Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

يعترف مختبر Sidoli بامتنان بمؤسسة أبحاث سرطان الدم (منحة Hollis Brownstein New Investigator Research Grant) ، و AFAR (جائزة Sagol Network GerOmics) ، و Deerfield (جائزة Xseed ) ، و Relay Therapeutics ، و Merck ، ومكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (1S10OD030286-01).

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف
<ol><li>وسائط نمو الخلايا (لخلايا HepG2 / C3A): أضف مصل البقر الجنيني (FBS) (10٪ v / v) ، والأحماض الأمينية غير الأساسية (1٪ v / v) ، وملحق L-glutamine (1٪ v / v) والبنسلين / الستربتومايسين (0.5٪ v / v) إلى Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM ، الذي يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز). يتم تخزين وس?...

يختلف تحليل PTMs الهيستون اختلافا جوهريا عن خط أنابيب تحليل البروتينات النموذجي. معظم PTMs هيستون لا يزال لها وظائف بيولوجية غامضة. ونتيجة لذلك، لا تتوفر التعليقات التوضيحية مثل أنطولوجيا الجينات أو قواعد بيانات المسارات. توجد العديد من الموارد التي تربط تعديلات الهيستون بالإنزيم المسؤول ع?...

منذ أواخرالقرن 19 ، تم استخدام أنظمة زراعة الخلايا كنموذج لدراسة نمو وتطور الخلايا خارج جسم الإنسان 1,2. كما تم توسيع استخدامها لدراسة كيفية عمل الأنسجة والأعضاء في كل من السياقات الصحية والمريضة 1,3. تنمو الخلايا المعلقة (مثل خلايا الدم) في أطباق بتري أو قوارير بسلاسة وتبادل لأنها لا تتجمع في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. يمكن أن تنمو الخلايا المشتقة من الأعضاء الصلبة إما في أنظمة ثقافة ثنائية الأبعاد (2D) أو 3D. في ثقافة 2D ، تزرع الخلايا في طبقة أحادية تلتصق بسطح مستو 2,4. تتميز أنظمة زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد بالنمو الأسي ووقت المضاعفة السريع ، وعادة ما يكون 24 ساعة إلى بضعة أيام5. تنمو الخلايا في أنظمة 3D لتشكيل تفاعلات معقدة بين الخلايا الخلوية ونمذجة التكتلات الشبيهة بالأنسجة بشكل أوثق ، وتتميز بقدرتها على الوصول إلى توازن ديناميكي حيث يمكن أن يصل وقت مضاعفتها إلى 1 شهر أو أكثر5.
تقدم في هذه الورقة منهجية مبتكرة لزراعة كرويات ثلاثية الأبعاد في أنظمة زراعة الخلايا الدوارة التي تحاكي انخفاض الجاذبية6. هذا هو مشتق مبسط من نظام زراعة الخلايا التي قدمتها ناسا في 1990s7. يقلل هذا النهج من قوى القص ، التي تحدث في الطرق الحالية مثل قوارير الغزل ، ويزيد من قابلية التكاثر الكروي6. بالإضافة إلى ذلك ، يزيد المفاعل الحيوي الدوار من انتشار المغذيات النشط ، مما يقلل من تكوين الميت الذي يحدث في أنظمة مثل زراعة الخلايا المتساقطة المعلقة حيث يكون تبادل الوسائط غير عملي6. بهذه الطريقة ، تنمو الخلايا في الغالب دون عائق ، مما يسمح بتكوين الخصائص الهيكلية والفسيولوجية المرتبطة بالخلايا التي تنمو في الأنسجة. خلايا الكبد C3A (HepG2 / C3A) المستزرعة بهذه الطريقة لم يكن لديها عضيات فوق هيكلية فحسب ، بل أنتجت أيضا كميات من ATP و adenylate kinase و urea و cholesterol مماثلة للمستويات التي لوحظت في الجسم الحي 1,2. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الخلايا المزروعة في أنظمة زراعة الخلايا 2D مقابل .3D أنماط مختلفة للتعبير الجيني8. أظهر تحليل التعبير الجيني لخلايا الكبد C3A المزروعة على شكل كرويات ثلاثية الأبعاد أن هذه الخلايا عبرت عن مجموعة واسعة من البروتينات الخاصة بالكبد ، بالإضافة إلى الجينات المشاركة في المسارات الرئيسية التي تنظم وظائف الكبد8. أظهرت المنشورات السابقة الاختلافات بين بروتينات الخلايا التي تنمو بشكل كبير في ثقافة 2D مقابل الخلايا في التوازن الديناميكي في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد5. وتشمل هذه الاختلافات التمثيل الغذائي الخلوي ، والذي بدوره يؤثر على بنية ووظيفة وفسيولوجيا الخلية5. كان بروتين الخلايا المزروعة في ثقافة 2D أكثر ثراء في البروتينات المشاركة في تكرار الخلايا ، في حين أن بروتينات الكرويات ثلاثية الأبعاد كانت أكثر ثراء في وظائف الكبد5.
معدل النسخ المتماثل الأبطأ للخلايا المزروعة ككرويات 3D نماذج أكثر دقة لظواهر محددة مرتبطة بحالة الكروماتين والتعديلات (على سبيل المثال قص هيستون9). قص هيستون هو تعديل هيستون ما بعد الترجمة (PTM) لا رجعة فيه يسبب انقساما بروتينيا لجزء من ذيل هيستون N-terminal. في حين أن وظيفته البيولوجية لا تزال قيد المناقشة10،11،12،13 ، فمن الواضح أن وجوده في الخلايا الأولية وأنسجة الكبد تم تصميمه بواسطة خلايا HepG2 / C3A التي تنمو كروية ، ولكن ليس كخلايا مسطحة9. هذا أمر بالغ الأهمية ، حيث أن حالة الكروماتين والتعديلات تنظم قراءة الحمض النووي في الغالب عن طريق تعديل إمكانية الوصول إلى الجينات وبالتالي التعبير عنها14. تؤثر PTMs الهيستون إما على حالة الكروماتين بشكل مباشر من خلال التأثير على الشحنة الصافية للنيوكليوسومات حيث يتم تجميع الهيستونات ، أو بشكل غير مباشر عن طريق تجنيد كتاب الكروماتين والقراء والممحاة14. تم تحديد المئات من PTMs هيستون حتى الآن15 ، مما يعزز الفرضية القائلة بأن الكروماتين يستضيف "رمز هيستون" تستخدمه الخلية لتفسير الحمض النووي16. ومع ذلك ، فإن تحديد عدد لا يحصى من مجموعات PTM15 ، واكتشاف أن مجموعات من PTMs هيستون غالبا ما يكون لها وظائف بيولوجية مختلفة عن PTMs الموجودة في عزلة (مثل Fischle ، et al.17) ، يسلط الضوء على أن هناك حاجة إلى مزيد من العمل لفك تشفير "شفرة هيستون".
في الوقت الحالي ، يعتمد تحليل PTM للهيستون إما على تقنيات تستخدم الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، البقع الغربية ، أو التألق المناعي ، أو الترسيب المناعي للكروماتين متبوعا بالتسلسل [ChIP-seq]) أو قياس الطيف الكتلي (MS). تتمتع التقنيات القائمة على الأجسام المضادة بحساسية عالية ويمكن أن توفر معلومات مفصلة حول توطين علامات الهستون على نطاق الجينوم ولكنها غالبا ما تكون محدودة في دراسة PTMs النادرة أو PTMs الموجودة في مجموعات18،19،20. التصلب المتعدد هو أكثر ملاءمة لتحديد وقياس تعديلات البروتين المفردة والمتعايشة ذات الإنتاجية العالية وغير المتحيزة ، وخاصة بروتينات الهيستون18،19،20. لهذه الأسباب ، قام هذا المختبرات والعديد من المختبرات الأخرى بتحسين خط أنابيب MS لتحليل ببتيدات الهيستون (MS من أسفل إلى أعلى) ، وذيول الهيستون السليمة (MS من منتصف إلى أسفل) ، وبروتينات الهيستون كاملة الطول (MS من أعلى إلى أسفل) 21،22،23.
فيما يلي سير عمل لزراعة الكرويات HepG2 / C3A وإعدادها لتحليل ببتيد الهيستون (MS من أسفل إلى أعلى) عبر كروماتوغرافيا نانو سائلة ، مقترنة عبر الإنترنت بقياس الطيف الكتلي الترادف (NLC-MS / MS). نمت زراعة خلايا ثنائية الأبعاد وتم حصاد الخلايا ونقلها إلى مفاعل حيوي حيث ستبدأ في تكوين كرويات (الشكل 1). بعد 18 يوما في الثقافة، عولجت الكرويات ببوتيرات الصوديوم أو سكسينات الصوديوم لزيادة الوفرة النسبية لأسيتيلات الهيستون والسكسينيلات. والجدير بالذكر أن الثقافات 3D يمكن معالجتها بالمركبات السامة للوراثة تماما وكذلك نظيراتها من الثقافة المسطحة. في الواقع ، تسلط المنشورات الحديثة الضوء على أن استجابة علم السموم للخلايا في ثقافة 3D تشبه الأنسجة الأولية أكثر من تلك الموجودة في الثقافة المسطحة ثنائية الأبعاد24,25. ثم تم جمع الخلايا في نقاط زمنية محددة وتم إجراء العزل النووي. ثم تم استخراج الهيستونات واشتقاقها بأنهيدريد البروبيونيك قبل وبعد هضم التربسين وفقا لبروتوكول طوره غارسيا وآخرون لأول مرة.26. يولد هذا الإجراء ببتيدات ذات حجم مناسب للفصل عبر الإنترنت باستخدام كروماتوغرافيا الطور المعكوس (C18) والكشف عنها باستخدام MS. وأخيرا، تم تحديد ببتيدات الهيستون وتحديدها كميا، وتم تمثيل البيانات التي تم إنشاؤها بطرق متعددة من أجل تفسير بيولوجي أكثر اكتمالا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

تعتبر المزارع المسطحة لخلايا الثدييات نهجا يستخدم على نطاق واسع في المختبر لفهم فسيولوجيا الخلية ، ولكن هذا النظام محدود في نمذجة الأنسجة الصلبة بسبب تكاثر الخلايا السريع بشكل غير طبيعي. هذا أمر صعب بشكل خاص عند نمذجة الكروماتين الناضج ، حيث أن الخلايا سريعة التكرار تشارك في كثير من الأحيان في تكرار الحمض النووي ولها مجموعة متعددة الصبغيات غير متجانسة. فيما يلي سير عمل لنمذجة ومعالجة وتحليل تعديلات الكروماتين الهادئة باستخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد (3D). باستخدام هذا البروتوكول ، تزرع خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية ككرويات 3D قابلة للتكرار في حاضنة توفر انتشارا نشطا للمغذيات وقوى قص منخفضة. أدى العلاج ببوتيرات الصوديوم وسكسينات الصوديوم إلى زيادة في أسيتيلات الهيستون والسكسينيلات، على التوالي. ترتبط الزيادات في مستويات أسيتيلات الهيستون والسكسينيال بحالة كروماتين أكثر انفتاحا. ثم يتم جمع الكرويات لعزل نوى الخلايا، والتي يتم استخراج بروتينات الهيستون منها لتحليل تعديلاتها بعد الانتقالية. يتم إجراء تحليل Histone عبر الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادف عبر الإنترنت ، يليه خط أنابيب حسابي داخلي. وأخيرا ، يتم عرض أمثلة على تمثيل البيانات للتحقيق في تواتر وحدوث علامات الهستون التوافقية.

في هذا البروتوكول ، عولجت الكرويات HepG2 / C3A ب 20 mM Nabut و 10 mM NaSuc ، وكلاهما أثر على المستويات العالمية من PTMs الهيستون (الشكل 3A). ثم تم تحديد وقياس هيستون PTMs كميا على مستوى البقايا المفردة عن طريق اقتناء MS / MS (الشكل 3B).
عندما يتم تشغيل العينات في ن?...

Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد لنمذجة ومعالجة وتحليل تعديلات الكروماتين في حالة شبه فسيولوجية.

تحديد كمي على المستوى العالمي لتعديلات ما بعد الترجمة Histone في نموذج زراعة الخلايا 3D للأنسجة الكبدية

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

وقد ثبت أن ديناميكيات الكروماتين العالمية هي وسيط مهم للعديد من الحالات المرضية، مثل السرطان والشيخوخة. يوفر بروتوكولنا نموذجا ذا صلة فسيولوجية لدراسة هذه العملية. عادة ما يقتصر التحليل المختبري القياسي لتعديلات ما بعد الترجمة من هيستون أو PTMS على فحص PTM واحد في كل مرة باستخدام الفحوصات القائمة على الأجسام المضادة.يسمح لنا تحليل الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائل ل histone PTMS بقياس وفرة مئات PTMS في تجربة واحدة. وسيشارك في هذا الإجراء كل من ستيفاني سترانسكي ورونالد كاتلر وجولي كيم، وهي طالبة دراسات عليا في مرحلة ما بعد الدكتوراه وتكنولوجيا البحوث، على التوالي، من المختبر. أولا ، باستخدام وسائط النمو القياسية ، تنمو الخلايا كطبقة أحادية حتى تلتقي بنسبة 80٪.ثم اغسل الخلايا باستخدام HBSS. أضف خمسة ملليلترات من 0.05٪ من التربسين-EDTA المخفف في HBSS. احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.استخدم المجهر للتحقق من انفصال الخلايا. بعد حساب الخلايا ، قم بتخفيف تعليق الخلية باستخدام وسائط نمو جديدة. أضف 0.5 ملليلتر من وسائط النمو لتحقيق التوازن بين صفيحة سفلية مستديرة منخفضة للغاية من 24 بئرا مع العديد من الآبار الدقيقة في كل منها.ثم الطرد المركزي للألواح عند 3000 × g لإزالة فقاعات الهواء من سطح اللوحة. الآن انقل نظام التعليق الخلوي المصنوع مسبقا إلى لوحة 24 بئرا وأجهزة الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 120 × جم. تحقق من الخلايا الموجودة في الصفيحة المكونة من 24 بئرا ثم احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة لتشكيل كروي.وفي الوقت نفسه ، لتحقيق التوازن بين المفاعل الحيوي ، أضف 25 ملليلتر من الماء المعقم إلى غرفة الرطوبة وتسعة ملليلتر من وسائط النمو إلى غرفة الخلية. احتضان المفاعل الحيوي في حاضنة clinostat دوارة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. افصل الكرويات عن طبق 24 بئرا منخفض للغاية عن طريق السحب بلطف باستخدام أطراف تجويف واحدة عريضة ملليلتر ، وانقلها إلى طبق زراعة الأنسجة.لاختيار أشكال كروية بما فيه الكفاية ، تحقق من جودة الكرويات تحت المجهر. الكرويات ذات النوعية الجيدة لها حجم موحد ، والاكتناز ، والاستدارة. املأ المفاعل الحيوي المتوازن بخمسة ملليلترات من وسائط النمو الطازجة ، وانقل الكرويات إليه.ثم املأ المفاعل الحيوي بالكامل بوسائط نمو جديدة وضع المفاعل الحيوي في حاضنة clinostat عند 10 إلى 11 دورة في الدقيقة. كل يومين إلى ثلاثة أيام ، تبادل وسائط النمو عن طريق استبدال 10 ملليلتر من الوسائط القديمة بوسائط جديدة. مع زيادة حجم هذه الكروية وعددها ، قم بزيادة سرعة دوران الحاضنة.بعد الحصول على الكريات الكروية ، أضف خمسة مجلدات من حمض الكبريتيك المولي البارد 0.2 إلى الكريات وماصة لأعلى ولأسفل لتعطيل الكريات وإطلاق الهيستونات. بمجرد الحصول على المادة الفائقة بعد الطرد المركزي ، أضف حمض ثلاثي كلورو أسيتيك المركز البارد ، بحيث يصبح التركيز النهائي 25 إلى 30٪ من الحجم من حيث الحجم. ومزجها عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح في المخطوطة.بعد التخلص من السوبرناتانت ، باستخدام ماصة مراعي زجاجية ، اغسل الكريات وجدران الأنبوب بحوالي 500 ميكرولتر من الأسيتون البارد و 0.1٪ من حمض الهيدروكلوريك ، ثم جهاز طرد مركزي عند 3،400 × غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم اقلب الأنبوب للتخلص من السوبرناتانت. باستخدام ماصة المراعي الزجاجية ، أضف 500 ميكرولتر من الأسيتون البارد بنسبة 100٪ لغسل الكريات وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا.بعد التخلص من السوبرناتانت ، قم بإزالة الأسيتون تماما عن طريق السحب بعناية ، واترك العينة تجف بغطاء مفتوح لمدة 20 دقيقة تقريبا. أعد تعليق الكريات في 20 ميكرولتر من 15 إلى 20٪ من الأسيتونيتريل في بيكربونات الأمونيوم 100 مللي مول من الرقم الهيدروجيني 8. بعد الدوامة ، قم بتدوير التعليق عند 1000 × g لمدة 30 ثانية.بالنسبة لثماني عينات أو أكثر، انقل كل عينة معلقة إلى صفيحة من 96 بئرا. ثم ، في غطاء محرك السيارة ، أضف ميكرولترين من أنهيدريد البروبيونيك واخلطه عن طريق السحب خمس مرات. أضف بسرعة 10 ميكرولترات من هيدروكسيد الأمونيوم واخلطها عن طريق السحب خمس مرات.امزج راتنج HLB على لوحة تحريك مغناطيسية. ثم أضف 70 ميكرولتر من نظام تعليق HLB إلى كل بئر من لوحة مرشح 96 بئرا على لوحة تجميع 96 بئرا. بعد التخلص من التدفق ، اغسل الراتنج ب 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪.بعد تعليق كل عينة في 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪ ، قم بتحميل كل عينة في كل بئر ومنع الرش باستخدام فراغ. بعد التخلص من التدفق ، اغسل العينات ب 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪ ، وضع لوحة المرشح على لوحة تجميع جديدة. بعد ذلك ، أضف 60 ميكرولتر من 60٪ من الأسيتونيتريل في 0.1٪ من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك إلى كل بئر ومنع الرش باستخدام الفراغ.جمع التدفق من خلال وتجفيفها في فراغ السرعة. قم بتحميل لوحة التجميع المجففة في HPLC وقم بتشغيل طريقة LC / MS / MS كما هو موضح في المخطوطة. في هذه الدراسة ، لوحظت الوفرة النسبية لتعديلات الهيستون الشائعة بعد الترجمة في خلايا الكبد C3A المزروعة كروية ثلاثية الأبعاد.يمكن أيضا ملاحظة تعديلات ما بعد الترجمة على بقايا واحدة في الببتيدات المتولدة من بروتينات الهيستون. زادت معالجة الكرويات ببوتيرات الصوديوم من الوفرة النسبية لأسيتيلات الهيستون ، في حين أن ذلك مع سكسينات الصوديوم عزز سكسينيلات بقايا الهيستون. أظهرت الطريقة أيضا نمط توزيع أسيتيلات الهيستون بعد معالجة بوتيرات الصوديوم ونمط سكسينيلات الهيستون بعد العلاج بسكسينات الصوديوم.أظهرت النتيجة أيضا أنماطا شائعة لتعديلات هيستون مختلفة. عززت معالجات بوتيرات الصوديوم بشكل كبير من أسيتيلات بقايا الليسين 14 على الببتيد المتولد من بروتين الهيستون H3 ، فقط عندما كانت بقايا الليسين التاسعة تحتوي على مجموعتين من الميثيل ، ولكن ليس مجموعة واحدة أو ثلاث مجموعات ميثيل. كما تم حساب الوفرة النسبية للتعديلات الفردية ومجموعات مختلفة من التعديلات اللاحقة للترجمة في الببتيد المشتق من H3.كما لوحظت أنماط توافقية من التعديلات اللاحقة للترجمة بعد معالجة بوتيرات الصوديوم في الببتيد المتولد من بروتين الهيستون H4. هنا أيضا ، أدى علاج بوتيرات الصوديوم إلى زيادة كبيرة في الأسيتيلات. يجب إيلاء اهتمام حاسم للحفاظ على الكرويات على مقاعد البدلاء بأقل قدر ممكن وفي خطوة تحلية لتجنب انسكاب العينات. يمكن استخدام سير العمل هذا لاستكشاف الكروماتين في الأنسجة الصلبة باستخدام نموذج فسيولوجي أكثر من التكرار السريع لمزارع الخلايا المسطحة.

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning السقالات بوليمر الليفية للهندسة الأنسجة والخلايا الثقافة

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

نموذج زراعة الأنسجة Granulosa البقري الأولية المنتجة للاستروجين خلايا

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...