Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Het Sidoli-lab erkent dankbaar de Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck en het NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

1. Bereiding van buffers en reagentia
<ol><li>Celgroeimedia (voor HepG2/C3A-cellen): Voeg foetaal runderserum (FBS) (10% v/v), niet-essentiële aminozuren (1% v/v), L-glutaminesupplement (1% v/v) en penicilline/streptomycine (0,5% v/v) toe aan Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, met 4,5 g/L glucose). Groeimedia worden maximaal 2 weken bewaard bij 4 °C.</li>
	<li>200 mM natriumbutyraat (NaBut) oplossing: Om 10 ml te bereiden, resuspend 220,18 mg NaBut in 10 ml ddH2O. Bewaar 1 ml aliquo...

De analyse van histon PTM's is fundamenteel anders dan de typische proteomics analyse pijplijn. De meeste histon PTM's hebben nog steeds raadselachtige biologische functies; als gevolg hiervan zijn annotaties zoals Gene Ontology of pathway-databases niet beschikbaar. Er bestaan verschillende bronnen die histonmodificaties associëren met het enzym dat verantwoordelijk is voor hun katalyse of eiwitten die domeinen bevatten die deze PTM's binden (bijv. HISTome36). Ook is het mogelijk om te speculere...

Sinds het einde van de19e eeuw worden celkweeksystemen gebruikt als model om de groei en ontwikkeling van cellen buiten het menselijk lichaam te bestuderen 1,2. Het gebruik ervan is ook uitgebreid om te bestuderen hoe weefsels en organen functioneren in zowel gezonde als zieke contexten 1,3. Suspensiecellen (bijv. bloedcellen) groeien naadloos en uitwisselbaar in petrischalen of kolven omdat ze niet in vivo in driedimensionale (3D) structuren samenkomen. Cellen afgeleid van vaste organen kunnen groeien in tweedimensionale (2D) of 3D-kweeksystemen. In 2D-kweek worden cellen gekweekt in een monolaag die zich hecht aan een plat oppervlak 2,4. 2D-celkweeksystemen worden gekenmerkt door exponentiële groei en een snelle verdubbelingstijd, meestal 24 uur tot enkele dagen5. Cellen in 3D-systemen groeien om ingewikkelde cel-celinteracties te vormen die weefselachtige conglomeraten nauwer modelleren, en ze worden gekenmerkt door hun vermogen om een dynamisch evenwicht te bereiken waarbij hun verdubbelingstijd 1 maand of langer kan bereiken5.
In dit artikel wordt een innovatieve methodologie gepresenteerd om 3D-sferoïden te laten groeien in roterende celkweeksystemen die verminderde zwaartekracht simuleren6. Dit is een vereenvoudigde afgeleide van een celkweeksysteem geïntroduceerd door NASA in de jaren 19907. Deze aanpak minimaliseert schuifkrachten, die optreden in bestaande methoden zoals draaiende kolven, en verhoogt de reproduceerbaarheid van sferoïden6. Bovendien verhoogt de roterende bioreactor de actieve nutriëntendiffusie, waardoor necrotische vorming wordt geminimaliseerd die optreedt in systemen zoals hangende druppelcelkweek waar media-uitwisseling onpraktisch is6. Op deze manier groeien cellen meestal ongestoord, waardoor structurele en fysiologische kenmerken kunnen worden gevormd die verband houden met cellen die in weefsel groeien. C3A-hepatocyten (HepG2/C3A) die op deze manier werden gekweekt, hadden niet alleen ultrastructurele organellen, maar produceerden ook hoeveelheden ATP, adenylaatkinase, ureum en cholesterol die vergelijkbaar waren met de in vivo waargenomen niveaus 1,2. Bovendien vertonen cellen gekweekt in 2D vs.3D celkweeksystemen verschillende genexpressiepatronen8. Genexpressieanalyse van C3A-hepatocyten gekweekt als 3D-sferoïden toonde aan dat deze cellen een breed scala aan leverspecifieke eiwitten tot expressie brachten, evenals genen die betrokken zijn bij belangrijke routes die de leverfunctie reguleren8. Eerdere publicaties toonden de verschillen aan tussen proteomen van exponentieel groeiende cellen in 2D-cultuur versus cellen bij dynamisch evenwicht in 3D-sferoïde culturen5. Deze verschillen omvatten cellulair metabolisme, dat op zijn beurt de structuur, functie en fysiologie van de cel5 beïnvloedt. Het proteoom van cellen gekweekt in 2D-cultuur was meer verrijkt met eiwitten die betrokken zijn bij celreplicatie, terwijl het proteoom van 3D-sferoïden meer verrijkt was in leverfunctionaliteit5.
De langzamere replicatiesnelheid van cellen die groeien naarmate 3D-sferoïden nauwkeuriger modelleren specifieke verschijnselen die verband houden met de chromatinetoestand en modificaties (bijv. Histon clipping9). Histon clipping is een onomkeerbare histon post-translationele modificatie (PTM) die proteolytische splitsing van een deel van de histon N-terminale staart veroorzaakt. Hoewel de biologische functie nog steeds ter discussie staat 10,11,12,13, is het duidelijk dat de aanwezigheid ervan in primaire cellen en leverweefsel wordt gemodelleerd door HepG2 / C3A-cellen gekweekt als sferoïden, maar niet als platte cellen 9. Dit is van cruciaal belang, omdat chromatinetoestand en modificaties de DNA-uitlezing meestal reguleren door de toegankelijkheid van genen en dus hun expressie te moduleren14. Histon PTM's beïnvloeden ofwel de chromatinetoestand direct door de netto lading van de nucleosomen te beïnvloeden waar histonen worden geassembleerd, of indirect door chromatineschrijvers, lezers en gummente werven 14. Honderden histon PTM's zijn geïdentificeerd tot op heden15, wat de hypothese versterkt dat chromatine een "histoncode" herbergt die door de cel wordt gebruikt om DNA16 te interpreteren. De identificatie van een groot aantal PTM-combinaties15 en de ontdekking dat combinaties van histon-PTM's vaak verschillende biologische functies hebben dan PTM's die geïsoleerd aanwezig zijn (bijv. Fischle, et al.17), benadrukt echter dat er meer werk nodig is om de "histoncode" te decoderen.
Momenteel is histon PTM-analyse gebaseerd op technieken die antilichamen gebruiken (bijv. Western blots, immunofluorescentie of chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing [ChIP-seq]) of massaspectrometrie (MS). Op antilichamen gebaseerde technieken hebben een hoge gevoeligheid en kunnen gedetailleerde informatie verschaffen over de genoombrede lokalisatie van histonmarkeringen, maar zijn vaak beperkt in het bestuderen van zeldzame PTM's of PTM's die aanwezig zijn in combinaties 18,19,20. MS is meer geschikt voor high-throughput en onbevooroordeelde identificatie en kwantificering van enkelvoudige en naast elkaar bestaande eiwitmodificaties, met name histoneiwitten 18,19,20. Om deze redenen hebben deze en verschillende andere laboratoria de MS-pijplijn geoptimaliseerd voor de analyse van histonpeptiden (bottom-up MS), intacte histonstaarten (middle-down MS) en histoneiwitten over de volledige lengte (top-down MS)21,22,23.
Hieronder wordt een workflow beschreven voor het kweken van HepG2 / C3A-sferoïden en het voorbereiden ervan op histonpeptide-analyse (bottom-up MS) via nano-vloeistofchromatografie, online gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie (nLC-MS / MS). Er werd een 2D-celkweek gekweekt en de cellen werden geoogst en overgebracht naar een bioreactor waar ze sferoïden zouden gaan vormen (figuur 1). Na 18 dagen in cultuur werden sferoïden behandeld met natriumbutyraat of natriumsuccinaat om de relatieve abundanties van histonacetylering en succinylering te verhogen. Met name 3D-culturen kunnen net zo goed worden behandeld met genotoxische verbindingen als hun platte cultuurequivalenten; recente publicaties benadrukken zelfs dat de toxicologische respons van cellen in 3D-cultuur meer lijkt op primaire weefsels dan die in 2D-platte cultuur24,25. Cellen werden vervolgens verzameld op bepaalde tijdstippen en nucleaire isolatie werd uitgevoerd. Vervolgens werden histonen geëxtraheerd en gederivatiseerd met propionisch anhydride voor en na trypsinevertering volgens een protocol dat voor het eerst werd ontwikkeld door Garcia et al.26. Deze procedure genereert peptiden van een geschikte grootte voor online scheiding met omgekeerde fase chromatografie (C18) en detectie met MS. Ten slotte werden histonpeptiden geïdentificeerd en gekwantificeerd en werden de gegenereerde gegevens op meerdere manieren weergegeven voor een meer complete biologische interpretatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

Platte culturen van zoogdiercellen zijn een veel gebruikte in vitro benadering voor het begrijpen van celfysiologie, maar dit systeem is beperkt in het modelleren van vaste weefsels als gevolg van onnatuurlijk snelle celreplicatie. Dit is vooral een uitdaging bij het modelleren van volwassen chromatine, omdat snel replicerende cellen vaak betrokken zijn bij DNA-replicatie en een heterogene polyploïde populatie hebben. Hieronder wordt een workflow gepresenteerd voor het modelleren, behandelen en analyseren van rustige chromatinemodificaties met behulp van een driedimensionaal (3D) celkweeksysteem. Met behulp van dit protocol worden hepatocellulaire carcinoomcellijnen gekweekt als reproduceerbare 3D-sferoïden in een incubator die actieve nutriëntendiffusie en lage schuifkrachten bieden. Behandeling met natriumbutyraat en natriumsuccinaat veroorzaakte respectievelijk een toename van histonacetylering en succinylering. Verhogingen van de niveaus van histonacetylering en succinylering zijn geassocieerd met een meer open chromatinetoestand. Sferoïden worden vervolgens verzameld voor isolatie van celkernen, waaruit histoneiwitten worden geëxtraheerd voor de analyse van hun posttranslationele modificaties. Histonanalyse wordt uitgevoerd via vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie, gevolgd door een interne computationele pijplijn. Ten slotte worden voorbeelden van gegevensrepresentatie getoond om de frequentie en het voorkomen van combinatorische histonmarkeringen te onderzoeken.

In dit protocol werden HepG2/C3A-sferoïden behandeld met 20 mM NaBut en 10 mM NaSuc, die beide de wereldwijde niveaus van histon-PTM's beïnvloedden (figuur 3A). Histon PTM's werden vervolgens geïdentificeerd en gekwantificeerd op het niveau van één residu via MS/MS-acquisitie (figuur 3B).
Wanneer monsters in replicaties worden uitgevoerd, kan statistische analyse worden uitgevoerd om de vouwveranderingsverrijking van een...

Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Dit protocol schetst hoe een driedimensionaal celkweeksysteem kan worden gebruikt om chromatinemodificaties in een bijna fysiologische toestand te modelleren, behandelen en analyseren.

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Van de wereldwijde chromatinedynamiek is aangetoond dat het een belangrijke bemiddelaar is van verschillende ziektetoestanden, zoals kanker en veroudering. Ons protocol biedt een fysiologisch relevant model om dit proces te bestuderen. Standaard laboratoriumanalyse van histon posttranslationele modificaties of PTMS is meestal beperkt tot het onderzoeken van een enkele PTM per keer met behulp van op antilichamen gebaseerde assays.Vloeistofchromatografie massaspectrometrie analyse van histon PTMS stelt ons in staat om de overvloed van honderden PTMS in een enkel experiment te meten. Stephanie Stransky, Ronald Cutler en Julie Kim, respectievelijk een postdoc, grad student en onderzoekstechnologie van het lab, demonstreren de procedure. Eerst, met behulp van standaard groeimedia, groeien de cellen als een monolaag totdat ze 80% confluent zijn.Was vervolgens de cellen met HBSS. Voeg vijf milliliter van 0,05% trypsine-EDTA verdund in HBSS toe. Incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Gebruik een microscoop om de loslating van cellen te controleren. Na het tellen van de cellen, verdun de celsuspensie met verse groeimedia. Voeg 0,5 milliliter groeimedia toe om een ultralaag opzetstuk van 24-putjes met meerdere microputten in elk in evenwicht te brengen.Centrifugeer vervolgens de platen bij 3000 x g om luchtbellen van het oppervlak van de plaat te verwijderen. Breng nu de eerder gemaakte celsuspensie over op de 24-wells plaat en centrifugeer gedurende drie minuten bij 120 x g. Controleer de cellen in de 24-well plaat en incubeer vervolgens de platen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur op sferoïde vorming.Voeg ondertussen, om de bioreactor in evenwicht te brengen, 25 milliliter steriel water toe aan de vochtigheidskamer en negen milliliter groeimedia aan de celkamer. Incubeer de bioreactor in een roterende clinostat incubator gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Maak de sferoïden los van de ultralage 24-putplaat door voorzichtig te pipetteren met behulp van een milliliter brede boorpunten en breng ze over naar een weefselkweekschaal.Om voldoende vormen van sferoïden te selecteren, controleert u de kwaliteit van sferoïden onder een microscoop. Sferoïden van goede kwaliteit hebben een uniforme grootte, compactheid en rondheid. Vul de gebalanceerde bioreactor met vijf milliliter verse groeimedia en breng de sferoïden erin over.Vul vervolgens de bioreactor volledig met verse groeimedia en zet de bioreactor in de clinostat incubator bij 10 tot 11 RPM. Wissel elke twee tot drie dagen groeimedia uit door 10 milliliter oude media te vervangen door verse media. Naarmate deze sferoïden in grootte en aantal toenemen, verhoogt u de rotatiesnelheid van de incubator.Voeg na het verkrijgen van de sferoïde pellet vijf volumes koud 0,2 molair zwavelzuur toe aan de pellet en pipetteer op en neer om de pellet te verstoren en histonen vrij te geven. Zodra het supernatant na centrifugering is verkregen, voegt u koud geconcentreerd trichloorazijnzuur toe, zodat de uiteindelijke concentratie 25 tot 30 volumeprocent wordt. En meng het door de buis een paar keer om te keren en te centrifugeren zoals beschreven in het manuscript.Na het weggooien van het supernatant, met behulp van een glazen weidepipet, wast u de pellet en de wanden van de buis met ongeveer 500 microliter koud aceton en 0,1% zoutzuur en centrifugeert u vervolgens op 3.400 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Draai vervolgens de buis om om het supernatant weg te gooien. Voeg met behulp van een glazen weidepipet 500 microliter 100% koude aceton toe om de pellet en centrifuge te wassen zoals eerder gedemonstreerd.Verwijder na het weggooien van het supernatant aceton volledig door voorzichtig te pipetteren en laat het monster ongeveer 20 minuten drogen met een open deksel. Resuspend de pellet in 20 microliter van 15 tot 20% acetonitril in een 100 millimolar ammoniumbicarbonaat van pH 8. Draai na het vortexen de suspensie gedurende 30 seconden op 1000 x g.Breng voor acht of meer monsters elk opnieuw gesuspendeerd monster over op een plaat met 96 putten. Voeg vervolgens in een kap twee microliter propionzuuranhydride toe en meng door vijf keer te pipetteren. Voeg snel 10 microliter ammoniumhydroxide toe en meng door vijf keer te pipetteren.Meng HLB-hars op een magneetroerplaat. Voeg vervolgens 70 microliter van de HLB-suspensie toe aan elke put van een 96-well filterplaat op een 96-wells opvangplaat. Na het weggooien van de doorstroom, wast u de hars met 100 microliter 0,1% trifluorazijnzuur.Na resuspendatie van elk monster in 100 microliter van 0,1% trifluorazijnzuur, laadt u elk monster in elke put en voorkomt u spatten met behulp van een vacuüm. Na het weggooien van de doorstroom, wast u de monsters met 100 microliter 0,1% trifluorazijnzuur en plaatst u de filterplaat op een nieuwe opvangplaat. Voeg vervolgens 60 microliter 60% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur toe aan elke put en voorkom spatten met behulp van vacuüm.Vang de doorstroming op en droog in een snelheidsvacuüm. Plaats de gedroogde verzamelplaat in de HPLC en voer de LC/MS/MS-methode uit zoals beschreven in het manuscript. In deze studie werd de relatieve abundantie van gemeenschappelijke histon posttranslationele modificaties waargenomen in C3A-hepatocyten die als driedimensionale sferoïden werden gekweekt.Posttranslationele modificaties konden ook worden waargenomen op een enkel residu in peptiden gegenereerd uit histoneiwitten. Behandeling van de sferoïden met natriumbutyraat verhoogde de relatieve abundantie van histonacetylering, terwijl die met natriumsuccinaat de histonresidusuccinylering verbeterde. De methode toonde ook het distributiepatroon van histonacetylering na behandeling met natriumbutyraat en dat van histonsuccinylering na behandeling met natriumsuccinaat.Het resultaat toonde ook commonatoriële patronen van verschillende histonmodificaties. Natriumbutyraatbehandelingen verbeterden de acetylering van het lysineresidu 14 op een peptide gegenereerd uit het histoneiwit H3 aanzienlijk, alleen wanneer het negende lysineresidu twee methylgroepen had, maar niet één of drie methylgroepen. De relatieve abundanties van individuele modificaties en verschillende combinaties van posttranslationele modificaties in het van H3 afgeleide peptide werden ook berekend.Combinatorische patronen van posttranslationele modificaties na behandeling met natriumbutyraat werden ook waargenomen in een peptide gegenereerd uit histoneiwit H4. Ook hier resulteerde de behandeling met natriumbutyraat in een significante toename van acetylering. Er moet kritisch op worden gelet dat de sferoïden zo min mogelijk op de bank blijven en in een ontzoutingsstap om morsen van het monster te voorkomen. Deze workflow kan worden gebruikt om chromatine in vaste weefsels te onderzoeken met behulp van een meer fysiologisch model dan snel replicerende platte celculturen.

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning Stapel-Polymer Stellingen voor Tissue Engineering en Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Detectie van post-translationele modificaties op native Intact Nucleosomen door middel van ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Een weefselkweek Model van primaire boviene Granulosa oestrogeen-producerende cellen

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...