 285.01 ± 25.58 %;p = 0.69）。代表性的应力-应变曲线显示材料行为的巨大差异，具体取决于施加拉力的方向。未对齐的纤维毡表现出线性弹性行为，而对齐的纤维毡在轴向方向上表现出非线性。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63604/63604fig06.jpg"> 图6：对齐和未对齐纤维的拉伸试验。 （A）圆周和轴向对齐和未对齐纤维毡的极限拉伸强度;n = 15;（B） 圆周和轴向对齐和未对齐纤维毡的断裂伸长率;n = 15;（C）分别沿轴向和圆周方向拉动的对齐和未对齐支架的代表性应力 - 应变曲线。（***p < 0.001）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/63604fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td style="min-width: 40px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">制造指标</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 40px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">名字</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">材料</td>
			<td style="min-width: 60px;">量</td>
			<td style="min-width: 60px;">总时间</td>
			<td style="min-width: 60px;">总重量 [g]</td>
			<td style="min-width: 60px;">费用 [€ 每公斤]</td>
			<td style="min-width: 60px;">总成本</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 40px;">1</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Specimen_Mount_A</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">常规解放军</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">18:19</td>
			<td style="min-width: 60px;">159</td>
			<td style="min-width: 60px;">51.33 €</td>
			<td style="min-width: 60px;">8.16 €</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 40px;">2</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Specimen_Mount_B</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">常规解放军</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">19:42</td>
			<td style="min-width: 60px;">161</td>
			<td style="min-width: 60px;">51.33 €</td>
			<td style="min-width: 60px;">8.26 €</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 40px;">3</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">集热器法兰</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">导电聚乳酸</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">10:40</td>
			<td style="min-width: 60px;">95</td>
			<td style="min-width: 60px;">99.98 €</td>
			<td style="min-width: 60px;">9.50 €</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 40px;">4</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Leaflet_Inlet</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">导电聚乳酸</td>
			<td style="min-width: 60px;">9</td>
			<td style="min-width: 60px;">05:32</td>
			<td style="min-width: 60px;">31</td>
			<td style="min-width: 60px;">99.98 €</td>
			<td style="min-width: 60px;">3.10 €</td>
		</tr>
<tr>
<td style="min-width: 40px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">总</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;">29.02 €</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1：制造指标。 指定 3D 打印零件的数量、制造时间、所需材料量和成本的表。缩写：PLA =聚乳酸。
补充文件 1：适应性强的收集器法兰。 步骤文件，用于适应和打印收集器法兰。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/Collector_Flange_adaptable.STEP" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 2：传单模板。 STL文件打印传单模板。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/Leaflet_Template.STL" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 3：试样安装座 A。 STL 文件以打印试样安装座 A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/Specimen_Mount_A.STL" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 4：试样安装座 B。 STL 文件用于打印试样安装座 B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/Specimen_Mount_B.STL" target="_blank">请单击此处下载此文件。</a>
补充文件 5：收集器法兰。 用于打印收集器法兰的 STL 文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/Collector_Flange.STL" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件6：连接金属棒。 用于构建连接金属杆的技术图纸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63604/Connecting_Rod.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining 3D-Printing and Electrospinning to Manufacture Biomimetic Heart Valve Leaflets at JoVE.com

Combining 3D-Printing and Electrospinning to Manufacture Biomimetic Heart Valve Leaflets

所提出的方法为三维（3D）支架（例如心脏瓣膜传单）中的仿生纤维结构工程提供了一种创新方法。3D打印的导电几何形状用于确定形状和尺寸。纤维取向和特性可针对每层单独调整。可以在一次设置中制造多个样品。

结合3D打印和静电纺丝来制造仿生心脏瓣膜传单

Electrospinning has become a widely used technique in cardiovascular tissue engineering as it offers the possibility to create (micro-)fibrous scaffolds ...

由定向纤维组成的三层结构可以在人体内随处可见。应用这种方法，不仅可以创建模仿自然条件的心脏瓣膜传单，还可以创建各种其他组织。这是3D打印的导电材料收集器首次用于静电纺丝，这一事实使这一过程具有高度的灵活性和成本效益。首先，通过将STL文件标本装载A和样品装载B上传到切片软件中来开始3D打印。旋转模型，使三角形曲面放置在构建板上。标记所有零件，单击鼠标右键，然后选择相乘所选模型。在提示的份数中输入一个，然后单击确定。将切片厚度设置为 0.1 毫米，壁厚设置为 1 毫米，填充密度设置为 40%，然后取消选中生成支撑框。单击切片按钮，然后选择“保存到可移动”以将打印文件保存到 USB 驱动器。保留设置，并在切片软件中将STL文件替换为收集器法兰和传单模板。在开始打印之前，使用复制工具创建法兰的一个副本和模板的八个副本。打印完成后，从构建板中取出模型。用线切割机小心地去除小叶底部的单个灯丝纤维，如果这些纤维存在于小叶模型中。要制备旋转溶液，请在排气罩下放置一个秤。在其上放置一个200毫升的螺旋盖玻璃瓶，然后去皮。将50毫升二甲基甲酰胺和50毫升四氢呋喃倒入玻璃瓶中。注意溶剂的重量。在瓶子内放置一个磁棒。将瓶子放在磁力搅拌器上并打开。将相应量的聚氨酯缓慢转移到含有溶剂混合物的玻璃瓶中，同时在室温下搅拌，得到均匀的溶液。然后，合上盖子。将3D打印零件与金属条组装在一起以创建收集器，并确保所有模板的方向正确。将组装好的集热器置于静电纺丝设置中，并将法兰紧紧地固定在电机轴上。使用鳄鱼夹，将连接到阴极的电缆连接到14号针，并检查夹子和针之间的连接。使用鳄鱼夹和第二根高压电缆将收集器连接到阳极。使用滑环或剥离电缆在收集器的法兰处形成接触。通过用20毫升纺丝溶液填充鲁尔锁定注射器来制备它。将注射器连接到耐溶剂管，并手动将溶液推入管路系统中，直到针尖处可见液滴。将注射器放入注射器泵中。打开泵后，将直径设置为19.129毫米，体积设置为5毫升，速度设置为每小时3毫升。要测试运行电机，请单击连接按钮连接到电机控件。连接后，选择剖面速度操作模式，然后单击位于屏幕左上角的操作选项卡。选择由红线框住的快速停止按钮下方的轮廓速度选项卡。然后将目标速度设置为200 RPM，轮廓加速度为100，轮廓减速为200，快速停止为5，000。开始测试运行并检查收集器是否存在任何不平衡。通过单击启用按钮上的开关停止电机，并将目标速度更改为 2， 000 RPM。要在电机控制软件中制造层，请单击启用操作按钮打开电机。打开高压电源，调整阳极和阴极的电压，负极为18千伏，正极为1.5千伏。以每小时三毫升的流速启动注射泵。观察针尖形成泰勒锥体，并根据针尖处锥体的形状，以100伏的增量调整阴极的电压，直到建立稳定的泰勒锥体。通过关闭电源装置，注射泵和电机来停止纺纱过程。然后在电机控制软件中将目标速度更改为10 RPM，并如前所述重复层制造过程20分钟。添加第二层后，小心地打开将收集器法兰连接到电机轴线的螺钉，并从静电纺丝装置中取出小叶收集器。使用手术刀，沿着每个传单模板的外轮廓切割电纺纤维。卸下收集器一侧的法兰。然后拉出3D打印的插入物，并将传单模板与非导电三角形支架分开。将所有传单模板旋转 90 度，然后重新组合收集器。将收集器插入静电纺丝装置并紧紧固定。同样，在电机控制软件中将目标速度更改回2， 000 RPM，并如前所述启动层制造过程20分钟以添加第三层光纤。从静电纺丝装置中取出收集器后，在加热柜中以40摄氏度干燥样品。样品完全干燥后，用手术刀沿着传单模板的边缘小心地切割，以除去多余的纤维。之后，小心地剥离模板的小叶支架并将其放在托盘上以备将来使用。三层小叶支架模仿人类天然心脏瓣膜的胶原构型，每层由直径约为4.1微米的纤维组成。扫描电子显微镜成像显示，在圆周方向上具有光滑表面和严格取向的对齐纤维，而未对齐的纤维表现出无序取向和纤维之间许多突出的交叉点。荧光成像显示，底层由水平方向的对齐纤维组成，纤维之间的交点很小。中间层显示没有初级纤维取向的未对齐纤维，而顶层显示垂直取向的对齐纤维。厚度测量显示厚度线性增加约每分钟2.65微米。60分钟后，观察到厚度每分钟增加约2.52微米。对齐纤维支架的拉伸试验沿圆周和垂直方向的强度约为每毫米平方12和3牛顿。然而，未对齐的纤维支架在不同方向下拉伸强度没有差异。对齐的纤维支架在圆周和垂直方向上显示出大约187%和107%的延伸性，而未对齐的纤维在两个方向上显示出均匀的延展性。应力应变曲线表明，未对准纤维毡表现出线性弹性行为，而对准纤维在轴向方向上表现出非线性。创建的传单可用于生物和生物力学评估。当其中三个组装成功能性主动脉瓣时，可以进行广泛的体外实验。该协议将使其他研究人员不仅能够制造多层纤维支架，还可以定向纤维。因此，它们将能够模仿许多不同类型的组织。

Research

JoVE Journal

Medicine

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医学

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