Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Le laboratoire Sidoli remercie la Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), l’AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck et le NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

1. Préparation des tampons et des réactifs
<ol><li>Milieux de croissance cellulaire (pour les cellules HepG2/C3A) : Ajouter le sérum fœtal bovin (FBS) (10 % v/v), les acides aminés non essentiels (1 % v/v), le supplément de L-glutamine (1 % v/v) et la pénicilline/streptomycine (0,5 % v/v) au milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM, contenant 4,5 g/L de glucose). Les milieux de croissance sont conservés à 4 °C pendant un maximum de 2 semaines.</li>
	<li>Solution de butyrate de sodium (NaBu...

L’analyse des PTM d’histones est fondamentalement différente du pipeline d’analyse protéomique typique. La plupart des PTM d’histones ont encore des fonctions biologiques énigmatiques; par conséquent, les annotations telles que l’ontologie des gènes ou les bases de données de voies ne sont pas disponibles. Il existe plusieurs ressources qui associent les modifications des histones à l’enzyme responsable de leur catalyse ou aux protéines contenant des domaines qui lient ces PTM (par exemple, HISTome<su...

Depuis la fin du19e siècle, les systèmes de culture cellulaire ont été utilisés comme modèle pour étudier la croissance et le développement des cellules en dehors du corps humain 1,2. Leur utilisation a également été étendue pour étudier le fonctionnement des tissus et des organes dans des contextes sains et malades 1,3. Les cellules en suspension (p. ex. les cellules sanguines) se développent dans des boîtes de Pétri ou des flacons de façon transparente et interchangeable, car elles ne s’assemblent pas dans des structures tridimensionnelles (3D) in vivo. Les cellules dérivées d’organes solides peuvent se développer dans des systèmes de culture bidimensionnels (2D) ou 3D. En culture 2D, les cellules sont cultivées dans une monocouche qui adhère à une surface plane 2,4. Les systèmes de culture cellulaire 2D sont caractérisés par une croissance exponentielle et un temps de doublement rapide, généralement de 24 h à quelques jours5. Les cellules des systèmes 3D se développent pour former des interactions cellules-cellules complexes en modélisant plus étroitement des conglomérats tissulaires, et elles se caractérisent par leur capacité à atteindre un équilibre dynamique où leur temps de doublement peut atteindre 1 mois ou plus5.
Présenté dans cet article est une méthodologie innovante pour cultiver des sphéroïdes 3D dans des systèmes de culture cellulaire rotatifs qui simulent une gravité réduite6. Il s’agit d’un dérivé simplifié d’un système de culture cellulaire introduit par la NASA dans les années 19907. Cette approche minimise les forces de cisaillement, qui se produisent dans les méthodes existantes comme la filature des flacons, et augmente la reproductibilité des sphéroïdes6. En outre, le bioréacteur rotatif augmente la diffusion active des nutriments, minimisant la formation nécrotique qui se produit dans des systèmes tels que la culture cellulaire suspendue où l’échange de milieux n’est pas pratique6. De cette façon, les cellules se développent la plupart du temps sans être dérangées, ce qui permet la formation de caractéristiques structurelles et physiologiques associées à la croissance des cellules dans les tissus. Les hépatocytes C3A (HepG2/C3A) cultivés de cette manière avaient non seulement des organites ultrastructuraux, mais produisaient également des quantités d’ATP, d’adénylate kinase, d’urée et de cholestérol comparables aux niveaux observés in vivo 1,2. En outre, les cellules cultivées en 2D par rapport aux systèmes de culture cellulaire .3D présentent des modèles d’expression génique différents8. L’analyse de l’expression génique des hépatocytes C3A cultivés sous forme de sphéroïdes 3D a montré que ces cellules exprimaient un large éventail de protéines spécifiques au foie, ainsi que des gènes impliqués dans des voies clés qui régulent la fonction hépatique8. Des publications antérieures ont démontré les différences entre les protéomes de cellules à croissance exponentielle en culture 2D et les cellules à l’équilibre dynamique dans les cultures sphéroïdes 3D5. Ces différences incluent le métabolisme cellulaire, qui à son tour affecte la structure, la fonction et la physiologie de la cellule5. Le protéome des cellules cultivées en culture 2D était plus enrichi en protéines impliquées dans la réplication cellulaire, tandis que le protéome des sphéroïdes 3D était plus enrichi en fonctionnalité hépatique5.
Le taux de réplication plus lent des cellules cultivées sous forme de sphéroïdes 3D modélise plus précisément des phénomènes spécifiques associés à l’état et aux modifications de la chromatine (par exemple, coupure d’histone9). L’écrêtage des histones est une modification post-traductionnelle irréversible des histones (PTM) qui provoque un clivage protéolytique d’une partie de la queue N-terminale de l’histone. Bien que sa fonction biologique soit encore en discussion 10,11,12,13, il est clair que sa présence dans les cellules primaires et les tissus hépatiques est modélisée par des cellules HepG2/C3A cultivées sous forme de sphéroïdes, mais pas sous forme de cellules plates 9. Ceci est essentiel, car l’état et les modifications de la chromatine régulent la lecture de l’ADN principalement en modulant l’accessibilité aux gènes et donc leur expression14. Les PTM d’histone influencent soit directement l’état de la chromatine en affectant la charge nette des nucléosomes où les histones sont assemblées, soit indirectement en recrutant des écrivains, des lecteurs et des gommes à base de chromatine14. Des centaines de PTM d’histones ont été identifiés à ce jour15, renforçant l’hypothèse selon laquelle la chromatine héberge un « code d’histone » utilisé par la cellule pour interpréter l’ADN16. Cependant, l’identification d’une myriade de combinaisons ptm15 et la découverte que les combinaisons de PTM d’histones ont souvent des fonctions biologiques différentes des PTM présents isolément (par exemple, Fischle et al.17), soulignent que davantage de travail est nécessaire pour déchiffrer le « code des histones ».
À l’heure actuelle, l’analyse ptm des histones est soit basée sur des techniques utilisant des anticorps (par exemple, transferts de Western, immunofluorescence ou immunoprécipitation de la chromatine suivie d’un séquençage [ChIP-seq]) ou la spectrométrie de masse (SEP). Les techniques à base d’anticorps ont une sensibilité élevée et peuvent fournir des informations détaillées sur la localisation des marques d’histones à l’échelle du génome, mais sont souvent limitées dans l’étude des PTM rares ou des PTM présents dans des combinaisons 18,19,20. La SEP est plus adaptée à l’identification et à la quantification à haut débit et non biaisées des modifications protéiques uniques et coexistantes, en particulier les protéines histones 18,19,20. Pour ces raisons, ce laboratoire et plusieurs autres ont optimisé le pipeline de SEP pour l’analyse des peptides d’histones (SEP ascendante), des queues d’histones intactes (SEP moyennement descendante) et des protéines d’histones pleine longueur (MS descendante)21,22,23.
Vous trouverez ci-dessous un flux de travail pour la culture des sphéroïdes HepG2 / C3A et leur préparation à l’analyse peptidique des histones (MS ascendante) par chromatographie nano-liquide, couplée en ligne à la spectrométrie de masse en tandem (nLC-MS / MS). Une culture cellulaire 2D a été cultivée et les cellules ont été récoltées et transférées dans un bioréacteur où elles ont commencé à former des sphéroïdes (Figure 1). Après 18 jours de culture, les sphéroïdes ont été traités avec du butyrate de sodium ou du succinate de sodium pour augmenter les abondances relatives d’acétylation et de succinylation des histones. Notamment, les cultures 3D peuvent être traitées avec des composés génotoxiques tout aussi bien que leurs équivalents de culture plate; en fait, des publications récentes soulignent que la réponse toxicologique des cellules en culture 3D est plus similaire aux tissus primaires que celles en culture plate 2D24,25. Les cellules ont ensuite été collectées à des moments précis et l’isolement nucléaire a été effectué. Ensuite, les histones ont été extraites et dérivées avec de l’anhydride propionique avant et après la digestion de la trypsine selon un protocole développé pour la première fois par Garcia et al.26. Cette procédure génère des peptides d’une taille appropriée pour la séparation en ligne avec chromatographie en phase inversée (C18) et la détection avec MS. Enfin, les peptides d’histones ont été identifiés et quantifiés, et les données générées ont été représentées de multiples façons pour une interprétation biologique plus complète.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

Les cultures plates de cellules de mammifères sont une approche in vitro largement utilisée pour comprendre la physiologie cellulaire, mais ce système est limité dans la modélisation des tissus solides en raison de la réplication cellulaire anormalement rapide. Ceci est particulièrement difficile lors de la modélisation de la chromatine mature, car les cellules à réplication rapide sont fréquemment impliquées dans la réplication de l’ADN et ont une population polyploïde hétérogène. Vous trouverez ci-dessous un flux de travail pour la modélisation, le traitement et l’analyse des modifications de la chromatine au repos à l’aide d’un système de culture cellulaire tridimensionnelle (3D). En utilisant ce protocole, les lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire sont cultivées sous forme de sphéroïdes 3D reproductibles dans un incubateur fournissant une diffusion active des nutriments et de faibles forces de cisaillement. Le traitement au butyrate de sodium et au succinate de sodium a induit une augmentation de l’acétylation des histones et de la succinylation, respectivement. Les augmentations des niveaux d’acétylation des histones et de succinylation sont associées à un état de chromatine plus ouvert. Les sphéroïdes sont ensuite collectés pour isoler les noyaux cellulaires, à partir desquels les protéines d’histones sont extraites pour l’analyse de leurs modifications post-traductionnelles. L’analyse des histones est réalisée par chromatographie liquide couplée en ligne à la spectrométrie de masse en tandem, suivie d’un pipeline de calcul interne. Enfin, des exemples de représentation de données pour étudier la fréquence et l’occurrence des marques combinatoires d’histones sont montrés.

Dans ce protocole, les sphéroïdes HepG2/C3A ont été traités avec 20 mM de NaBut et 10 mM de NaSuc, qui ont tous deux affecté les niveaux globaux d’histones PTM (Figure 3A). Les PTM d’histones ont ensuite été identifiés et quantifiés au niveau de résidu unique par acquisition de MS/MS (Figure 3B).
Lorsque les échantillons sont exécutés en répétitions, une analyse statistique peut être effectuée pour éval...

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Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Ce protocole décrit comment un système de culture cellulaire tridimensionnel peut être utilisé pour modéliser, traiter et analyser les modifications de la chromatine dans un état quasi physiologique.

Quantification au niveau global des modifications post-traductionnelles des histones dans un modèle de culture cellulaire 3D de tissu hépatique

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

La dynamique mondiale de la chromatine s’est avérée être un médiateur important de plusieurs états pathologiques, tels que le cancer et le vieillissement. Notre protocole fournit un modèle physiologiquement pertinent pour étudier ce processus. L’analyse de laboratoire standard des modifications post-traductionnelles des histones ou PTMS se limite généralement à sonder un seul PTM à la fois à l’aide de tests à base d’anticorps.L’analyse par spectrométrie de masse par chromatographie liquide des HISMS nous permet de mesurer l’abondance de centaines de PTMS en une seule expérience. Stephanie Stransky, Ronald Cutler et Julie Kim, postdoctorante, étudiante diplômée et technicienne en recherche, respectivement, du laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Tout d’abord, en utilisant des milieux de croissance standard, cultivez les cellules sous forme de monocouche jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 80%.Ensuite, lavez les cellules avec HBSS. Ajouter cinq millilitres de 0,05 % de trypsine-EDTA dilués dans hbss. Incuber les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Utilisez un microscope pour vérifier le détachement des cellules. Après avoir compté les cellules, diluer la suspension cellulaire avec un milieu de croissance frais. Ajouter 0,5 millilitre de milieu de croissance pour équilibrer une plaque de fond ronde à 24 puits à fixation ultra faible avec plusieurs micro-puits dans chacun.Ensuite, centrifugez les plaques à 3000 x g pour éliminer les bulles d’air de la surface de la plaque. Maintenant, transférez la suspension de cellule précédemment fabriquée sur la plaque de 24 puits et centrifugez pendant trois minutes à 120 x g. Vérifiez les cellules dans la plaque de 24 puits, puis incubez les plaques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour la formation de sphéroïdes.Pendant ce temps, pour équilibrer le bioréacteur, ajoutez 25 millilitres d’eau stérile à la chambre d’humidité et neuf millilitres de milieu de croissance à la chambre cellulaire. Incuber le bioréacteur dans un incubateur à clinostat rotatif pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Détachez les sphéroïdes de la plaque à 24 puits à fixation ultra basse en pipetant doucement à l’aide d’embouts d’alésage d’un millilitre de large et transférez-les dans un plat de culture tissulaire.Pour sélectionner suffisamment de formes de sphéroïdes, vérifiez la qualité des sphéroïdes au microscope. Les sphéroïdes de bonne qualité ont une taille, une compacité et une rondeur uniformes. Remplissez le bioréacteur équilibré avec cinq millilitres de milieux de croissance frais et transférez-y les sphéroïdes.Ensuite, remplissez complètement le bioréacteur avec des milieux de croissance frais et placez le bioréacteur dans l’incubateur de clinostat à 10 à 11 tr / min. Tous les deux à trois jours, échangez des supports de croissance en remplaçant 10 millilitres d’anciens supports par des supports frais. Au fur et à mesure que ces sphéroïdes augmentent en taille et en nombre, augmentez la vitesse de rotation de l’incubateur.Après avoir obtenu la pastille sphéroïde, ajoutez cinq volumes d’acide sulfurique molaire 0,2 froid à la pastille et pipetez de haut en bas pour perturber la pastille et libérer des histones. Une fois le surnageant obtenu après centrifugation, ajouter de l’acide trichloroacétique concentré à froid, de sorte que la concentration finale atteigne 25 à 30% vol par volume. Et mélangez-le en inversant le tube plusieurs fois et en centrifugeant comme décrit dans le manuscrit.Après avoir jeté le surnageant, à l’aide d’une pipette de pâturage en verre, lavez la pastille et les parois du tube avec environ 500 microlitres d’acétone froide et 0,1% d’acide chlorhydrique, puis centrifugez à 3 400 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retournez ensuite le tube pour jeter le surnageant. À l’aide d’une pipette de pâturage en verre, ajoutez 500 microlitres d’acétone 100% froide pour laver la pastille et centrifuger comme démontré précédemment.Après avoir jeté le surnageant, retirez complètement l’acétone en pipetant soigneusement et laissez l’échantillon sécher avec un couvercle ouvert pendant environ 20 minutes. Remettre en suspension la pastille dans 20 microlitres de 15 à 20% d’acétonitrile dans un bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires de pH 8. Après le vortex, faites tourner la suspension à 1000 x g pendant 30 secondes.Pour huit échantillons ou plus, transférer chaque échantillon en suspension dans une plaque de 96 puits. Ensuite, dans une hotte, ajoutez deux microlitres d’anhydride propionique et mélangez en pipetant cinq fois. Ajouter rapidement 10 microlitres d’hydroxyde d’ammonium et mélanger en pipetant cinq fois.Mélanger la résine HLB sur une plaque magnétique. Ajoutez ensuite 70 microlitres de suspension HLB à chaque puits d’une plaque filtrante de 96 puits sur une plaque de collecte de 96 puits. Après avoir jeté l’écoulement, lavez la résine avec 100 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1%.Après avoir remis chaque échantillon en suspension dans 100 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 %, chargez chaque échantillon dans chaque puits et évitez les éclaboussures à l’aide d’un vide. Après avoir éliminé le flux, lavez les échantillons avec 100 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1% et placez la plaque filtrante sur une nouvelle plaque de collecte. Ensuite, ajoutez 60 microlitres de 60% d’acétonitrile dans 0,1% d’acide trifluoroacétique à chaque puits et évitez les éclaboussures sous vide.Collectez le flux à travers et séchez dans un vide rapide. Chargez la plaque de collecte séchée dans la CLHP et exécutez la méthode LC/MS/MS comme décrit dans le manuscrit. Dans cette étude, l’abondance relative des modifications post-traductionnelles courantes des histones a été observée dans les hépatocytes C3A cultivés sous forme de sphéroïdes tridimensionnels.Des modifications post-traductionnelles ont également pu être observées sur un seul résidu dans les peptides générés à partir de protéines d’histones. Le traitement des sphéroïdes avec du butyrate de sodium a augmenté l’abondance relative de l’acétylation des histones, tandis que celui avec le succinate de sodium a amélioré la succinylation des résidus d’histones. La méthode a également démontré le schéma de distribution de l’acétylation des histones après un traitement au butyrate de sodium et celui de la succinylation des histones après un traitement au succinate de sodium.Le résultat a également montré des modèles communs de différentes modifications des histones. Les traitements au butyrate de sodium ont significativement amélioré l’acétylation du résidu de lysine 14 sur un peptide généré à partir de la protéine d’histone H3, seulement lorsque son neuvième résidu de lysine avait deux groupes méthyle, mais pas un ou trois groupes méthyle. Les abondances relatives de modifications individuelles et de diverses combinaisons de modifications post-traductionnelles dans le peptide dérivé de H3 ont également été calculées.Des schémas combinatoires de modifications post-traductionnelles après un traitement au butyrate de sodium ont également été observés dans un peptide généré à partir de la protéine d’histone H4. Ici aussi, le traitement au butyrate de sodium a entraîné une augmentation significative de l’acétylation. Une attention critique doit être accordée au maintien des sphéroïdes sur le banc le moins possible et dans une étape de dessalement pour éviter le déversement des échantillons. Ce flux de travail peut être utilisé pour explorer la chromatine dans les tissus solides en utilisant un modèle plus physiologique que les cultures cellulaires plates à réplication rapide.

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Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Détection des modifications des histones dans les feuilles des plantes

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l&#39;étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots pour surveiller cellulaire spécifique d&#39;un tissu mural Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Flux de travail complet pour l&#39;analyse des histones modifications post-traductionnelles utilisant la spectrométrie de masse Bottom-up: De Histone Extraction à l&#39;analyse des données

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Un modèle de Culture tissulaire d’oestrogène-production primaire Bovine Granulosa cellules

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...