Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

מעבדת סידולי מכירה בהכרת תודה לקרן לחקר הלוקמיה (מענק מחקר לחוקר חדש של הוליס בראונשטיין), AFAR (פרס Sagol Network GerOmics), לדירפילד (פרס Xseed), ל-Relay Therapeutics, ל-Merck ולמשרד המנהל של NIH (1S10OD030286-01).

1. הכנת מאגרים וריאגנטים
<ol><li>מדיית גדילת תאים (עבור תאי HepG2/C3A): הוסף סרום בקר עוברי (FBS) (10% v/v), חומצות אמינו לא חיוניות (1% v/v), תוסף L-גלוטמין (1% v/v) ופניצילין/סטרפטומיצין (0.5% v/v) למדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM, המכיל 4.5 גרם/ל' גלוקוז). מדיית הצמיחה מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך...

הניתוח של PTMs היסטון שונה במהותו מצינור ניתוח הפרוטאומיקה הטיפוסי. לרוב ה-PTMs של היסטון עדיין יש פונקציות ביולוגיות אניגמטיות; כתוצאה מכך, ביאורים כגון Gene Ontology או מסדי נתונים של מסלולים אינם זמינים. קיימים מספר משאבים המקשרים שינויי היסטון עם האנזים האחראי על הקטליזה שלהם או חלבונים המכילי?...

מאז סוף המאהה-19, מערכות תרביות תאים שימשו כמודל לחקר הצמיחה וההתפתחות של תאים מחוץ לגוף האדם 1,2. השימוש בהם הורחב גם כדי לחקור כיצד רקמות ואיברים מתפקדים בהקשרים בריאים וחוליםכאחד 1,3. תאי ההשעיה (למשל, תאי הדם) גדלים בצלחות פטרי או בצלוחיות בצורה חלקה ומתחלפת מכיוון שהם אינם מורכבים במבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) in vivo. תאים שמקורם באיברים מוצקים יכולים לגדול במערכות תרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) או תלת-ממדיות. בתרבית דו-ממדית, התאים גדלים בחד-שכבתית שנצמדת למשטח שטוח 2,4. מערכות תרביות תאים דו-ממדיות מאופיינות בצמיחה אקספוננציאלית ובזמן הכפלה מהיר, בדרך כלל 24 שעות עד כמה ימים5. תאים במערכות תלת-ממדיות גדלים ויוצרים אינטראקציות מורכבות בין תאים לתאים המדגימים קונגלומרטים דמויי רקמות בצורה הדוקה יותר, והם מאופיינים ביכולתם להגיע לשיווי משקל דינמי שבו זמן ההכפלה שלהם יכול להגיע לחודש או יותר5.
מוצגת במאמר זה מתודולוגיה חדשנית לגידול ספרואידים תלת-ממדיים במערכות תרביות תאים מסתובבות המדימות כוח משיכה מופחת6. זוהי נגזרת פשוטה של מערכת תרביות תאים שהוצגה על ידי נאס"א בשנות ה-90של המאה ה-20. גישה זו ממזערת את כוחות הגזירה, המתרחשים בשיטות קיימות כמו צלוחיות מסתובבות, ומגבירה את יכולת השכפול של הספרואידים6. בנוסף, הביוריאקטור המסתובב מגביר את הדיפוזיה הפעילה של חומרי המזון, וממזער היווצרות נמקית המתרחשת במערכות כמו תרבית תאים תלויה, שבהן חילופי המדיה אינם מעשיים6. בדרך זו, תאים גדלים בעיקר באין מפריע, ומאפשרים היווצרות של מאפיינים מבניים ופיזיולוגיים הקשורים לתאים הגדלים ברקמות. הפטוציטים מסוג C3A (HepG2/C3A) בתרבית באופן זה לא רק בעלי אברונים אולטרה-סטרוקטורליים, אלא גם הפיקו כמויות של ATP, אדנילט קינאז, אוריאה וכולסטרול בדומה לרמות שנצפו ב-vivo 1,2. בנוסף, תאים שגדלו במערכות תרביות תאים דו-ממדיות לעומת .3D מפגינים דפוסי ביטוי גנים שונים8. ניתוח ביטוי גנים של הפטוציטים C3A שגדלו כספרואידים תלת-ממדיים הראה כי תאים אלה ביטאו מגוון רחב של חלבונים ספציפיים לכבד, כמו גם גנים המעורבים במסלולים מרכזיים המווסתים את תפקודי הכבד8. פרסומים קודמים הדגימו את ההבדלים בין פרוטאומים של תאים הגדלים באופן אקספוננציאלי בתרבית דו-ממדית לעומת תאים בשיווי משקל דינמי בתרביות ספרואידיות תלת-ממדיות5. הבדלים אלה כוללים את חילוף החומרים התאי, אשר בתורו משפיע על המבנה, התפקוד והפיזיולוגיה של התא5. הפרוטאום של תאים שגדלו בתרבית דו-ממדית היה מועשר יותר בחלבונים שהיו מעורבים בשכפול תאים, בעוד שהפרוטאום של הספרואידים התלת-ממדיים היה מועשר יותר בתפקוד הכבד5.
קצב השכפול האיטי יותר של תאים הגדלים כספרואידים תלת-ממדיים מדגים בצורה מדויקת יותר תופעות ספציפיות הקשורות למצב כרומטין ולשינויים (לדוגמה, חיתוך היסטון9). חיתוך היסטון הוא שינוי בלתי הפיך של היסטון לאחר התרגום (PTM) הגורם לביקוע פרוטאוליטי של חלק מזנב ההיסטון N-טרמינלי. בעוד שתפקודו הביולוגי עדיין נמצא בדיון 10,11,12,13, ברור שנוכחותו בתאים ראשוניים וברקמת הכבד מבוססת על מודלים של תאי HepG2/C3A שגדלו כספרואידים, אך לא כתאים שטוחים 9. זה קריטי, שכן מצב הכרומטין והשינויים מווסתים את קריאת הדנ"א בעיקר על ידי ויסות הנגישות לגנים ובכך לביטוי שלהם14. PTMs של היסטון משפיעים על מצב הכרומטין באופן ישיר על ידי השפעה על המטען נטו של הנוקלאוזומים שבהם מורכבים היסטונים, או בעקיפין על ידי גיוס כותבי כרומטין, קוראים ומחקים14. מאות PTMs של היסטון זוהו עד כה15, מה שמחזק את ההשערה כי כרומטין מארח "קוד היסטון" המשמש את התא לפענוח דנ"א16. עם זאת, הזיהוי של מספר עצום של צירופי PTM15, והגילוי שלשילובים של PTMs היסטון יש לעתים קרובות פונקציות ביולוגיות שונות מ- PTMs הנמצאים בבידוד (למשל Fischle, et al.17), מדגישים כי נדרשת עבודה נוספת כדי לפענח את "קוד היסטון".
נכון לעכשיו, ניתוח Histone PTM מבוסס על טכניקות המשתמשות בנוגדנים (למשל, כתמים מערביים, אימונופלואורסצנציה, או מיצוי חיסוני של כרומטין ולאחר מכן ריצוף [ChIP-seq]) או ספקטרומטריית מסה (MS). לטכניקות מבוססות נוגדנים יש רגישות גבוהה והן יכולות לספק מידע מפורט על לוקליזציה כלל-גנומית של סימני היסטון, אך לעתים קרובות הן מוגבלות בחקר PTMs או PTMs נדירים הנמצאים בשילובים 18,19,20. טרשת נפוצה מתאימה יותר לזיהוי וכימות בתפוקה גבוהה ובלתי משוחדת של שינויים בחלבונים בודדים וקיימים יחד, במיוחד חלבוני היסטון 18,19,20. מסיבות אלה, מעבדות אלה ומספר מעבדות אחרות ביצעו אופטימיזציה של צינור הטרשת הנפוצה לניתוח פפטידי היסטון (טרשת נפוצה מלמטה למעלה), זנבות היסטון שלמים (MS באמצע למטה) וחלבוני היסטון באורך מלא (MS מלמעלה למטה)21,22,23.
להלן תהליך עבודה לגידול כדוריות HepG2/C3A ולהכנתם לניתוח פפטידי היסטון (MS מלמטה למעלה) באמצעות כרומטוגרפיה ננו-נוזלית, בשילוב מקוון עם ספקטרומטריית מסות טנדם (nLC-MS/MS). גדלה תרבית תאים דו-ממדית והתאים נקטפו והועברו לביוריאקטור, שם הם יתחילו ליצור ספרואידים (איור 1). לאחר 18 יום בתרבית, הספרואידים טופלו בנתרן בוטיראט או נתרן סוקסינט כדי להגדיל את השפע היחסי של אצטילציה היסטון וסוקצינילציה. יש לציין כי ניתן לטפל בתרביות תלת-ממדיות באמצעות תרכובות גנוטוקסיות באותה מידה כמו מקבילותיהן לתרבית השטוחה; למעשה, פרסומים אחרונים מדגישים כי תגובת הטוקסיקולוגיה של תאים בתרבית תלת-ממדית דומה יותר לרקמות ראשוניות מאשר אלה בתרבית שטוחה דו-ממדית24,25. לאחר מכן נאספו תאים בנקודות זמן מוגדרות ובוצע בידוד גרעיני. לאחר מכן, היסטונים הופקו ונגזרו עם אנהידריד פרופיוני לפני ואחרי עיכול טריפסין על פי פרוטוקול שפותח לראשונה על ידי Garcia et al.26. הליך זה מייצר פפטידים בגודל המתאים להפרדה מקוונת עם כרומטוגרפיה פאזה הפוכה (C18) וזיהוי עם טרשת נפוצה. לבסוף, פפטידי היסטון זוהו וכומתו, והנתונים שנוצרו היו מיוצגים בדרכים רבות לפרשנות ביולוגית מלאה יותר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

תרביות שטוחות של תאי יונקים הן גישה נפוצה במבחנה להבנת הפיזיולוגיה של התא, אך מערכת זו מוגבלת במידול רקמות מוצקות עקב שכפול תאים מהיר באופן לא טבעי. זה מאתגר במיוחד כאשר מידול כרומטין בוגר, מכיוון שתאים המשכפלים במהירות מעורבים לעתים קרובות בשכפול DNA ויש להם אוכלוסייה פוליפלואידית הטרוגנית. להלן זרימת עבודה למידול, טיפול וניתוח של שינויים בכרומטין באמצעות מערכת תרביות תאים תלת-ממדית (3D). באמצעות פרוטוקול זה, קווי תאי קרצינומה הפטוצלולריים גדלים כספרואידים תלת-ממדיים הניתנים לשחזור באינקובטור המספק דיפוזיה פעילה של חומרים מזינים וכוחות גזירה נמוכים. הטיפול בנתרן בוטיראט ונתרן סוקסינט גרם לעלייה באצטילציה של היסטון ובסוקצינילציה, בהתאמה. עליות ברמות של אצטילציה היסטון ותמציתינילציה קשורות למצב כרומטין פתוח יותר. לאחר מכן נאספים כדוריים לבידוד גרעיני התא, שמהם מופקים חלבוני היסטון לניתוח השינויים שלאחר התרגום שלהם. ניתוח היסטון מתבצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב מקוון עם ספקטרומטריית מסה טנדם, ואחריה צינור חישובי פנימי. לבסוף, מוצגות דוגמאות לייצוג נתונים כדי לחקור את התדירות וההתרחשות של סימני היסטון קומבינטוריים.

בפרוטוקול זה, הספרואידים HepG2/C3A טופלו ב-20 mM NaBut וב-10 mM NaSuc, שניהם השפיעו על הרמות הגלובליות של PTMs היסטון (איור 3A). לאחר מכן זוהו וכומתו PTMs של Histone ברמת השאריות הבודדות באמצעות רכישת MS/MS (איור 3B).
כאשר דגימות מופעלות בשכפולים, ניתן לבצע ניתוח סטט...

Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת תרביות תאים תלת-ממדית כדי למדל, לטפל ולנתח שינויי כרומטין במצב כמעט פיזיולוגי.

כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

דינמיקת הכרומטין העולמית הוכחה כמתווכת חשובה של מספר מצבי מחלה, כגון סרטן והזדקנות. הפרוטוקול שלנו מספק מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לחקר תהליך זה. ניתוח מעבדה סטנדרטי של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון או PTMS מוגבל בדרך כלל לבדיקת PTM יחיד בכל פעם באמצעות בדיקות מבוססות נוגדנים.ניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית של היסטון PTMS מאפשר לנו למדוד את השפע של מאות PTMS בניסוי יחיד. מי שידגימו את הנוהל יהיו סטפני סטרנסקי, רונלד קאטלר וג'ולי קים, פוסט-דוקטורנטית, סטודנטית לתואר שני וטכנולוגיית מחקר, בהתאמה, מהמעבדה. ראשית, באמצעות מדיית גדילה סטנדרטית, מגדלים את התאים כחד-שכבתיים עד שהם נפגשים ב-80%.לאחר מכן לשטוף את התאים עם HBSS. הוסף חמישה מיליליטרים של 0.05% טריפסין-EDTA מדולל ב- HBSS. דגירה של התאים במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני.השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את ניתוק התאים. לאחר ספירת התאים, דיללו את תרחיף התאים במדיית גדילה טרייה. הוסיפו 0.5 מיליליטרים של מדיית גדילה כדי לאזן לוח תחתון עגול בעל חיבור נמוך במיוחד של 24 בארות עם מיקרו-בארות מרובות בכל אחת מהן.לאחר מכן צנטריפוגה את הלוחות ב 3000 x g כדי להסיר בועות אוויר מן פני השטח של הלוח. כעת העבירו את מתלי התאים שיוצרו בעבר ללוחית הצנטריפוגה בעלת 24 הבארות למשך שלוש דקות ב-120 x גרם. בדוק את התאים בצלחת 24 הבאר ולאחר מכן דגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות להיווצרות ספרואידים.בינתיים, כדי לאזן את הביוריאקטור, הוסיפו 25 מיליליטרים של מים סטריליים לתא הלחות ותשעה מיליליטרים של מדיית גדילה לתא התא. הדגירה של הביוריאקטור בחממת קלינוסטאט מסתובבת למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. נתקו את הספרואידים מהצלחת בעלת החיבור הנמוך במיוחד של 24 בארות על ידי צנרת עדינה באמצעות קצוות נשאים רחבים של מיליליטר אחד, והעבירו אותם לצלחת תרבית רקמה.כדי לבחור צורות מספיקות של ספרואידים, בדקו את איכות הספרואידים מתחת למיקרוסקופ. לספרואידים באיכות טובה יש גודל אחיד, קומפקטיות ועגולות. מלאו את הביוריאקטור המשוקלל בחמישה מיליליטרים של מדיית גדילה טרייה, והעבירו לתוכה את הספרואידים.לאחר מכן מלאו את הביוריאקטור לחלוטין במדיית גדילה רעננה והכניסו את הביוריאקטור לחממת הקלינוסטאט ב-10 עד 11 סל"ד. כל יומיים-שלושה, להחליף מדיה צמיחה על ידי החלפת 10 מיליליטר של מדיה ישנה במדיה טרייה. ככל שספרואידים אלה גדלים בגודלם ובמספרם, הגדילו את מהירות הסיבוב של האינקובטור.לאחר קבלת הכדורית הספרואידית, הוסיפו חמישה נפחים של חומצה גופרתית טוחנת 0.2 קרה לכדור ופיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את הכדור ולשחרר היסטונים. לאחר קבלת הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה, הוסף חומצה טריכלורואצטית מרוכזת קרה, כך שהריכוז הסופי הופך ל -25 עד 30% נפח לפי נפח. וערבבו אותו על ידי היפוך הצינור כמה פעמים וצנטריפוגה כפי שמתואר בכתב היד.לאחר השלכת הסופרנאטנט, באמצעות פיפטת מרעה זכוכית, לשטוף את הכדור ואת דפנות הצינור עם כ -500 מיקרוליטרים של אצטון קר ו 0.1% חומצה הידרוכלורית, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 3, 400 x g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הפוך את הצינור כדי להשליך את ה- supernatant. באמצעות פיפטת מרעה זכוכית, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של 100% אצטון קר כדי לשטוף את הכדור והצנטריפוגה כפי שהודגם בעבר.לאחר השלכת הסופרנאטנט, הסר לחלוטין את האצטון על ידי צנרת בזהירות, ותן לדגימה להתייבש עם מכסה פתוח במשך כ -20 דקות. החייאת הכדור ב-20 מיקרוליטרים של 15 עד 20% של אצטוניטריל ב-100 מילימולר אמוניום ביקרבונט של pH 8. לאחר המערבולת, סובבו את המתלים ב-1000 x g למשך 30 שניות.עבור שמונה דגימות או יותר, העבירו כל דגימה מושעה מחדש ללוחית של 96 בארות. לאחר מכן, במכסה המנוע, מוסיפים שני מיקרוליטרים של אנהידריד פרופיוני ומערבבים על ידי צנרת חמש פעמים. הוסיפו במהירות 10 מיקרוליטרים של אמוניום הידרוקסיד וערבבו על ידי צנרת חמש פעמים.מערבבים שרף HLB על צלחת ערבוב מגנטית. לאחר מכן הוסיפו 70 מיקרוליטרים של מתלי ה-HLB לכל באר של צלחת מסנן בת 96 בארות על צלחת איסוף בת 96 בארות. לאחר השלכת הזרימה, לשטוף את השרף עם 100 microliters של 0.1% חומצה trifluoroacetic.לאחר החייאה חוזרת של כל דגימה ב-100 מיקרוליטרים של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית, טענו כל דגימה בכל באר ומנעו התזה באמצעות ואקום. לאחר השלכת הזרימה, שטפו את הדגימות עם 100 מיקרוליטרים של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית, והניחו את צלחת הפילטר על צלחת איסוף חדשה. לאחר מכן, הוסיפו 60 מיקרוליטרים של 60% אצטוניטריל ב-0.1% חומצה טריפלואורואצטית לכל באר ומנעו התזה באמצעות ואקום.אספו את הזרימה וייבשו בריק מהיר. טען את צלחת האיסוף המיובשת לתוך ה- HPLC והפעל את שיטת LC/MS/MS כמתואר בכתב היד. במחקר זה, השפע היחסי של שינויים נפוצים בהיסטון לאחר התרגום נצפה בהפטוציטים C3A שגדלו כספרואידים תלת-ממדיים.ניתן היה להבחין בשינויים שלאחר התרגום גם על שאריות בודדות בפפטידים הנוצרים מחלבוני היסטון. הטיפול בספרואידים עם נתרן בוטיראט הגדיל את השפע היחסי של אצטילציה היסטון, בעוד שעם נתרן סוקצינאט שיפר את שאריות ההיסטון. השיטה הדגימה גם את דפוס ההתפלגות של אצטילציה היסטון לאחר טיפול בנתרן בוטיראט ואת זו של תמצית ההיסטון לאחר הטיפול בנתרן סוקסינט.התוצאה הראתה גם דפוסים משותפים של שינויי היסטון שונים. טיפולים בנתרן בוטיראט שיפרו באופן משמעותי את האצטילציה של שאריות ליזין 14 על פפטיד שנוצר מחלבון ההיסטון H3, רק כאשר שאריות הליזין התשיעיות שלו כללו שתי קבוצות מתיל, אך לא אחת או שלוש קבוצות מתיל. כמו כן חושבו השפע היחסי של שינויים בודדים ושילובים שונים של שינויים לאחר התרגום בפפטיד הנגזר מ-H3.דפוסים קומבינטוריים של שינויים לאחר תרגום לאחר טיפול בנתרן בוטיראט נצפו גם בפפטיד שנוצר מחלבון היסטון H4. גם כאן, הטיפול בנתרן בוטיראט הביא לעלייה משמעותית באצטילציה. יש לשים לב ביקורתית על שמירת הספרואידים על הספסל כמה שפחות ובשלב התפלה כדי למנוע שפיכת דגימה. ניתן להשתמש בזרימת עבודה זו כדי לחקור כרומטין ברקמות מוצקות באמצעות מודל פיזיולוגי יותר מאשר שכפול מהיר של תרביות תאים שטוחות.

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...