Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Das Sidoli-Labor dankt der Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck und dem NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien
<ol><li>Zellwachstumsmedien (für HepG2/C3A-Zellen): Fügen Sie fötales Rinderserum (FBS) (10% v/v), nicht-essentielle Aminosäuren (1% v/v), L-Glutamin-Ergänzung (1% v/v) und Penicillin/Streptomycin (0,5% v/v) zu Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM, mit 4,5 g/L Glukose) hinzu. Wachstumsmedien werden bei 4 °C für maximal 2 Wochen gelagert.</li>
	<li>200 mM Natriumbutyrat (NaBut)-Lösung: Zur Herstellung von 10 ml werden 220,18 mg NaBut in 10 ml ddH...

Die Analyse von Histon-PTMs unterscheidet sich grundlegend von der typischen Proteomik-Analysepipeline. Die meisten Histon-PTMs haben immer noch rätselhafte biologische Funktionen; Infolgedessen sind Annotationen wie Gene Ontology oder Pathway-Datenbanken nicht verfügbar. Es gibt mehrere Ressourcen, die Histonmodifikationen mit dem Enzym assoziieren, das für ihre Katalyse verantwortlich ist, oder mit Proteinen, die Domänen enthalten, die diese PTMs binden (z. B. HISTome36). Es ist auch möglic...

Seit dem späten 19. Jahrhundert werden Zellkultursysteme als Modell verwendet, um das Wachstum und die Entwicklung von Zellen außerhalb des menschlichen Körpers zu untersuchen 1,2. Ihre Verwendung wurde auch erweitert, um zu untersuchen, wie Gewebe und Organe sowohl in gesunden als auch in kranken Kontexten funktionieren 1,3. Suspensionszellen (z.B. Blutzellen) wachsen in Petrischalen oder Kolben nahtlos und austauschbar, da sie sich nicht in vivo in dreidimensionalen (3D) Strukturen zusammensetzen. Zellen, die aus festen Organen gewonnen werden, können entweder in zweidimensionalen (2D) oder 3D-Kultursystemen wachsen. In der 2D-Kultur werden Zellen in einer Monoschicht gezüchtet, die an einer flachen Oberflächehaftet 2,4. 2D-Zellkultursysteme zeichnen sich durch exponentielles Wachstum und eine schnelle Verdopplungszeit aus, typischerweise 24 h bis zu einigen Tagen5. Zellen in 3D-Systemen wachsen zu komplizierten Zell-Zell-Interaktionen, die gewebeähnliche Konglomerate genauer modellieren, und sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, ein dynamisches Gleichgewicht zu erreichen, in dem ihre Verdopplungszeit 1 Monat oder länger erreichen kann5.
In diesem Artikel wird eine innovative Methodik zur Züchtung von 3D-Sphäroiden in rotierenden Zellkultursystemen vorgestellt, die eine reduzierte Schwerkraft simulieren6. Dies ist ein vereinfachtes Derivat eines Zellkultursystems, das von der NASA in den 1990er Jahren eingeführtwurde 7. Dieser Ansatz minimiert die Scherkräfte, die bei bestehenden Methoden wie Spinnkolben auftreten, und erhöht die Sphäroidreproduzierbarkeit6. Darüber hinaus erhöht der rotierende Bioreaktor die aktive Nährstoffdiffusion und minimiert die nekrotische Bildung, die in Systemen wie der hängenden Tropfenzellkultur auftritt, in der der Medienaustausch unpraktisch ist6. Auf diese Weise wachsen die Zellen weitgehend ungestört, was die Bildung struktureller und physiologischer Eigenschaften ermöglicht, die mit dem Wachstum von Zellen im Gewebe verbunden sind. Auf diese Weise kultivierte C3A-Hepatozyten (HepG2/C3A) hatten nicht nur ultrastrukturelle Organellen, sondern produzierten auch Mengen an ATP, Adenylatkinase, Harnstoff und Cholesterin, die mit den in vivo 1,2 beobachteten Spiegeln vergleichbar waren. Darüber hinaus weisen Zellen, die in 2D.3D im Vergleich zu Zellkultursystemen gezüchtet wurden, unterschiedliche Genexpressionsmusterauf 8. Die Genexpressionsanalyse von C3A-Hepatozyten, die als 3D-Sphäroide gezüchtet wurden, zeigte, dass diese Zellen eine breite Palette von leberspezifischen Proteinen sowie Gene exprimierten, die an Schlüsselwegen beteiligt sind, die die Leberfunktion regulieren8. Frühere Veröffentlichungen zeigten die Unterschiede zwischen Proteomen exponentiell wachsender Zellen in 2D-Kultur und Zellen im dynamischen Gleichgewicht in 3D-Sphäroidekulturen5. Zu diesen Unterschieden gehört der Zellstoffwechsel, der wiederum die Struktur, Funktion und Physiologie der Zelle beeinflusst5. Das Proteom von Zellen, die in 2D-Kultur gezüchtet wurden, war stärker mit Proteinen angereichert, die an der Zellreplikation beteiligt waren, während das Proteom von 3D-Sphäroiden in der Leberfunktionalitätangereichert war 5.
Die langsamere Replikationsrate von Zellen, die als 3D-Sphäroide gezüchtet werden, modelliert genauer spezifische Phänomene, die mit dem Chromatinzustand und Modifikationen verbunden sind (z. B. Histon-Clipping9). Histon-Clipping ist eine irreversible Histon-posttranslationale Modifikation (PTM), die eine proteolytische Spaltung eines Teils des Histon-N-terminalen Schweifs verursacht. Während seine biologische Funktion noch diskutiert wird10,11,12,13, ist es klar, dass seine Anwesenheit in Primärzellen und Lebergewebe von HepG2 / C3A-Zellen modelliert wird, die als Sphäroide gezüchtet wurden, aber nicht als flache Zellen9. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Chromatinzustand und die Modifikationen die DNA-Auslesung hauptsächlich durch Modulation der Zugänglichkeit zu Genen und damit ihrer Expressionregulieren 14. Histon-PTMs beeinflussen entweder den Chromatinzustand direkt, indem sie die Nettoladung der Nukleosomen beeinflussen, in denen Histone zusammengesetzt sind, oder indirekt durch die Rekrutierung von Chromatin-Schreibern, Lesern und Radiergummis14. Hunderte von Histon-PTMs wurden bis heute15 identifiziert, was die Hypothese verstärkt, dass Chromatin einen "Histon-Code" beherbergt, der von der Zelle zur Interpretation von DNA16 verwendet wird. Die Identifizierung einer Vielzahl von PTM-Kombinationen15 und die Entdeckung, dass Kombinationen von Histon-PTMs häufig andere biologische Funktionen haben als PTMs, die isoliert vorliegen (z. B. Fischle, et al.17), zeigen jedoch, dass mehr Arbeit erforderlich ist, um den "Histoncode" zu entschlüsseln.
Derzeit basiert die Histon-PTM-Analyse entweder auf Techniken, die Antikörper verwenden (z. B. westliche Flecken, Immunfluoreszenz oder Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung [ChIP-seq]) oder Massenspektrometrie (MS). Antikörper-basierte Techniken haben eine hohe Sensitivität und können detaillierte Informationen über die genomweite Lokalisierung von Histonmarkierungen liefern, sind jedoch häufig bei der Untersuchung seltener PTMs oder PTMs in Kombinationenbegrenzt 18,19,20. MS eignet sich besser für den Hochdurchsatz und die unvoreingenommene Identifizierung und Quantifizierung einzelner und koexistierender Proteinmodifikationen, insbesondere Histonproteine18,19,20. Aus diesen Gründen haben dieses und mehrere andere Labore die MS-Pipeline für die Analyse von Histonpeptiden (Bottom-up-MS), intakten Histonschwänzen (Middle-Down-MS) und Histonproteinen in voller Länge (Top-Down-MS) optimiert21,22,23.
Im Folgenden finden Sie einen Workflow für die Züchtung von HepG2/C3A-Sphäroiden und deren Vorbereitung für die Histonpeptidanalyse (Bottom-up-MS) mittels Nano-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (nLC-MS/MS). Eine 2D-Zellkultur wurde gezüchtet und die Zellen wurden geerntet und in einen Bioreaktor gebracht, wo sie Sphäroide bilden würden (Abbildung 1). Nach 18 Tagen in Kultur wurden Sphäroide mit Natriumbutyrat oder Natriumsuccinat behandelt, um die relative Häufigkeit von Histonacetylierung und Succinylierung zu erhöhen. Insbesondere können 3D-Kulturen mit genotoxischen Verbindungen genauso gut behandelt werden wie ihre flachen Kulturäquivalente; Tatsächlich heben neuere Veröffentlichungen hervor, dass die toxikologische Reaktion von Zellen in 3D-Kultur dem Primärgewebe ähnlicher ist als die in 2D-Flachkultur24,25. Zellen wurden dann zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt und eine nukleare Isolierung durchgeführt. Dann wurden Histone extrahiert und mit Propionanhydrid vor und nach der Trypsinverdauung nach einem Protokoll abgeleitet, das zuerst von Garcia et al.26 entwickelt wurde. Dieses Verfahren erzeugt Peptide in geeigneter Größe für die Online-Trennung mit Umkehrphasenchromatographie (C18) und den Nachweis mit MS. Schließlich wurden Histonpeptide identifiziert und quantifiziert, und die generierten Daten wurden auf vielfältige Weise für eine vollständigere biologische Interpretation dargestellt.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

Flachkulturen von Säugetierzellen sind ein weit verbreiteter In-vitro-Ansatz zum Verständnis der Zellphysiologie, aber dieses System ist bei der Modellierung von festem Gewebe aufgrund der unnatürlich schnellen Zellreplikation begrenzt. Dies ist besonders schwierig bei der Modellierung von reifem Chromatin, da schnell replizierende Zellen häufig an der DNA-Replikation beteiligt sind und eine heterogene polyploide Population aufweisen. Im Folgenden finden Sie einen Workflow zum Modellieren, Behandeln und Analysieren von ruhenden Chromatinmodifikationen mit einem dreidimensionalen (3D) Zellkultursystem. Unter Verwendung dieses Protokolls werden hepatozelluläre Karzinomzelllinien als reproduzierbare 3D-Sphäroide in einem Inkubator gezüchtet, die eine aktive Nährstoffdiffusion und geringe Scherkräfte bieten. Die Behandlung mit Natriumbutyrat und Natriumsuccinat induzierte eine Zunahme der Histonacetylierung bzw. der Succinylierung. Erhöhungen der Histonacetylierung und Succinylierung sind mit einem offeneren Chromatinzustand verbunden. Sphäroide werden dann zur Isolierung von Zellkernen gesammelt, aus denen Histonproteine für die Analyse ihrer posttranslationalen Modifikationen extrahiert werden. Die Histonanalyse wird über die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt, gefolgt von einer internen Rechenpipeline. Abschließend werden Beispiele für die Datendarstellung zur Untersuchung der Häufigkeit und des Auftretens kombinatorischer Histonspuren gezeigt.

In diesem Protokoll wurden HepG2/C3A-Sphäroide mit 20 mM NaBut und 10 mM NaSuc behandelt, die beide die globalen Konzentrationen von Histon-PTMs beeinflussten (Abbildung 3A). Histon-PTMs wurden dann identifiziert und auf Einzelrückstandsebene mittels MS/MS-Erfassung quantifiziert (Abbildung 3B).
Wenn Stichproben in Replikaten ausgeführt werden, kann eine statistische Analyse durchgeführt werden, um die Anreicherung der Fa...

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Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.

Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Es hat sich gezeigt, dass die globale Chromatindynamik ein wichtiger Mediator für mehrere Krankheitszustände wie Krebs und Altern ist. Unser Protokoll bietet ein physiologisch relevantes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen. Die Standardlaboranalyse von Histon-posttranslationalen Modifikationen oder PTMS beschränkt sich in der Regel auf die Untersuchung eines einzelnen PTM gleichzeitig unter Verwendung von Antikörper-basierten Assays.Die flüssigkeitschromatographische Massenspektrometrie-Analyse von Histon-PTMS ermöglicht es uns, die Häufigkeit von Hunderten von PTMS in einem einzigen Experiment zu messen. Das Verfahren wird von Stephanie Stransky, Ronald Cutler und Julie Kim, einer Postdoktorandin, Doktorandin und Forschungstechnikerin aus dem Labor, demonstriert. Erstens, mit Standard-Wachstumsmedien, züchten Sie die Zellen als Monolayer, bis sie zu 80% konfluent sind.Dann waschen Sie die Zellen mit HBSS. Fügen Sie fünf Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, verdünnt in HBSS. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellablösung zu überprüfen. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, verdünnen Sie die Zellsuspension mit frischen Wachstumsmedien. Fügen Sie 0,5 Milliliter Wachstumsmedien hinzu, um eine extrem niedrige 24-Well-Rundbodenplatte mit jeweils mehreren Mikrovertiefungen auszugleichen.Dann zentrifugieren Sie die Platten bei 3000 x g, um Luftblasen von der Oberfläche der Platte zu entfernen. Übertragen Sie nun die zuvor hergestellte Zellsuspension für drei Minuten bei 120 x g auf die 24-Well-Platte und die Zentrifuge. Überprüfen Sie die Zellen in der 24-Well-Platte und inkubieren Sie dann die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden für die Sphäroidbildung.Um den Bioreaktor auszugleichen, fügen Sie 25 Milliliter steriles Wasser in die Feuchtigkeitskammer und neun Milliliter Wachstumsmedien in die Zellkammer hinzu. Inkubieren Sie den Bioreaktor in einem rotierenden Clinostat-Inkubator für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Lösen Sie die Sphäroide von der extrem niedrig angebrachten 24-Well-Platte, indem Sie sie vorsichtig mit einem Milliliter breiten Bohrungsspitzen pipettieren und in eine Gewebekulturschale geben.Um Sphäroide ausreichend zu formen, überprüfen Sie die Qualität der Sphäroide unter einem Mikroskop. Gute Qualität Sphäroide haben eine gleichmäßige Größe, Kompaktheit und Rundheit. Füllen Sie den ausgeglichenen Bioreaktor mit fünf Millilitern frischem Wachstumsmedium und übertragen Sie die Sphäroide in ihn.Dann füllen Sie den Bioreaktor vollständig mit frischen Wachstumsmedien und legen Sie den Bioreaktor bei 10 bis 11 U / min in den Clinostat-Inkubator. Tauschen Sie alle zwei bis drei Tage Wachstumsmedien aus, indem Sie 10 Milliliter alte Medien durch frische Medien ersetzen. Wenn diese Sphäroide an Größe und Anzahl zunehmen, erhöhen Sie die Rotationsgeschwindigkeit des Inkubators.Nachdem Sie das Sphäroidpellet erhalten haben, fügen Sie dem Pellet fünf Volumina kalte 0,2 molare Schwefelsäure hinzu und pipettieren Sie es auf und ab, um das Pellet zu stören und Histone freizusetzen. Sobald der Überstand nach der Zentrifugation erhalten ist, fügen Sie kalte konzentrierte Trichloressigsäure hinzu, so dass die Endkonzentration 25 bis 30 Volumenprozent beträgt. Und mischen Sie es, indem Sie das Rohr ein paar Mal umkehren und zentrifugieren, wie im Manuskript beschrieben.Nachdem Sie den Überstand mit einer Glasweidepipette entsorgt haben, waschen Sie das Pellet und die Wände des Rohres mit etwa 500 Mikrolitern kaltem Aceton und 0,1% Salzsäure und zentrifugieren Sie dann bei 3.400 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Drehen Sie dann die Röhre um, um den Überstand zu verwerfen. Mit einer Glasweidepipette fügen Sie 500 Mikroliter 100% kaltes Aceton hinzu, um das Pellet und die Zentrifuge zu waschen, wie zuvor gezeigt.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, entfernen Sie das Aceton vollständig durch vorsichtiges Pipettieren und lassen Sie die Probe mit einem geöffneten Deckel etwa 20 Minuten trocknen. Resuspendiert das Pellet in 20 Mikrolitern von 15 bis 20% Acetonitril in einem 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat von pH 8. Drehen Sie nach dem Vortexen die Aufhängung bei 1000 x g für 30 Sekunden herunter.Bei acht oder mehr Proben ist jede resuspendierte Probe auf eine 96-Well-Platte zu überführen. Dann fügen Sie in einer Haube zwei Mikroliter Propionanhydrid hinzu und mischen Sie fünfmal durch Pipettieren. Fügen Sie schnell 10 Mikroliter Ammoniumhydroxid hinzu und mischen Sie fünfmal durch Pipettieren.Mischen Sie HLB-Harz auf einer magnetischen Rührplatte. Dann fügen Sie 70 Mikroliter der HLB-Suspension zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Filterplatte auf einer 96-Well-Auffangplatte hinzu. Nachdem Sie den Durchfluss entsorgt haben, waschen Sie das Harz mit 100 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure.Nachdem Sie jede Probe in 100 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure resuspendiert haben, laden Sie jede Probe in jede Vertiefung und verhindern Sie das Spritzen mit einem Vakuum. Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, waschen Sie die Proben mit 100 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure und legen Sie die Filterplatte auf eine neue Auffangplatte. Als nächstes fügen Sie 60 Mikroliter 60% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure zu jeder Vertiefung hinzu und verhindern Sie das Spritzen mit Vakuum.Sammeln Sie den Durchfluss durch und trocknen Sie ihn in einem Geschwindigkeitsvakuum. Laden Sie die getrocknete Entnahmeplatte in die HPLC und führen Sie die LC/MS/MS-Methode wie im Manuskript beschrieben aus. In dieser Studie wurde die relative Häufigkeit häufiger posttranslationaler Histonmodifikationen in C3A-Hepatozyten beobachtet, die als dreidimensionale Sphäroide gezüchtet wurden.Posttranslationale Modifikationen konnten auch an einem einzelnen Rest in Peptiden beobachtet werden, die aus Histonproteinen erzeugt wurden. Die Behandlung der Sphäroide mit Natriumbutyrat erhöhte die relative Häufigkeit der Histonacetylierung, während die mit Natriumsuccinat die Histonrestprägnylierung verstärkte. Die Methode zeigte auch das Verteilungsmuster der Histonacetylierung nach der Behandlung mit Natriumbutyrat und das der Histonuccinylierung nach der Behandlung mit Natriumsuccinat.Das Ergebnis zeigte auch gemeinsame Muster verschiedener Histonmodifikationen. Natriumbutyrat-Behandlungen verstärkten signifikant die Acetylierung des Lysinrests 14 auf einem Peptid, das aus dem Histonprotein H3 erzeugt wurde, nur dann, wenn sein neunter Lysinrest zwei Methylgruppen, aber nicht eine oder drei Methylgruppen aufwies. Die relativen Häufigkeiten einzelner Modifikationen und verschiedene Kombinationen posttranslationaler Modifikationen im H3-abgeleiteten Peptid wurden ebenfalls berechnet.Kombinatorische Muster posttranslationaler Modifikationen nach der Behandlung mit Natriumbutyrat wurden auch in einem Peptid beobachtet, das aus dem Histonprotein H4 erzeugt wurde. Auch hier führte die Behandlung mit Natriumbutyrat zu einem signifikanten Anstieg der Acetylierung. Kritische Aufmerksamkeit sollte darauf gelegt werden, die Sphäroide so wenig wie möglich auf der Bank zu halten und in einem Entsalzungsschritt, um ein Verschütten der Probe zu vermeiden. Dieser Workflow kann verwendet werden, um Chromatin in festem Gewebe unter Verwendung eines physiologischeren Modells als schnell replizierender flacher Zellkulturen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Forschung

Biologie

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Erkennung von Histon-Modifikationen in Pflanzenblättern

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ein Tissue Culture Modell der Östrogen-produzierenden primäre Bovine Granulosa Zellen

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...