Name: global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue at JoVE.com

सिडोली प्रयोगशाला कृतज्ञतापूर्वक ल्यूकेमिया रिसर्च फाउंडेशन (Hollis Brownstein नए अन्वेषक अनुसंधान अनुदान), AFAR (Sagol नेटवर्क GerOmics पुरस्कार), Deerfield (Xseed पुरस्कार), रिले Therapeutics, मर्क, और निदेशक के एनआईएच कार्यालय (1S10OD030286-01) को स्वीकार करती है।

1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी
<ol><li>सेल विकास मीडिया (हेपजी 2 / सी 3 ए कोशिकाओं के लिए): भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (10% वी / वी), गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (1% वी / वी), एल-ग्लूटामाइन पूरक (1% वी / वी) और पेनिसिलिन / स्ट्र...

हिस्टोन पीटीएम का विश्लेषण मूल रूप से विशिष्ट प्रोटिओमिक्स विश्लेषण पाइपलाइन से अलग है। अधिकांश हिस्टोन पीटीएम में अभी भी रहस्यमय जैविक कार्य हैं; नतीजतन, जीन ओंटोलॉजी या पाथवे डेटाबेस जैसे एनोटेशन ...

19वीं शताब्दी के उत्तरार्ध से, सेल संस्कृति प्रणालियों का उपयोग मानव शरीर के बाहर कोशिकाओं के विकास और विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया गयाहै 1,2। उनके उपयोग को यह अध्ययन करने के लिए भी बढ़ाया गया है कि ऊतक और अंग स्वस्थ और रोगग्रस्त दोनों संदर्भों में कैसे कार्य करते हैं 1,3। निलंबन कोशिकाएं (उदाहरण के लिए, रक्त कोशिकाएं) पेट्री डिश या फ्लास्क में मूल रूप से और परस्पर विकसित होती हैं क्योंकि वे विवो में तीन आयामी (3 डी) संरचनाओं में इकट्ठा नहीं होती हैं। ठोस अंगों से प्राप्त कोशिकाएं या तो दो-आयामी (2 डी) या 3 डी संस्कृति प्रणालियों में बढ़ सकती हैं। 2 डी संस्कृति में, कोशिकाओं को एक मोनोलेयर में उगाया जाता है जो एक सपाट सतह 2,4 का पालन करता है। 2 डी सेल संस्कृति प्रणालियों को घातीय विकास और तेजी से दोहरीकरण समय की विशेषता है, आमतौर पर 24 घंटे से कुछ दिनोंतक 5। 3 डी सिस्टम में कोशिकाएं जटिल सेल-सेल इंटरैक्शन मॉडलिंग ऊतक-जैसे समूहों को अधिक बारीकी से बनाने के लिए बढ़ती हैं, और उन्हें एक गतिशील संतुलन तक पहुंचने की उनकी क्षमता की विशेषता होती है जहां उनका दोहरीकरण समय 1 महीने या उससे अधिक समय तक पहुंच सकताहै।
इस पेपर में प्रस्तुत एक अभिनव पद्धति है जो घूर्णन सेल संस्कृति प्रणालियों में 3 डी गोलाकार विकसित करने के लिए है जो कम गुरुत्वाकर्षण 6 का अनुकरण करतीहै। यह 1990 के दशक में नासा द्वारा पेश की गई एक सेल संस्कृति प्रणाली का एक सरलीकृत व्युत्पन्नहै। यह दृष्टिकोण कर्तन बलों को कम करता है, जो कताई फ्लास्क जैसे मौजूदा तरीकों में होता है, और गोलाकार पुनरुत्पादनक्षमता 6 को बढ़ाता है। इसके अलावा, घूर्णन बायोरिएक्टर सक्रिय पोषक तत्व प्रसार को बढ़ाता है, जो नेक्रोटिक गठन को कम करता है जो कि हैंगिंग ड्रॉप सेल संस्कृति जैसी प्रणालियों में होता है जहां मीडिया विनिमय अव्यावहारिक है। इस तरह, कोशिकाएं ज्यादातर अबाधित रूप से बढ़ती हैं, जिससे ऊतक में बढ़ने वाली कोशिकाओं से जुड़ी संरचनात्मक और शारीरिक विशेषताओं के गठन की अनुमति मिलती है। C3A हेपेटोसाइट्स (HepG2 / C3A) इस तरह से सुसंस्कृत न केवल ultrastructural ऑर्गेनेल था, बल्कि एटीपी, adenylate kinase, यूरिया, और कोलेस्ट्रॉल की मात्रा का उत्पादन भी विवो 1,2 में देखे गए स्तरों के बराबर था। इसके अलावा, 2 डी बनाम.3D सेल संस्कृति प्रणालियों में उगाई गई कोशिकाएं विभिन्न जीन अभिव्यक्ति पैटर्न 8 प्रदर्शित करतीहैं। 3 डी गोलाकार के रूप में उगाए गए सी 3 ए हेपेटोसाइट्स के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला है कि इन कोशिकाओं ने यकृत-विशिष्ट प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला व्यक्त की, साथ ही साथ जिगर समारोह8 को विनियमित करने वाले प्रमुख मार्गों में शामिल जीन भी। पूर्व प्रकाशनों ने 3 डीगोलाकार संस्कृतियों में गतिशील संतुलन पर 2 डी संस्कृति बनाम कोशिकाओं में तेजी से बढ़ती कोशिकाओं के प्रोटिओम के बीच अंतर का प्रदर्शन किया। इन अंतरों में सेलुलर चयापचय शामिल है, जो बदले में कोशिका 5 की संरचना, कार्य और शरीर विज्ञान को प्रभावित करताहै। 2 डी संस्कृति में उगाई गई कोशिकाओं का प्रोटिओम सेल प्रतिकृति में शामिल प्रोटीन में अधिक समृद्ध था, जबकि 3 डी गोलाकार का प्रोटिओम यकृत कार्यक्षमता5 में अधिक समृद्ध था।
3 डी गोलाकार के रूप में उगाई गई कोशिकाओं की धीमी प्रतिकृति दर अधिक सटीक रूप से क्रोमैटिन राज्य और संशोधनों (जैसे हिस्टोन क्लिपिंग9) से जुड़ी विशिष्ट घटनाओं को मॉडल करती है। हिस्टोन क्लिपिंग एक अपरिवर्तनीय हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) है जो हिस्टोन एन-टर्मिनल पूंछ के हिस्से के प्रोटियोलिटिक दरार का कारण बनता है। जबकि इसका जैविक कार्य अभी भी चर्चा के तहत है 10,11,12,13, यह स्पष्ट है कि प्राथमिक कोशिकाओं और यकृत ऊतकों में इसकी उपस्थिति हेपजी 2 / सी 3 ए कोशिकाओं द्वारा मॉडलिंग की जाती है जो गोलाकार के रूप में उगाई जाती हैं, लेकिन फ्लैट कोशिकाओं के रूप में नहीं। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि क्रोमैटिन राज्य और संशोधन डीएनए रीडआउट को विनियमित करते हैं जो ज्यादातर जीन तक पहुंच को संशोधित करके और इस प्रकार उनकी अभिव्यक्ति14 है। हिस्टोन पीटीएम या तो क्रोमैटिन राज्य को सीधे न्यूक्लियोसोम के शुद्ध चार्ज को प्रभावित करके प्रभावित करते हैं जहां हिस्टोन इकट्ठा किए जाते हैं, या अप्रत्यक्ष रूप से क्रोमैटिन लेखकों, पाठकों और इरेज़र14 की भर्ती करके। सैकड़ों हिस्टोन पीटीएम की पहचान15 तारीख तक की गई है, जो इस परिकल्पना को मजबूत करती है कि क्रोमैटिन डीएनए16 की व्याख्या करने के लिए सेल द्वारा उपयोग किए जाने वाले "हिस्टोन कोड" को होस्ट करता है। हालांकि, पीटीएमसंयोजनों के असंख्य की पहचान 15, और यह खोज कि हिस्टोन पीटीएम के संयोजनों में अक्सर अलगाव में मौजूद पीटीएम से अलग-अलग जैविक कार्य होते हैं (उदाहरण के लिए फिशल, एट अल.17), इस बात पर प्रकाश डाला गया है कि "हिस्टोन कोड" को डिक्रिप्ट करने के लिए अधिक काम की आवश्यकता है।
वर्तमान में, हिस्टोन पीटीएम विश्लेषण या तो एंटीबॉडी का उपयोग करने वाली तकनीकों पर आधारित है (उदाहरण के लिए, पश्चिमी धब्बे, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, या क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिसिपिटेशन अनुक्रमण [CHIP-seq]) या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के बाद। एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों में उच्च संवेदनशीलता होती है और हिस्टोन के निशान के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन अक्सर 18,19,20 के संयोजन में मौजूद दुर्लभ पीटीएम या पीटीएम का अध्ययन करने में सीमित होते हैं। एमएस उच्च-थ्रूपुट और निष्पक्ष पहचान और एकल और सह-मौजूदा प्रोटीन संशोधनों के परिमाणीकरण के लिए अधिक उपयुक्त है, विशेष रूप से हिस्टोन प्रोटीन 18,19,20 में। इन कारणों से, इस और कई अन्य प्रयोगशालाओं ने हिस्टोन पेप्टाइड्स (बॉटम-अप एमएस), बरकरार हिस्टोन पूंछ (मध्य-डाउन एमएस), और पूर्ण लंबाई हिस्टोन प्रोटीन (टॉप-डाउन एमएस) 21,22,23 के विश्लेषण के लिए एमएस पाइपलाइन को अनुकूलित किया है।
नीचे विस्तृत HepG2 / C3A गोलाकार बढ़ने के लिए एक वर्कफ़्लो है और उन्हें नैनो-तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से हिस्टोन पेप्टाइड विश्लेषण (नीचे-ऊपर एमएस) के लिए तैयार करना, अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एनएलसी-एमएस / एमएस ) के साथ ऑनलाइन युग्मित है। एक 2 डी सेल संस्कृति विकसित की गई थी और कोशिकाओं को काटा गया था और एक बायोरिएक्टर में स्थानांतरित कर दिया गया था जहां वे गोलाकार बनाना शुरू कर देंगे (चित्रा 1)। संस्कृति में 18 दिनों के बाद, गोलाकार को सोडियम ब्यूटिरेट या सोडियम सक्सिनेट के साथ इलाज किया गया था ताकि हिस्टोन एसिटिलेशन और सक्सिनिलेशन के सापेक्ष बहुतायत को बढ़ाया जा सके। विशेष रूप से, 3 डी संस्कृतियों को जीनोटॉक्सिक यौगिकों के साथ-साथ उनके फ्लैट संस्कृति समकक्षों के साथ इलाज किया जा सकता है; वास्तव में, हाल के प्रकाशनों पर प्रकाश डाला गया है कि 3 डी संस्कृति में कोशिकाओं की विष विज्ञान प्रतिक्रिया24,25 डी फ्लैट संस्कृति में उन लोगों की तुलना में प्राथमिक ऊतकों के समान है। तब कोशिकाओं को निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था और परमाणु अलगाव किया गया था। फिर, हिस्टोन को गार्सिया एट अल.26 द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रिप्सिन पाचन से पहले और बाद में प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड के साथ निकाला और व्युत्पन्न किया गया था। यह प्रक्रिया रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी (सी18) और एमएस के साथ पता लगाने के साथ ऑनलाइन अलगाव के लिए एक उपयुक्त आकार के पेप्टाइड्स उत्पन्न करती है। अंत में, हिस्टोन पेप्टाइड्स की पहचान की गई और मात्रा निर्धारित की गई, और उत्पन्न डेटा को अधिक पूर्ण जैविक व्याख्या के लिए कई तरीकों से दर्शाया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-20 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10, 20, 200, and 1000 &#181;L single-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G syringe needle</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L multi-channel pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>Z740118 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well ultra-low attachment microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2&#160; U-shaped cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>461464U</td>
			<td>Untreated, with vent cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C (Corning)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A949-1</td>
			<td>Acetone should be used cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>10004-12</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control unit</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tablet for ClinoStar settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-205-CV</td>
			<td>1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>Mott</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model 7121000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>9&#34;, cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutagro supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>1X solution without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB resin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td>Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30&#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oro-Flex I polypropylene filter plate</td>
			<td>Orochem</td>
			<td>OF1100</td>
			<td>96-well polypropylene filter plate w/ 10 &#181;M PE frit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>0-13 pH test paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Millipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro capillary</td>
			<td>Molex</td>
			<td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td>
			<td>Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 &#181;M ID x 363 &#181;M OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240311-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.0003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#181;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>25477 (American Laboratory Trading)</td>
			<td>Nutator Mixer 1105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>20249 (American Laboratory Trading)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-375</td>
			<td>Baker Analyzed ACS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC421451000</td>
			<td>Resuspend 100% w/v in HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI28904</td>
			<td>Sequencing grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold 96-well</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

स्तनधारी कोशिकाओं की फ्लैट संस्कृतियां सेल फिजियोलॉजी को समझने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली इन विट्रो दृष्टिकोण हैं, लेकिन यह प्रणाली अप्राकृतिक रूप से तेजी से सेल प्रतिकृति के कारण ठोस ऊतकों को मॉडलिंग में सीमित है। परिपक्व क्रोमैटिन मॉडलिंग करते समय यह विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होता है, क्योंकि तेजी से प्रतिकृति कोशिकाएं अक्सर डीएनए प्रतिकृति में शामिल होती हैं और एक विषम पॉलीप्लॉइड आबादी होती हैं। नीचे प्रस्तुत मॉडलिंग, उपचार, और एक तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर quiescent क्रोमैटिन संशोधनों का विश्लेषण करने के लिए एक वर्कफ़्लो है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइनों को एक इनक्यूबेटर में पुनरुत्पादक 3 डी गोलाकार के रूप में उगाया जाता है जो सक्रिय पोषक तत्व प्रसार और कम कर्तन बल प्रदान करता है। सोडियम ब्यूटिरेट और सोडियम सक्सिनेट के साथ उपचार ने क्रमशः हिस्टोन एसिटिलेशन और सक्सिनिलेशन में वृद्धि को प्रेरित किया। हिस्टोन एसिटिलेशन और सक्सिनिलेशन के स्तर में वृद्धि एक अधिक खुले क्रोमैटिन राज्य से जुड़ी हुई है। गोलाकार तब कोशिका नाभिक के अलगाव के लिए एकत्र किए जाते हैं, जिसमें से हिस्टोन प्रोटीन को उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के विश्लेषण के लिए निकाला जाता है। हिस्टोन विश्लेषण तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से किया जाता है जो अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ ऑनलाइन युग्मित होता है, इसके बाद एक इन-हाउस कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन होती है। अंत में, संयुक्त हिस्टोन चिह्नों की आवृत्ति और घटना की जांच करने के लिए डेटा प्रतिनिधित्व के उदाहरण दिखाए गए हैं।

इस प्रोटोकॉल में, HepG2 / C3A गोलाकार को 20 mM NaBut और 10 mM NaSuc के साथ इलाज किया गया था, जिनमें से दोनों हिस्टोन पीटीएम (चित्रा 3 ए) के वैश्विक स्तर को प्रभावित करते थे। हिस्टोन पीटीएम को तब एमएस / एमएस अधिग्रहण (<...

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Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

यह प्रोटोकॉल रेखांकित करता है कि कैसे एक त्रि-आयामी सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग निकट-शारीरिक स्थिति में क्रोमैटिन संशोधनों को मॉडल, इलाज और विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

हेपेटिक ऊतक के 3 डी सेल संस्कृति मॉडल में हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का वैश्विक स्तर का परिमाणीकरण

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

वैश्विक क्रोमैटिन गतिशीलता को कई रोग राज्यों का एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ दिखाया गया है, जैसे कि कैंसर और उम्र बढ़ने। हमारा प्रोटोकॉल इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल प्रदान करता है। हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों या पीटीएमएस का मानक प्रयोगशाला विश्लेषण आमतौर पर एंटीबॉडी-आधारित एसेस का उपयोग करके एक समय में एक ही पीटीएम के लिए जांच करने तक सीमित है।हिस्टोन पीटीएमएस का तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण हमें एक ही प्रयोग में सैकड़ों पीटीएमएस की बहुतायत को मापने की अनुमति देता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन स्टेफ़नी Stransky, रोनाल्ड कटलर, और जूली किम, एक postdoc, स्नातक छात्र, और अनुसंधान तकनीक, क्रमशः, प्रयोगशाला से होगा. सबसे पहले, मानक विकास मीडिया का उपयोग करके, कोशिकाओं को मोनोलेयर के रूप में विकसित करें जब तक कि वे 80% confluent न हों।फिर HBSS के साथ कोशिकाओं को धो लें। HBSS में पतला 0.05% ट्रिप्सिन-EDTA के पांच milliliters जोड़ें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।सेल टुकड़ी की जांच करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। कोशिकाओं की गिनती करने के बाद, ताजा विकास मीडिया के साथ सेल निलंबन को पतला करें। प्रत्येक में कई माइक्रो-कुओं के साथ एक अल्ट्रा कम अनुलग्नक 24-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट को संतुलित करने के लिए विकास मीडिया के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।फिर प्लेट की सतह से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 3000 x g पर प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें। अब पहले से बनाए गए सेल निलंबन को 24-अच्छी तरह से प्लेट और सेंट्रीफ्यूज में 120 x g पर तीन मिनट के लिए स्थानांतरित करें। 24-अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं की जांच करें और फिर गोलाकार गठन के लिए 24 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।इस बीच, बायोरिएक्टर को संतुलित करने के लिए, आर्द्रता कक्ष में बाँझ पानी के 25 मिलीलीटर और सेल चैंबर में विकास मीडिया के नौ मिलीलीटर जोड़ें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एक घूर्णन clinostat इनक्यूबेटर में बायोरिएक्टर को इनक्यूबेट करें। अल्ट्रा कम अनुलग्नक 24-अच्छी तरह से प्लेट से गोलाकार को अलग करें, धीरे-धीरे एक मिलीलीटर चौड़े बोर युक्तियों का उपयोग करके पिपेटिंग करके, और उन्हें एक ऊतक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें।पर्याप्त रूप से गोलाकार रूपों का चयन करने के लिए, एक माइक्रोस्कोप के तहत गोलाकार की गुणवत्ता की जांच करें। अच्छी गुणवत्ता वाले गोलाकार में एक समान आकार, कॉम्पैक्टनेस और गोलाई होती है। ताजा विकास मीडिया के पांच मिलीलीटर के साथ संतुलित बायोरिएक्टर भरें, और इसमें गोलाकार को स्थानांतरित करें।फिर बायोरिएक्टर को पूरी तरह से ताजा विकास मीडिया के साथ भरें और बायोरिएक्टर को 10 से 11 आरपीएम पर क्लिनोस्टेट इनक्यूबेटर में रखें। हर दो से तीन दिनों में, ताजा मीडिया के साथ पुराने मीडिया के 10 मिलीलीटर को बदलकर विकास मीडिया का आदान-प्रदान करें। जैसा कि यह गोलाकार आकार और संख्या में वृद्धि करता है, इनक्यूबेटर की रोटेशन गति को बढ़ाता है।गोलाकार गोली प्राप्त करने के बाद, गोली को बाधित करने और हिस्टोन को छोड़ने के लिए गोली और पिपेट को ऊपर और नीचे पिपेट में ठंडे 0.2 दाढ़ सल्फ्यूरिक एसिड के पांच संस्करणों को जोड़ें। एक बार जब सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद supernatant प्राप्त किया जाता है, तो ठंडा केंद्रित ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड जोड़ें, जैसे कि अंतिम एकाग्रता मात्रा के अनुसार 25 से 30% मात्रा बन जाती है। और इसे ट्यूब को कुछ बार उलटकर और पांडुलिपि में वर्णित सेंट्रीफ्यूज द्वारा मिलाएं।Supernatant को त्यागने के बाद, एक ग्लास चरागाह पिपेट का उपयोग करके, गोली और ट्यूब की दीवारों को ठंडे एसीटोन और 0.1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के लगभग 500 माइक्रोलीटर के साथ धोएं, और फिर चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 3, 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर supernatant को छोड़ने के लिए ट्यूब फ्लिप। एक ग्लास चरागाह पिपेट का उपयोग करते हुए, गोली और सेंट्रीफ्यूज को धोने के लिए 100% ठंडे एसीटोन के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें जैसा कि पहले दिखाया गया था।supernatant को त्यागने के बाद, पूरी तरह से pipetting ध्यान से acetone निकालें, और नमूने के बारे में 20 मिनट के लिए एक खुले ढक्कन के साथ सूखने दें। पीएच 8 के 100 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट में एसिटोनिट्राइल के 15 से 20% के 20 माइक्रोलीटर में छर्रे को फिर से निलंबित कर दिया। भंवर के बाद, 30 सेकंड के लिए 1000 x g पर निलंबन को नीचे स्पिन करें।आठ या अधिक नमूनों के लिए, प्रत्येक को 96-अच्छी तरह से प्लेट में निलंबित नमूने को स्थानांतरित करें। फिर, एक हुड में, प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड के दो माइक्रोलीटर जोड़ें और पांच बार पिपेटिंग करके मिलाएं। अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 10 माइक्रोलीटर जल्दी से जोड़ें और पांच बार पिपेटिंग करके मिलाएं।एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर HLB राल मिश्रण. फिर 96-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट पर 96-अच्छी तरह से फ़िल्टर प्लेट के प्रत्येक कुएं में एचएलबी निलंबन के 70 माइक्रोलीटर जोड़ें। के माध्यम से प्रवाह को त्यागने के बाद, राल को 0.1% ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड के 100 माइक्रोलीटर के साथ धोएं।0.1% ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड के 100 माइक्रोलीटर में प्रत्येक नमूने को फिर से निलंबित करने के बाद, प्रत्येक नमूने को प्रत्येक अच्छी तरह से लोड करें और वैक्यूम का उपयोग करके स्प्लैशिंग को रोकें। के माध्यम से प्रवाह को त्यागने के बाद, 0.1% ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड के 100 माइक्रोलीटर के साथ नमूनों को धोएं, और फ़िल्टर प्लेट को एक नई संग्रह प्लेट पर रखें। इसके बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से 0.1% ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड में 60% एसिटोनिट्राइल के 60 माइक्रोलीटर जोड़ें और वैक्यूम का उपयोग करके स्प्लैशिंग को रोकें।के माध्यम से प्रवाह ले लीजिए और एक गति वैक्यूम में सूखी. HPLC में सूखे संग्रह प्लेट लोड करें और पांडुलिपि में वर्णित के रूप में LC / MS / MS विधि चलाएँ। इस अध्ययन में, सामान्य हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की सापेक्ष बहुतायत को सी 3 ए हेपेटोसाइट्स में तीन आयामी गोलाकार के रूप में उगाया गया था।हिस्टोन प्रोटीन से उत्पन्न पेप्टाइड्स में एकल अवशेषों पर पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को भी देखा जा सकता है। सोडियम ब्यूटिरेट के साथ गोलाकार के उपचार ने हिस्टोन एसिटिलेशन की सापेक्ष बहुतायत में वृद्धि की, जबकि सोडियम सक्सिनेट के साथ हिस्टोन अवशेषों को बढ़ाया। इस विधि ने सोडियम ब्यूटिरेट उपचार के बाद हिस्टोन एसिटिलेशन के वितरण पैटर्न और सोडियम सक्सिनेट के साथ उपचार के बाद हिस्टोन सक्सिनिलेशन के वितरण पैटर्न का भी प्रदर्शन किया।परिणाम ने विभिन्न हिस्टोन संशोधनों के सामान्य पैटर्न भी दिखाए। सोडियम ब्यूटिरेट उपचार ने हिस्टोन प्रोटीन एच 3 से उत्पन्न पेप्टाइड पर लाइसिन अवशेष14 के एसिटिलेशन को काफी बढ़ाया, केवल तभी जब इसके नौवें लाइसिन अवशेषों में दो मिथाइल समूह थे, लेकिन एक या तीन मिथाइल समूह नहीं थे। व्यक्तिगत संशोधनों की सापेक्ष बहुतायत और एच 3-व्युत्पन्न पेप्टाइड में पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के विभिन्न संयोजनों की भी गणना की गई थी।सोडियम ब्यूटिरेट उपचार के बाद पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के संयुक्त पैटर्न भी हिस्टोन प्रोटीन एच 4 से उत्पन्न पेप्टाइड में देखे गए थे। यहां भी, सोडियम ब्यूटिरेट उपचार के परिणामस्वरूप एसिटिलेशन में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई। महत्वपूर्ण ध्यान के रूप में संभव के रूप में कम के रूप में बेंच पर गोलाकार रखने पर रखा जाना चाहिए और नमूना spilling से बचने के लिए एक desalting कदम में. इस वर्कफ़्लो का उपयोग तेजी से फ्लैट सेल संस्कृतियों की तुलना में अधिक शारीरिक मॉडल का उपयोग करके ठोस ऊतकों में क्रोमैटिन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

ऊतक इंजीनियरिंग और सेल संस्कृति के लिए रेशेदार पॉलिमर scaffolds Electrospinning

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

पोस्ट translational संशोधन की एलिसा द्वारा मूल निवासी बरकरार Nucleosomes पर जांच

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

संयंत्र पत्तियां में histone संशोधन की जांच

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

अलगाव और चूहा यकृत कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

समारोह का अध्ययन है, सहभागिता, और बाद translational संशोधनों के लिए नवोदित खमीर प्रोटीन निष्कर्षण और शोधन

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

संयंत्र प्रोटीन परिसरों के बाद translational संशोधनों की पहचान

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia निम्नलिखित एकल कोशिका के स्तर पर ग्लोबल शाही सेना संश्लेषण का विश्लेषण

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

में क्रिस्टलीय सेलूलोज़ संचय के उच्च संकल्प मात्रा<em&gt; Arabidopsis</em&gt; जड़ें ऊतक विशेष सेल की दीवार संशोधनों नजर रखने के लिए

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Histone बाद translational संशोधनों के विश्लेषण के लिए पूरा कार्यप्रवाह नीचे अप मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग: Histone निकासी से डेटा विश्लेषण करने के लिए

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

एस्ट्रोजन का उत्पादन प्राथमिक गोजातीय Granulosa कोशिकाओं के एक ऊतक संस्कृति मॉडल

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...