Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Sidoli-laboratoriet anerkender taknemmeligt Leukæmi Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics-prisen), Deerfield (Xseed-prisen), Relay Therapeutics, Merck og NIH-kontoret for direktøren (1S10OD030286-01).

1. Fremstilling af buffere og reagenser
<ol><li>Cellevækstmedier (for HepG2/C3A-celler): Tilsæt føtalt kvægserum (FBS) (10% v/v), ikke-essentielle aminosyrer (1% v/v), L-glutamintilskud (1% v/v) og penicillin/streptomycin (0,5% v/v) til Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM, indeholdende 4,5 g/l glucose). Vækstmedier opbevares ved 4 °C i højst 2 uger.</li>
	<li>200 mM natriumbutyrat (NaBut) opløsning: Til fremstilling af 10 ml skal du resuspend 220,18 mg NaBut i 10 mlddH20. Opbeva...

Analysen af histon PTM'er er fundamentalt forskellig fra den typiske proteomics-analysepipeline. De fleste histon PTM'er har stadig gådefulde biologiske funktioner; som følge heraf er kommentarer såsom gen ontologi eller pathway databaser ikke tilgængelige. Der findes flere ressourcer, der forbinder histonmodifikationer med enzymet, der er ansvarligt for deres katalyse eller proteiner, der indeholder domæner, der binder disse PTM'er (f.eks. HISTome36). Det er også muligt at spekulere i kroma...

Siden slutningen af det 19. århundrede er cellekultursystemer blevet brugt som model til at studere vækst og udvikling af celler uden for menneskekroppen 1,2. Deres anvendelse er også blevet udvidet til at undersøge, hvordan væv og organer fungerer i både sunde og syge sammenhænge 1,3. Suspensionsceller (f.eks. blodlegemer) vokser i petriskåle eller kolber problemfrit og i flæng, da de ikke samles i tredimensionelle (3D) strukturer in vivo. Celler afledt af faste organer kan vokse i enten todimensionelle (2D) eller 3D-kultursystemer. I 2D-kultur dyrkes celler i et monolag, der klæber til en flad overflade 2,4. 2D-cellekultursystemer er kendetegnet ved eksponentiel vækst og en hurtig fordoblingstid, typisk 24 timer til et par dage5. Celler i 3D-systemer vokser til at danne indviklede celle-celle-interaktioner, der modellerer vævslignende konglomerater tættere, og de er kendetegnet ved deres evne til at nå en dynamisk ligevægt, hvor deres fordoblingstid kan nå 1 måned eller længere5.
Præsenteret i dette papir er en innovativ metode til at dyrke 3D-sfæroider i roterende cellekultursystemer, der simulerer reduceret tyngdekraft6. Dette er et forenklet derivat af et cellekultursystem introduceret af NASA i 1990'erne7. Denne fremgangsmåde minimerer forskydningskræfterne, som forekommer i eksisterende metoder som spindekolber, og øger sfæroidreproducerbarheden6. Derudover øger den roterende bioreaktor aktiv næringsdiffusion, hvilket minimerer nekrotisk dannelse, der forekommer i systemer som hængende dråbecellekultur, hvor medieudveksling er upraktisk6. På denne måde vokser cellerne for det meste uforstyrret, hvilket muliggør dannelse af strukturelle og fysiologiske egenskaber forbundet med celler, der vokser i væv. C3A-hepatocytter (HepG2 / C3A) dyrket på denne måde havde ikke kun ultrastrukturelle organeller, men producerede også mængder ATP, adenylatkinase, urinstof og kolesterol, der kunne sammenlignes med niveauer observeret in vivo 1,2. Derudover udviser celler dyrket i 2D vs.3D cellekultursystemer forskellige genekspressionsmønstre8. Genekspressionsanalyse af C3A-hepatocytter dyrket som 3D-sfæroider viste, at disse celler udtrykte en bred vifte af leverspecifikke proteiner såvel som gener involveret i nøgleveje, der regulerer leverfunktion8. Tidligere publikationer viste forskellene mellem proteomer af eksponentielt voksende celler i 2D-kultur vs. celler ved dynamisk ligevægt i 3D-sfæroidkulturer5. Disse forskelle omfatter cellulær metabolisme, som igen påvirker strukturen, funktionen og fysiologien af cellen5. Proteomet af celler dyrket i 2D-kultur var mere beriget i proteiner involveret i cellereplikation, mens proteomet af 3D-sfæroider var mere beriget i leverfunktionalitet5.
Den langsommere replikationshastighed for celler, der dyrkes som 3D-sfæroider, modellerer mere præcist specifikke fænomener forbundet med kromatintilstand og modifikationer (f.eks.Histonklipning 9). Histonklipning er en irreversibel histon post-translationel modifikation (PTM), der forårsager proteolytisk spaltning af en del af histon N-terminal halen. Mens dens biologiske funktion stadig diskuteres 10,11,12,13, er det klart, at dets tilstedeværelse i primære celler og levervæv er modelleret af HepG2 / C3A-celler dyrket som sfæroider, men ikke som flade celler 9. Dette er kritisk, da kromatintilstand og modifikationer regulerer DNA-udlæsning for det meste ved at modulere tilgængeligheden til gener og dermed deresekspression 14. Histon PTM'er påvirker enten kromatintilstanden direkte ved at påvirke nettoladningen af nukleosomerne, hvor histoner samles, eller indirekte ved at rekruttere kromatinforfattere, læsere og viskelædere14. Hundredvis af histon PTM'er er blevet identificeret til dato15, hvilket forstærker hypotesen om, at kromatin er vært for en "histonkode", der bruges af cellen til at fortolke DNA16. Identifikationen af et utal af PTM-kombinationer15 og opdagelsen af, at kombinationer af histon-PTM'er ofte har forskellige biologiske funktioner fra PTM'er, der er til stede isoleret (f.eks. Fischle, et al.17), understreger imidlertid, at der kræves mere arbejde for at dekryptere "histonkoden".
I øjeblikket er histon PTM-analyse enten baseret på teknikker, der anvender antistoffer (f.eks. Western blots, immunofluorescens eller kromatinimmunfældning efterfulgt af sekventering [ChIP-seq]) eller massespektrometri (MS). Antistofbaserede teknikker har høj følsomhed og kan give detaljerede oplysninger om den genom-brede lokalisering af histonmærker, men er ofte begrænset til at studere sjældne PTM'er eller PTM'er til stede i kombinationer 18,19,20. MS er mere velegnet til høj gennemstrømning og upartisk identifikation og kvantificering af enkelt- og sameksekserende proteinmodifikationer, navnlig histonproteiner 18,19,20. Af disse grunde har dette og flere andre laboratorier optimeret MS-rørledningen til analyse af histonpeptider (bottom-up MS), intakte histonhaler (mid-down MS) og histonproteiner i fuld længde (top-down MS)21,22,23.
Detaljeret nedenfor er en arbejdsgang til dyrkning af HepG2 / C3A-sfæroider og forberedelse af dem til histonpeptidanalyse (bottom-up MS) via nano-væskekromatografi kombineret online med tandemmassespektrometri (nLC-MS / MS). En 2D-cellekultur blev dyrket, og cellerne blev høstet og overført til en bioreaktor, hvor de ville begynde at danne sfæroider (figur 1). Efter 18 dage i kultur blev sfæroider behandlet med natriumsmolyrat eller natriumsuccinat for at øge de relative mængder histonacetylering og kortfattethed. Især kan 3D-kulturer behandles med genotoksiske forbindelser lige så godt som deres flade kulturækvivalenter; Faktisk fremhæver nylige publikationer, at toksikologiresponsen fra celler i 3D-kultur ligner mere primært væv end dem i 2D flad kultur24,25. Celler blev derefter indsamlet på bestemte tidspunkter, og nuklear isolering blev udført. Derefter blev histoner ekstraheret og afledt med propionisk anhydrid før og efter trypsinfordøjelse i henhold til en protokol, der først blev udviklet af Garcia et al.26. Denne procedure genererer peptider af en passende størrelse til online adskillelse med omvendt fasekromatografi (C18) og detektion med MS. Endelig blev histonpeptider identificeret og kvantificeret, og de genererede data blev repræsenteret på flere måder for en mere fuldstændig biologisk fortolkning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

Flade kulturer af pattedyrceller er en meget anvendt in vitro-tilgang til forståelse af cellefysiologi, men dette system er begrænset til modellering af fast væv på grund af unaturligt hurtig cellereplikation. Dette er især udfordrende ved modellering af modent kromatin, da hurtigt replikerende celler ofte er involveret i DNA-replikation og har en heterogen polyploid population. Præsenteret nedenfor er en arbejdsgang til modellering, behandling og analyse af quiescent kromatinmodifikationer ved hjælp af et tredimensionelt (3D) cellekultursystem. Ved hjælp af denne protokol dyrkes hepatocellulære carcinomcellelinjer som reproducerbare 3D-sfæroider i en inkubator, der giver aktiv næringsdiffusion og lave forskydningskræfter. Behandling med natriumsmoyrat og natriumsuccinat inducerede en stigning i henholdsvis histonacetylering og succinylering. Stigninger i niveauer af histonacetylering og succinylering er forbundet med en mere åben kromatintilstand. Sfæroider indsamles derefter til isolering af cellekerner, hvorfra histonproteiner ekstraheres til analyse af deres posttranslationelle modifikationer. Histonanalyse udføres via væskekromatografi kombineret online med tandemmassespektrometri efterfulgt af en intern beregningsrørledning. Endelig vises eksempler på datarepræsentation for at undersøge hyppigheden og forekomsten af kombinatoriske histonmærker.

I denne protokol blev HepG2/C3A-sfæroider behandlet med 20 mM NaBut og 10 mM NaSuc, som begge påvirkede globale niveauer af histon-PTM'er (figur 3A). Histon PTM'er blev derefter identificeret og kvantificeret på niveauet for enkeltrestkoncentrationer via MS/MS-erhvervelse (figur 3B).
Når prøver køres i replikater, kan statistisk analyse udføres for at vurdere foldændringsberigelsen af en PTM mellem prøver samt reprod...

Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Denne protokol skitserer, hvordan et tredimensionelt cellekultursystem kan bruges til at modellere, behandle og analysere kromatinmodifikationer i en næsten fysiologisk tilstand.

Global niveau kvantificering af histon post-translationelle modifikationer i en 3D-cellekulturmodel af levervæv

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Global kromatindynamik har vist sig at være en vigtig mediator af flere sygdomstilstande, såsom kræft og aldring. Vores protokol giver en fysiologisk relevant model til at studere denne proces. Standard laboratorieanalyse af histon post-translationelle modifikationer eller PTMS er normalt begrænset til at undersøge for en enkelt PTM ad gangen ved hjælp af antistofbaserede assays.Væskekromatografi massespektrometri analyse af histon PTMS giver os mulighed for at måle overflod af hundredvis af PTMS i et enkelt eksperiment. Stephanie Stransky, Ronald Cutler og Julie Kim, henholdsvis postdoc, kandidatstuderende og forskningsteknologi fra laboratoriet, demonstrerer proceduren. For det første skal du ved hjælp af standard vækstmedier dyrke cellerne som et monolag, indtil de er 80% sammenflydende.Vask derefter cellerne med HBSS. Tilsæt fem milliliter 0,05% trypsin-EDTA fortyndet i HBSS. Inkuber cellerne i fem minutter ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Brug et mikroskop til at kontrollere celleløsning. Efter tælling af cellerne fortyndes cellesuspensionen med friske vækstmedier. Tilsæt 0,5 ml vækstmedier for at udligne en ultra lav fastgørelse 24-brønds rund bundplade med flere mikrobrønde i hver.Centrifuger derefter pladerne ved 3000 x g for at fjerne luftbobler fra pladens overflade. Overfør nu den tidligere fremstillede cellesuspension til 24-brøndspladen og centrifugen i tre minutter ved 120 x g. Kontroller cellerne i pladen med 24 brønde, og inkuber derefter pladerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 24 timer for sfæroiddannelse.I mellemtiden, for at udligne bioreaktoren, tilsættes 25 ml sterilt vand til fugtighedskammeret og ni milliliter vækstmedier til cellekammeret. Inkuber bioreaktoren i en roterende clinostat inkubator i 24 timer ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Fjern sfæroiderne fra den ultra lave fastgørelse 24-brønds plade ved forsigtigt pipettering ved hjælp af en milliliter brede borespidser, og overfør dem til en vævskulturskål.For at vælge tilstrækkeligt danner sfæroider, kontroller kvaliteten af sfæroider under et mikroskop. Sfæroider af god kvalitet har ensartet størrelse, kompaktitet og rundhed. Fyld den ligevægtede bioreaktor med fem milliliter friske vækstmedier, og overfør sfæroiderne ind i den.Fyld derefter bioreaktoren helt med friske vækstmedier og sæt bioreaktoren i clinostatinkubatoren ved 10 til 11 o / min. Hver anden til tredje dag udveksler vækstmedier ved at erstatte 10 milliliter gamle medier med friske medier. Da disse sfæroider stiger i størrelse og antal, øges inkubatorens rotationshastighed.Efter opnåelse af sfæroidpillen tilsættes fem volumener kold 0,2 molær svovlsyre til pelleten og pipetten op og ned for at forstyrre pelleten og frigive histoner. Når supernatanten er opnået efter centrifugering, tilsættes koldkoncentreret trichloreddikesyre, således at den endelige koncentration bliver 25 til 30 volumenprocent volumen. Og bland det ved at vende røret et par gange og centrifuge som beskrevet i manuskriptet.Efter kassering af supernatanten, ved hjælp af en glasgræspipette, vaskes pelleten og rørets vægge med ca. 500 mikroliter kold acetone og 0,1% saltsyre og centrifugerer derefter ved 3.400 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Vend derefter røret for at kassere supernatanten. Brug en glasgræspipette til at tilføje 500 mikroliter 100% kold acetone for at vaske pellet og centrifuge som tidligere påvist.Efter kassering af supernatanten fjernes acetonen helt ved pipettering forsigtigt, og lad prøven tørre med et åbent låg i ca. 20 minutter. Resuspend pelleten i 20 mikroliter af 15 til 20% acetonitril i et 100 millimolært ammoniumbicarbonat af pH 8. Efter hvirvelstrømning drejes suspensionen ned ved 1000 x g i 30 sekunder.For otte eller flere prøver overføres hver re-suspenderet prøve til en plade med 96 brønde. Derefter tilsættes to mikroliter propionsyreanhydrid i en hætte og blandes ved pipettering fem gange. Tilsæt hurtigt 10 mikroliter ammoniumhydroxid og bland ved pipettering fem gange.Bland HLB-harpiks på en magnetisk omrøringsplade. Tilsæt derefter 70 mikroliter HLB-suspensionen til hver brønd i en 96-brønds filterplade på en 96-brønds opsamlingsplade. Efter at have kasseret gennemstrømningen, vaskes harpiksen med 100 mikroliter 0,1% trifluoreddikesyre.Efter genoplivning af hver prøve i 100 mikroliter 0,1 % trifluoreddikesyre skal hver prøve fyldes i hver brønd og forhindre stænk ved hjælp af et vakuum. Efter at have kasseret gennemstrømningen vaskes prøverne med 100 mikroliter 0,1 % trifluoreddikesyre, og filterpladen anbringes på en ny opsamlingsplade. Derefter tilsættes 60 mikroliter 60% acetonitril i 0,1% trifluoreddikesyre til hver brønd og forhindrer stænk ved hjælp af vakuum.Saml strømmen igennem og tør i et hastighedsvakuum. Læg den tørrede opsamlingsplade i HPLC'en, og kør LC/MS/MS-metoden som beskrevet i manuskriptet. I denne undersøgelse blev den relative overflod af almindelige histon post-translationelle modifikationer observeret i C3A-hepatocytter dyrket som tredimensionelle sfæroider.Post-translationelle modifikationer kunne også observeres på en enkelt rest i peptider genereret fra histonproteiner. Behandling af sfæroiderne med natriumsmoyrat øgede den relative overflod af histonacetylering, mens det med natriumsuccinat forbedrede histonresten succinylering. Metoden viste også fordelingsmønsteret for histonacetylering efter natriumsmørbehandling og for histonsuccinylering efter behandling med natriumsuccinat.Resultatet viste også fælles mønstre af forskellige histonmodifikationer. Natriumbutyratbehandlinger forbedrede signifikant acetyleringen af lysinresten 14 på et peptid genereret fra histonproteinet H3, kun når dets niende lysinrest havde to methylgrupper, men ikke en eller tre methylgrupper. De relative mængder af individuelle modifikationer og forskellige kombinationer af posttranslationelle modifikationer i det H3-afledte peptid blev også beregnet.Kombinatoriske mønstre af post-translationelle modifikationer efter natriumsmørbehandling blev også observeret i et peptid genereret fra histonprotein H4. Også her resulterede natriumsmoyratbehandling i en signifikant stigning i acetylering. Der bør lægges kritisk vægt på at holde sfæroiderne på bænken så lidt som muligt og i et afsaltningstrin for at undgå prøvespild. Denne arbejdsgang kan bruges til at udforske kromatin i fast væv ved hjælp af en mere fysiologisk model end hurtigt replikerende flade cellekulturer.

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirende Gær Protein ekstraktion og oprensning for Studiet af Function, Interactions og post-translationelle modifikationer

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifikation af post-translationelle modifikationer til planteprotein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse af Global RNA-syntese på enkelt celle niveau efter Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantificering af krystallinsk cellulose Ophobning i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots til Monitor Tissue-specifikke Cell Wall Ændringer

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplet Workflow for Analyse af Histon post-translationelle modifikationer Brug Bottom-up-massespektrometri: Fra Histon Extraction til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vævskultur Model af østrogen-producerende primære Bovine Granulosa-celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...